Способ получения водорастворимого коньюгата С @ , Z @ -зависимой пероксид-дисмутазы Советский патент 1992 года по МПК C12N9/96 

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения конъюгатов или аддуктов пероксид-дисмутазы (ПОД), в которых по крайней мере часть аминогрупп, карбоксильных или сульфгидрильных групп соединена с полиалкиленгликолем (ПАГ), например, полиэтиленгликолем (ПЭГ) или полиэтилен-полипропилен-гликолевым сополимером, где молекулярная масса ПАГ больше 20000 и желательно, чтобы средняя молекулярная масса ПАГ составляла 40000-1000000 дальтон. Указанные для ПАГ молекулярные веса определены эксклюзи- онной высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖК) с. использованием ПЭГ в качестве эталона. Предпочтение отдается ПАГ со средней молекулярной массой большее 40000, но не более чем 200000. В частности предпочитается средняя молекулярная масса ПАГ 50000-150000. Подобные ПАГ могут быть неразветвленными или разветвленными и незамещенными

или замещенными Ci-4-алкильной группой. Особо ценными молекулами ПАГ, предотвращающими связь с двумя молекулами ПОД, являются молекулы ПАГ, в которых одна из концевых групп является такой Ci-4- алкилэфирной группой, как изопропоксиг- руппа.

Использовали ПЭГ или метокси-ПЭГ с низкой молекулярной массой - обычно ок. 5000 и меньше, присоединенные к перок- сид-дисмутазе (ПОД) и другим белкам для того, чтобы получить аддукты с разной степенью (а) повышенной живучести в сыворотке и (б) пониженной иммуногенности. Однако степень модификации протеиновых групп с низкомолекулярным ПЭГ или метокси-ПЭГ, необходимых для достижения целей (а) и (б), часто вызывает значительные потери ферментативной или биологической активности белков.

Цель изобретения - пролонгирование действия целевого продукта.

ел

С

ч ч

о

Ю Ч СЛ

СА)

Пероксид-дисмутаза (ПОД) представляет собой внутриклеточный фермент, ответственный за катализ превращения радикала пероксида в кислород и перекись водорода.

Предметом настоящего изобретения является также получение коньюгата с противовоспалительной активностью, что показывает, например, обычный тест с отеком лапы, индуцированным каррагенаном. Эта активность делает продукт особенно перспективным для лечения ревматических заболеваний. Продукт проявляет большую живучесть, чем нативный ПОД-протеин ин виво и замедление дезактивации его в поч- ках. Поэтому особенно важно отметить, что предлагаемый продукт сохраняет ферментативную активность в течение длительного периода времени, проявляя низкий уровень иммуногенности.

Согласно новой концепции настоящего изобретения используют нити ПАГ с высоким молекулярным весом (свыше 20000). Используемый в настоящем изобретении ПАГ может представлять собой любой раствори- мый в воде полимер алкиленоксида, например, полиэтиленоксид, или определенные сополимеры этиленоксида и пропиленок- сида. ПАГ может быть неразветвленным или разветвленным и замещен в одной или нескольких гидроксильных группах Ct-4-ал- кокси или другой группой. Однако молекулярный вес ПАГ-полимера, используемого в получении предлагаемого коньюгата, превышает 20000 и составляет предпочтитель- но40000-200000. Использование полимеров с молекулярным весом выше 200000 тоже возможно, но им не отдается предпочтение из-за их более высокой вязкости и склонности расщепляться под воздействием сдвиго- вых усилий.

Предлагаемые аддукты ПАГ-ПОД и другие аддукты ПАГ имеют молекулярные веса в пределах от ок. 85000 до ок. 2000000 дальтон, предпочтительно от ок. 90000 до 1000000 дальтон (считая на ПЭГ-эталон с известным молекулярным весом). Далее, предлагаемые аддукты ПАГ-ПОД и другие аддукты ПАГ обычно сохраняют почти всю активность нативного протеина. (Следует отметить, что приведенные в настоящей заявке молекулярные seca основаны на ПЭГ- эталонес известным молекулярным весом. Для целей калибровки ВЭЖХ принимается, что эквивалентные молекулярные веса протеина, те. молекулярные веса, основанные на протеиновых эталонах с известным молекулярным весом, приблизительно в 5-8 раз выше).

Усовершенствование предлагаемых коныогатов по сравнению с известными продуктами заключается в том, что в результате присоединения меньшего числа нитей ПАГ исходная активная молекула подвергается менее сильной химической модификации, так что в большей степени сохраняется ее первоначальный характер. Так, за счет использования меньшего числа нитей высокомолекулярного ПАГ согласно настоящему изобретению получаемые в результате аддукты сохраняют в основном всю или почти всю активность исходной молекулы, проявляя повышенную стойкость в кровотоке. Другое преимущество предлагаемых аддуктов заключается в том, что, используя высокомолекулярный ПАГ, можно получить более крупный аддукты с той же самой степенью модификации, что и в прежних решениях. Кроме того, в определенных назначениях крупные аддукты ПАГ имеют явные преимущества. Например, предлагаемые аддукты ПЭГ-ПОД, полученные по предлагаемой методике с использованием нитей ПЭГ с молекулярным весом в пределах 40000-130000 и иллюстрирующие принцип настоящего изобретения, имеют период полураспада в сыворотке мышей ок. 36 часов и более, ч го выше, чем у известных аддуктов ПЭГ-ПОД.

Аддукты ПАГ-ПОД содержат предпочтительно 1-10, более предпочтительно 2-8 и в частности 2-6 цепей, присоединенных к молекуле протеина. Число цепей, необходимых для получения достаточной живучести в сыворотке, снижается с увеличением длины цепей.

Типичными предлагаемыми препаратами ПОД являются содержащие медь и цинк препараты ПОД, получаемые на основе соответствующею бычьего фермента и из ферментов других животных (например, овцы, лошади, свиньи, собаки, кролика, курицы) или из человеческих клеток. Доступны также препараты ПОД, содержащие ионы других металлов, например железа или марганца. Пригодным является также фермент с однородными структурами, который получен из микробных культур, в которых клонировали и зкспрессировали такие структуры. ПОД может также оказаться не идентичным со встречающимися в природе белками вследствие ненадежности процесса трансляции в таких микробных культурах ввиду того, что предлагаемые продукты имеют пониженную иммуногеиность.

Кроме того, было обнаружено, что в том случае, когда препарат ПОД содержит мик- роколичестьа белков, которые отличны от ПОД и в других случаях делают такой препарат иммунологически ненадежным для повторного парентерального введения, в данном случае предлагаемый процесс связывания с ПОД может дать довольно ценный продукт, поскольку иммуногенность загрязняющих белков значительно снижается.

Для процесса связывания можно использовать ряд традиционных реакций.

Предпочтительная реакция осуществляется путем образования реакционноспособ- ного карбоната-полуэфира - ПАГ-0-СО-Х, где X представляет собой пригодную отщепляемую группу, с использованием таких реагентов, как карбонилдиимидазол, р-нитрофенилхлорформиат или бис-М-сук- цинимидилкарбонат, Активированный ПАР - ПАГ-0-СО-Х подвергают реакции с белком в условиях, не разрушающих его ферментативную активность, что ведет главным образом к образованию уретановых связей типа

ПАГ-0-СО-МН-протеин, присоединенных через аминогруппы белка, например, Ј-МН2-группу лизина.

Так, карбонилдиимидазол можно подвергать реакции с концевыми гидроксиль- ными группами ПАГ. Реакционную массу резко охлаждают в водном растворе при нейтральном значении рН, после чего активированный ПАГ (полиалкиленгликоль-кар- бонилимидазол) выделяют путем диализа и/или методом эксклюзиснной хроматографии.

Реакцию ПАГ-0 СО-ГМСН-СН 1СН

с ПОД осуществляют в растворе с помощью избытка активированного ПАГ.

Согласно одному варианту выполнения этой реакции раствор ПОД и активированного ПАГ сушат вымораживанием. Связанные продукты целесообразно выделить эксклюзионной хроматографией. Но можно пользоваться и другими процессами очистки, в том числе ионообменной хроматографией.

Согласно другой реакции связывания полиалкиленгликоль растворяют в инертном органическом растворителе. Полученная в результате реакционная масса показывает слабощелочную реакцию и ее можно подвергать реакции с цианурхлори- дом.

Непрореагировавший цианурхлорид удаляют путем осаждения ПАГ с помощью петролейного эфира. Остаточный растворитель выпаривают с получением 2-ПАГ-6- хлор-1,3,5-триазина. Полученные в результате активированные полимеры подвергают реакции с ПОД в пригодном буфере, например растворе бората. Непрореагировавший активированный ПАГ удаляют и полученный продукт выделяют хроматографией. Таким образом получают 4-окси- 5 1.3,5-триазина, к которому в положении 2 присоединена гюлиалкиленгликолевая группа ПАГ-0-, в.то время как в положении 6 присоединена с. -аминогруппа резкцион- носпособной лизиновой группы ПОД.

0Кроме того, одну или несколько гидроксильных групп ПАГ-ОН можно перевести в карбоксильную (карбоксильные), например, путем реакции с ангидридом янтарной кислоты или с этилбромацетатом и щелочью или

5 окислением концевой группы -ОСН2СН20Н с помощью перманганата щелочного металла с образованием соединения ПАГ с простыми эфирами уксусной кислоты - ПАГ-О-СНз-СООН. Карбоксильные группы

0 затем активируют общеизвестными методами, пригодными для модификации белков, например, путем образования сложного N- оксисукцинимидного эфира путем реакции с карбодиимидом и М-оксисукцинимидом,

5 или образования ацилазида путем нитрози- рования ацилгидразида. Активированный ПАГ затем подвергают реакции с протеином в условиях, не разрушающих ферментативную активность протеина, причем

0 эта реакция через аминогруппы протеина (например, концевую NH2-rpynny и f -аминогруппы лизина) ведет преимущественно к амидным связям (ПАГ-С(0)МН-протеин). Концевую гидроксильную группу ПАГ

5 можно также перевести в аминогруппу, например, осуществляя сначала реакцию сти- онилбромидом, в результате чего образуется ПАГ-Br, а затем проводятамино- лиз с помощью избытка аммиака, в резуль0 тате чего образуется ПАГ-NH. Через амидные связи амино-ПАГ можно затем непосредственно присоединять к карбоксильным группам белка, используя такие реагенты, как водорастворимый карбодии5 мид или реактив К.Вудварда. Однако можно и перевести аминогруппу в карбоновокис- лотную группу, например, реакцией с ангидридом янтарной кислоты, которую затем активируют и подвергают реакции с белком

0 вышеописанным образом.

Концевую группу -СН20Н ПАГ можно также перевести в альдегидную группу - СН(0), например, реакцией окисления с по- 5 мощью Мп02. Альдегидную группу затем подвергают гидроалкилированию, исходя, из свободных аминогрупп белка, например, с помощью цианборгидрида, с получением связи главным образом через вторичные

аминные группы с образованием мостика ПАГ-ОСН2СН2МН-протеин.

Наряду с аминогруппами белков для связывания с ПАГ можно также использовать карбоксильные и сульфгидрильиые группы белков,

Как выше упоминалось, предпочтение следует отдать тем реакциям связывания, в течение которых отщепляются только неароматические группы, содержащие углерод, кислород, серу, азот и водород как часть мостика, связывающего ПАГ с белком.

Коныогат ПОД можно выделить из реакционного раствора предпочтительно после диализа в целях удаления посторонних ионов путем известного процесса лиофи- лизации. Если желательно или необходимо, коньюгат ПОД можно подвергать дальнейшей очистке путем ионообменной хроматографии, электрофореза и/или гель- фильтрации,

В результате традиционного метода фильтрации через микропористый фильтр в стерильные ампулы, при желании после доведения ионной силы, например, с помощью хлористого натрия и/или фосфата натрия до изотонии, получают стерильный раствор, пригодный для применения путем впрыскивания.

Предлагаемые фармацевтические составы включают предлагаемые конъюгаты ПАГ-ПОД и фармацевтически совместимый носитель.

Фармацевтический состав предпочтительно представляет собой стерильный вводимый инъекцией препарат, например стерипьный инъецируемый водный раствор. Раствор можно приготовить известными методами, используя вышеуказанные фармацевтически приемлемые носители. Кроме того, стерильный инъецируемый раствор может представлять собой раствор или взвесь в нетоксичном пригодном для парентерального введения разбавителе или растворителе.

Предлагаемые составы включают эффективную дозиметрическую единицу конъ- югата ПОД при концентрации, могущей вызвать желаемую реакцию при введении дозиметрической единицы составов приемом, соответствующим конкретному фармацевтическому носителю. Так, жидкие составы обычно содержат ок. 0,5-40 мг коньюгата бепка в каждых 0,25-10 мл, предпочтительно в каждых ок. 0,5-5 мол, за исключением раствора для внутривенной инфузии, которые могут быть более разбавленными и содержат, например, 0,5-200 мг конъюгатз белка ПОД в каждых 50-1000, предпочтительно в каждых 100-500 мл инфузионного раствора. Таблетки, капсулы и суппозитории обычно содержат 0,1-25, предпочтительно 1-10 мг конъюгата белка на дозиметрическую единицу.

Предлагаемые коныогаты ПОД наподобие известного продукта орготеина успешно можно использовать для лечения целого круга воспалительных заболеваний, включая такие заболевания, лечение которых

0 синтетическими противовоспалительными средствами ограничено вследствие токсичных побочных действий, вызываемых длительным введением подобных средств, Конкретно говоря, конъюгаты ПОД мож5 но использовать для уменьшения токсичности кислорода, повреждений после повторной перфузии, воспалительных процессов и вызванных ими осложнений, касающихся, например, мочевых путей и

0 суставов, у разных млекопитающих. Они пригодны для смягчения симптомов и структурных деформаций, связанных с посттравматическим артритом и такими ревматическими заболеваниями, как бурсит,

5 тендинит и остеоартрит.

Пример 1. 50 г ПЭГ (полиэтиленокси- да 100000 или Polyox® -продукта фирмы Union Carbide, представляющего собой изо- пропоксилированный ПЭГ с молекулярным

0 весом 100000 (по данным этикетки изготовителя), определенным измерением характеристической вязкости, и со средним молекулярным весом ок, 50000 по данным ВЭЖХ растворяли в 1 л сухого пиридина,

5 после чего добавляют 22 г ангидрида янтарной кислоты. Полученную смесь перемешивают 38 часов при 60°С. Потом в вакууме при температуре ниже 60°С удаляют растворитель, а полученный остаток

0 вновь растворяют в 500 мл воды. Раствор промывают гексаном и продукт экстрагируют 1000 мл хлороформа. Потом удаляют хлороформ в вакууме при 40°С, Полученный продукт растворяют в бензоле, Сукцинили5 рованный ПЭГ вновь два раза осаждают из бензола с помощью петролейного эфира. Водный раствор этого сукцинилированного ПЭГ подвергают фракционированию по размерам молекул для удаления низкомоле0 кулярного ПЭГ путем ультрафильтрации Ј использованием аппаратуры типа Millipore® Minitan® оснащенной отделительной мембраной с молекулярным весом 300000 (белковый стандарт). Фракционированный

5 продукт высушивают в вакууме. Последующий анализ с помощью водной эксклюзион- ной ВЭЖХ показывает повышение среднего молекулярного веса сукцинилированного ПЭГ от ок. 50000 до ок. 80000, что является результатом ультрафильтрации, Фракционированный по размерам молекул сукцини- лированный ПЭГ активируют с помощью М-оксисукцинимида. 12 г сукцинилирован- иого ПЭГ с молекулярным весом 80000 (0,15 ммоль) растворяют в 120 мл сухого ДМФ, после чего с перемешиванием добавляют 300 мг (2,6 ммоль) N-оксисукциними- да. После полного растворения добавляют 2,4 ммоль дициклогексилкарбо- диимида. Полученный раствор перемешивают в течение 30 минут при 40°С, а затем ему дают стоять в течение 5 суток при 24°С. Затем смесь фильтруют через фильтр из стекловолокна. Фильтрат выпаривают досуха в вакууме при 40°С. Остаток растворяют, слегка нагревая, в 200 мл сухого толуола. Твердый М-оксисукцимимидил-ПЭГ осаждают путем добавления 400 мл петролейного эфира. Полученный продукт собирают в вакууме на фильтре из стекловолокна и его повторно осаждают из толуола с помощью петролейного эфира и, наконец, его высушивают в вакууме. Данные ВЭЖХ показывают, что молекулярный вес аддукта в результате активации не меняется.

Раствор, содержащий 80 мг бычьего ПОД, содержащего медь и цинк. (2.46 ммоль, 4400 ед/мг, фирмы DDi Pharmaceuticals, Inc.) в 39 мл 0,1 М буферного раствора фосфата калия (рН 8,0) добавляют к раствору, содержащему 4 г (50 ммоль) сухого N-окси- сукцину|мидил-производного ПЭГ, и полученную смесь растворяют при 24°С. Данные ВЭЖХ показывают, что реакция связывания в основном завершается за 1,5 ч, что следует из исчезновения непрореагировавшей ПОД и появления пика УФ-абсор- бирующего высокомолекулярного аддукта с молекулярным весом ок. 200000.

Свободный ПЭГ, который не связывается с ПОД, отделяют от аддукта ПЭГ- ПОД путем ионообменной хроматографии. Фракции, содержащее ПЭГ-ПОД, собирают путем повышения ионной силы буфера элюи- рования (рН 9) с использованием NaCI. Фракции ПЭГ-ПОД диализуют против воды в целях удаления буферных компонентов и затем концентрируют путем высушивания вымораживанием или выпариванием в вакууме.

В качестве примера дается описание свойств характерного продукта, элюирован- ного 50 мМ NaCI. Аддукт содержит 24 мг белка ПОД и 165 мл связанного с белком ПЭГ. Содержание белка определяют биу- ретной реакцией, а содержание ПЭГ- ВЭЖХ, используя метод обнаружения показателя преломления и поправляя значение на долю показателя преломления, приходящуюся на белок. Согласно определению средний молекулярный вес связанного с белком ПЭГ составляет 72000. Этот молекулярный вес ПЭГ. высвобожденного из аддукта протеолизом. в сочетании с дан- 5 ными, показывающими, что соотношение белка ПОД (молекулярный вес 32000) и ПЭГ в аддукте составляет 24 мг с 165 мг, дает соотношение 3 нитей ПЭГ на молекулу ПОД. На основе полученного таким образом чис0 ла нитей ПЭГ на молекулу ПОД вычисляют молекулярный вес аддукта 220000 (72000 х 3 + 32000/8). Это результат согласуется с молекулярным весом, полученным ВЭЖХ.

Активность ПОД вышеуказанного ад5 дукта определяют с использованием пробы цитохрома С по методике McCord и Flrdovich (J.BIol.Chern.244.6049-6055/1969 г./). Удельная активность аддуктз ПЭГ-ПОД (ок.4317 ед./мг белка) составляет 98% ак0 тивности нативного исходного фермента (4400 ед./мг). Итак, продукт сохраняет почти полную нативную ферментативную или биологиче скую активность и в то же время удовлетворяет другим требованиям изобре5 тения.

Производное ПЭГ-ПОД, полученное как описано в настоящем примере, сравнивают с высокочистой, немодифицированной исходной ПОД для определения его потен0 циала иммунологической сенсибилизации (активности вызывать анафилактические реакции). В этих целях на мышах-самках породы Свисс Вебстер проводят испытание с сенсибилизацией и заражением для

5 проверки напряженности их иммунитета. 10 мышей иммунизируют в течение 2 недель 4-кратным подкожным введением 0,075 мг белка на дозу, а затем их подвергают повторному заражению внутривенным введе0 нием того же соединения с содержанием 0,04 мг белка с интервалом в 21 день. В группе мышей, которым вводилась немодифицированная ПОД, после пятого повторного заражения погибло пять животных и три

5 из остальных пяти показывали признаки анафилаксии, в то время как группа мышей, которым вводилась та же доза ПЭГ-ПОД, не показывала никаких признаков анафилаксии.

0 Когда в таком же испытании используют аддукт ПЭГ-ПОД, содержащий в молекуле ПОД примерно 6 нитей ПЭГ с молекулярным весом 5000, после пятого заражения погибло 2 из 10 мышей и 4 из остальных покэзы5 вали признаки анафилаксии. Из этого - вытекает, что предлагаемая ПЭГ-ПОД, содержащая 3 нити ПЭГ с молекулярным весом 72000 в молекуле ПОД менее иммуногенна, чем ПЭГ-ПОД, содержащая вдвое больше нитей ПЭГ с молекулярным весом 5000.

Пример 2. По методике, описанной в примере 1, связывают высокомолекулярные ПЭГ с бычьей ПОД, содержащей медь и цинк. В испытаниях было обнаружено, что продукты с 5 нитями ПЭГ с молекулярным весом 100000 или с 3 нитями ПЭГ с молекулярным весом 120000 менее иммуногенны, чем нативная ПОД ипи продукт, содержащий 4 нити ПЭГ с молекулярным весом 35000.

Пример 3. Аналогично методике по примеру 1 сравнивают устойчивость к сыворотке нативной ПОД и ПЭГ-ПОД с использованием взрослых мышей-самок породы Свисс Вебстер. Им вводят внутривенно 100 мкг ПОД. Регулярно отбирают пробы крови и плазму анализируют в целях установления специфической активности ПЭГ-ПОД по электрофоретическому методу, обеспечивающему отделение ПЭГ-ПОД от ПОД мышей. Один из анализированных аддуктов ПЭГ- ПОД содержит 2 нити ПЭГ с молекулярным весом ок. 65000 и другой - 4 нити ПЭГ с молекулярным весом ок. 40000. Период полуразложения нативной ПОД мышей состав- ляет 5-10 минут, в то время как период полуразложения двух указанных аддуктов ПЭГ-ПОД превышает 36 часов, а активность ПЭГ-ПОД в крови этих животных обнаруживается не менее чем в течение 9 дней. Другой препарат, содержащий в среднем 2,6 нити с молекулярным весом ок. 45000, показывает период полуразложения свыше 36 часов.

Пример 4. Водный раствор ПЭГ (фирмы Union Carbide) с молекулярным весом согласно этикетке 100000 (средний вес, определенный по характеристической вязкости), но имеющий средний молекулярный вес ок. 50000 согласно измерению по ВЭЖХ, подвергают фракционированию по размерам молекул путем ультрафильтрации с использованием аппаратуры типа Millipor Minitan, оснащенной отделительной мембраной с молекулярным весом 300000 (белко- вый стандарт). Фракционированный продукт высушивают в вакууме. Последующий анализ с помощью ВЭЖХ показывает повышение среднего молекулярного веса пробы от 50000 до 100000, что является результатом ультрафильтрации. К раствору 3,77 г фракционированного таким образом ПЭГ в 100 мл сухого ацетонитрила добавляют 1,39 г хлорангидрида циануро- вой кислоты в 2,8 мл сухого ацетонитрила. Раствору дают стоять в течение 3 суток при 24°С. после чего его разбавляют одинаковым объемом ацетонитрила и осветляют фильтрацией. Растворитель упаривают под . вакуумом при 30°С, а остаток вновь растворяют в 120 мл сухого толуола. Продукт осаждают добавлением 360 мл сухого гексана. Продукт еще раз осаждают из толуола, применяя пегролейный эфир, и затем высушивают в вакууме, в результате чего получают ПЭГ, активированный хлорангид- ридом циануровой кислоты. Данные эксклюзивной ВЭЖХ показывают, что молекулярный вес ПЭГ в результате активации не меняется.

Разные количества активированного вышеописанным образом ПЭГ испытывают в целях определения их способности соединяться с бычьей ПОД, содержащей медь и цинк и наличествующей в постоянном количестве 1 мг/мл. Конечные концентрации ПЭГ составляют 5-100 мг/мл. По истечении реакционного периода в 24 часа при 24°С смеси анализируют с помощью ВЭЖХ и УФ- облучения для выявления количеств образованной ПЭГ-ПОД и остаточной ПОД.

Как показывают данные таблицы, при весовом соотношении ПЭГ с ПОД 50:1 (молярное соотношение 16,6:1) 90% ПОД превращается в ПЭГ-ПОД со средним молекулярным весом 150000. При более высоких соотношениях ПЭГ с ПОД повышаются количества ПОД, превратившейся в ПЭГ-ПОД, и молекулярный вес аддукта. Полученные размеры аддуктов показывают, что в этих условиях при использовании циануровой кислоты в качестве связующего вещества до двух нитей ПЭГ с молекулярным весом 100000 могут быть присоединены к ПОД.

Живучесть продуктов в сыворотке мышей измеряют для продуктов ПЭГ-ПОД в весовом соотношении 10:1 и для реакции ПЭГ с ПОД в весовом соотношении 75:1, приведенных в таблице, Для измерения используют те же методы, что и в примере 3. Периоды полуразложения для обоих испытанных продуктов составляют не менее 36 часов.

Пример 5. Юг полиэтиленгликоля с молекулярным весом 100 КД (ПЭГ 100 КД фирмы Union Carbide) сушат вымораживанием в течение суток для удаления влаги из пробы. Высушенный ПЭГ 100 КД растворяют примерно в 45 мл сухого ацетонитрила. Потом добавляют 5,12 г 1,1-карбонилдиими- дэзола, после чего полученную реакционную массу выдерживают при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Затем ее резко охлаждают в деионизованной воде в целях разрушения избыточного карбоиил- диимидазола.

Поддерживают значение рН 7 для предупреждения гидролиза активированного ПЭГ. Потом смесь диализуют в течение суток при 4°С против 4 л дистиллированной воды, сменяя воду минимум 10 раз, для удаления ацетонитрила и ммидазолэ. После диализа активированный ПЭГ хроматогра- фируют на колонке типа Sephacryl S-400 в деионизированной воде для отделения активированного ПЭГ 100 К от низкомолекулярных фрагментов.

К полученному активированному ПЭГ добавляют ПОД в количестве, достаточном для получения молярного соотношения 3 молей ПЭГ на моль ПОД. В этих целях к смеси (объем 108 мл) добавляют 92,8 мг ПОД. Затем полученную смесь для получения желаемого продукта ПЭГ-0-СО-ПОД 4 раза сушат вымораживанием.

Пример 6. К раствору 30 г полиэти- ленгликоля в 1100 мл сухого диоксана при 35°С в азотистой атмосфере с перемешиванием медленно добавляют 10 г гидрида натрия. После перемешивания в течение еще одного часа при 25°С добавляют 15 мл этил- бромацетата. Раствор перемешивают при 25°С в течение 30 минут, а затем в течение 2 часов при 45°С, после чего реакцию завершают путем добавления 200 мл воды. Затем с перемешиванием добавляют 400 мл петролейного эфира. Потом выбрасывают органическую фазу и вязкую водную фазу промывают петролейным эфиром. Водную фазу, содержащую этиловый эфир ПЭГ, разбавляют до объема ок. 1 л и омыляют путем повышения температуры до 60- 70°С в течение 5 часов. Наконец карбоксильные группы ПЭГ превращают в свободную кислоту путем подкисления до значения рН 2. Оставшуюся бромуксусную кислоту удаляют путем диализа или гель- фильтрации. Полученный таким образом простой эфир ПЭГ можно использовать вместо сукцинилированного ПЭГ, используемого в примере 1.

Итак, используя 9,4 г активированного ПЭГ с молекулярным весом 40000 и 7,9 мг бычьей ПОД, получают аддукт, содержащий в среднем 3,3 нити ПЭГ на молекулу ПОД. Молекулярный вес продукта, определенный методом ВЭЖХ, составляет ок. 140000. Этот аддукт проявляет значительно сокращенную иммуногенность в мышах.

Используя 6,5 г полиэтиленгликоля с молекулярным весом 120000 и 87 г бычьей ПОД, получают аддукт с молекулярным весом ок. 245000, определенным методом ВЭЖХ.

Пример 7. Повторяют вышеописанный процесс с помощью человеческой ПОД. В этих целях 20 мл проб активированного, сукцинилированного ПЭГ помещают в стеклянные трубки. Затем добавляют 100 мкл

раствора 3 мг/мл человеческой ПОД в 0,2- молярном фоофат-боратном буфере. После перемешивания отбирают пробы каждой реакционной массы (по 2 мкл) и резко охлаж- 5 дают в 58 мкл 0,01-молярного буфера, содержащего ацетат натрия и уксусной кислоту в соотношении 1:1, в микротрубке емкостью 250 мкл. Для наблюдения за ходом реакции пробы реакционной массы

0 подвергают электрофорезу при рН 8,5 и напряжении 250 В в течение 15 минут с последующим окрашиванием тетразолиевым синим.

Через 3-3,5 ч при комнатной температу5 ре растворы резко охлаждают 45 мкл 0,03- молярного ацетатного буфера (1:1) на мг ПЭГ. Добавлением 0,1 мл реакционного буфера со значением рН 8 и 0,9 мл (30 ммоль) ацетата значение рН доводят до 6,4. После

0 падения значения рН путем разбавления в соотношении 1:10 прекращают дальнейшее связывание ПЭГ с ПОД и гидролиз продукта. Через 30-45 минут реакция заканчивается.

5Продукт ПЭГ-ПОД с нитями ПЭГ с молекулярным весом 19000 Д наподобие свободной ПОД через 1 день после впрыскивания уже нельзя было обнаружить в сыворотке мышей, в то время как нити ПЭГ с

0 молекулярным весом 30000 Д дают продленную живучесть продукта. Итак, человеческую ПОД можно использовать для предлагаемых целей.

Пример 8. Для установления проги5 вовоспалительной активности проводят испытание огека лапок мышей, индуцированного каррагенаном. В этих целях 0,03 мл 1,0% каррагенана Б физиологическом растворе подкожно впрыскивают в правую за0 днюю лапку мышей-самок породы Свисс Вебстер. Через 30 минут животным подкожно вводят 100 мкл испытуемого соединения, полученного путем разбавления физиологическим раствором с последующей стерили5 зацией фильтра. Через сутки после впрыскивания каррагенана умерщвляют мышей, а потом ампутируют и взвешивают их задние, лапки. Вес отека вычисляют, исходя из веса правой лапы после впрыски0 вания препарата, из которого вычитают вес необработанной левой лапы. Вычисляют средние и стандартные отклонения веса отсека для каждой группы обрабатываемых мышей, включая группу контрольных мы5 шей, обработанных всего лишь физиологическим раствором.

При дозировке 30 мг на мышь аддукт с 2,6 нити ПЭГ с молекулярным весом 45000 оказывается более эффективным в уменьшении отека, чем аддукт с 3,4 нити ПЭГ с

молекулярным оесом 21000 (уменьшение на 43% и 14% соответственно), Аддукт с 3 нитями ПЭГ с молекулярным весом 120000 показывает уменьшение отека на 41% при дозировке в 10 мкг/мышь. В этом испытании нативная ПОД, содержащая медь и цинк, оказывается неактивным даже при дозировке 300 мкг/мышь, что наблюдается и при дозировке ЮОмкгнамышьаддук- та с 14 нитями ПЭГ с молекулярным весом 5000.

Пример 9. Для установления антигенное™ пользуются иммуноиспытанием конкурирующего связывания фермента в твердой фазе (ELISA) для измерения взаимной реакционной способности соединений ПЭГ-ПОД на основе бычьей ПОД, содержащей медь и цинк, с кроличьими антителами, направленными на высокочистую нативную бычью ПОД, содержащую медь и цинк. Предлагаемые коньюгаты требуют меньшего количества нитей ПЭГ для сокращения антигенное™, чем соединения, полученные с более короткими нитями, например, с нитями ПЭГ с молекулярным весом 5000. Например, аддукт, содержащий в среднем соответственно 2,6 нити ПЭГ с молекулярным весом 45000 и 4 нити ПЭГ с молекулярным весом 35000, показывает ан- тигенность, соответственно в три и 10 раз ниже, чем у аддукта с 6 нитями ПЭГ с молекулярным весом 5000. Антигенность аддукта с 4 нитями ПЭГ с молекулярным весом 35000 в два раза ниже антигенное™ аддукта с 14 нитями ПЭГ с молекулярным весом 5000. Среди аддуктов, полученных с числом нитей ПЭГ менее 4, аддукты с ПЭГ с молекулярным весом в пределах 100000- 120000 менее антигенны, чем аддукты с таким же числом более коротких нитей. Так,

аддукт ПОД с 2 нитями ПЭГ с молекулярным весом 120000 был в 5 раз менее антигенным, чем эддукт с 2 нитями ПЭГ с молекулярным весом 35000.

Формула изобретения

1. Способ получения водорастворимого

конъюгата Си,7п-зависимой пероксид-дис- мутазы, предусматривающий связывание фермента через аминогруппу лизина и СО- связь с кислородсодержащим полимером

алифатического ряда, имеющим концевую группу, полученную в результате модификации, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью пролонгирования действия целевого продукта, из ряда кислородсодержащих полимеров алифатического ряда используют полиэтиленгликоль или изопропоксиполиэ- тиленгликоль с мол.м. 40000-200000, одна концевая группа которого модифицирована в сложноэфирную карбоксильную, амино-,

карбоксамидо- или альдегидную группы, причем для связывания с I молекулой фер- менга берут 1-8 молекул модифицированного полиморз.

2.Способ по п. 1,отличающийся тем, .что используют модифицированный

полимер с мол.м. предпочтительно 40000150000:

3.Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что к каждой молекуле Си,2л-зависимой пероксид-дисмутазы присоединяют, предпочтительно,2-6 молекул полимера.

Использование: медицина, получение конъюгатов пероксид-дисмутазы с полиалкиленгликолем. Сущность изобретения: фермент связывают через аминогруппу лизина и СО-связь с полиэтиленгликолем или изопропоксиполиэтиленгликолем с мол.м. 40000-200000, предпочтительно 40000- 150000, одна концевая группа которого модифицирована в карбоксильную, амино-, карбоксамидо- или альдегидную группу. Для связывания одной молекулы фермента берут 1-8, предпочтительно 2-6, молекул полимера. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

Зависимость молекулярного веса аддукта от соотношения ПЭГ и ПОД