Способ приготовления питательной основы микробиологических сред Советский патент 1992 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии и касается получения питательной основы микробиологических сред.

Существует достаточно большое количество рецептур питательных сред, одйако число белковых основ и видов сырья для их получения ограничено.

Известны способы приготовления белковых основ для питательных сред путем гидролиза исходного сырья животного происхождения.

В качестве сырья применяют полноценные белковые продукты. В условиях обострившегося дефицита актуальна задача о выборе сырья для приготовления основ питательных сред и замена дорогостоящего и дефицитного пищевого сырья на менее дорогостоящее вторичное сырье.

Известен способ приготовления питательной основы для выявления и учета молочнокислых бактерий в молоке и молочных продуктах, предусматривающий гидролиз исходного сырья панкреатином в присутствии хлороформа, отличающийся тем. что с целью повышения-степени выявления молочнокислых бактерий и улучшения ростовых свойств основы, в качестве исходного сырья используют смесь подсырной снворотки, мелассы и кормового витамина Bi2, взятых в следующем соотношении, мгг %:

xj

XJ

О О

О

Подсырная сыворотка65,0-75,0

Меласса24,7-34,5

Кормовой витамин Biz0,3-0,5

а гидролиз смеси ведут до содержания аминного азота 85-100 мг% и редуцирующих Сахаров 9-10% 1,

Однако при гидролизе белка в присутствии углеводов разрушается значительное количество аминокислот, в том числе незаменимых 2.

В качестве прототипа можно считать способ приготовления питательной основы путем гидролиза отходов сывороточного производства при переработке крови - эритроцитов 3.

Способ предусматривает гидролиз сырья крепкой соляной кислотой до содержания аминного азота 495 мг%, осветление полученного гидролизата активированным углем, сгущение и сушку до содержания сухих веществ 96%. Однако использование этого способа возможно лишь на предприятиях, имеющих цеха и оборудование по переработке крови.

Применение крепкой соляной кислоты при гидролизе эритроцитов приводит к разрушению ряда аминокислот. Кроме того, в процессе осветления, полученный гидроли- зат довольно обедняется витаминами и минеральными веществами.

Цель изобретения -упрощениеспособа и расширение спектра культивируемых микроорганизмов.

Поставленная цель достигается применением в качестве сырья для приготовления питательной основы цельной крови животных и молочной сыворотки, которые содержат все необходимые для питания микроорганизмов ингредиенты: азотистые и углеродсодержащие вещества, углеводные компоненты, фосфорные соединения и витамины.

Белковые вещества крови по своему аминокислотному составу относятся к полноценным белкам.

Применение вторичного сырья мясной и молочной промышленности позволит решить ряд проблем по рациональному использованию имеющихся ресурсов пищевого сырья, внедрение в производство безотходных технологических процессов, предотвращение загрязнения окружающей среды, что имеет экологическое значение, а масштабы производства позволяют получать большое количество такого сырья.

Среди отходов молочной и мясной промышленности обращают внимание кровь и молочная сыворотка, характеристика которых представлена в табл. 1.

Кровь содержит в значительном количестве белки почти без углеводов; в то же время молочная сыворотка содержит много углеводов, особенно, дисахарид, лактозу и мало белков.

Основной состав крови постоянен, чему способствует деятельность выделительных систем организма животных, идет постоянное обогащение ее гормонами, ферментами 0 и другими биологически активными веществами.

Кровь и молочная сыворотка полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к сырью при приготовлении основ и 5 сред в производственном масштабе: высокая питательная полноценность, доступ- нбсть. низкая стоимость.

Исследования отходов мясной и молочной промышленности, в частности сыворот- 0 ки и крови животных, показали, что их окисляемость достигает 440000 мг/л и биохимическое потребление кислорода до 1580 м/л в сутки.

Такие отходы перед сбросом в канали- 5 зацию нуждаются в разведении не менее чем в 400 раз, что связано с потреблением значительного количества пресных вод.

Следовательно, остро стоит проблема утилизации указанного сырья. В то же вре- 0 мя увеличение переработки скота на мясокомбинатах приводит к значительному росту ресурсов крови.

При использовании крови животных как одного из основных компонентов питатель- 5 ной основы необходима ее стабилизация, в результате чего увеличивается количество белковых веществ за счет остающегося в ней фибриногена и эритроцитов.

Способ производства питательной ос- 0 новы осуществляется следующим образом.

Стабилизированная 10%-ным раствором лимоннокислого натрия кровь животных нагревается с 6н раствором смеси соляной и муравьиной кислот в соотноше- 5 нии 1:1 автоклавированием при температуре 121 °С, давлением 1 атм, в течение 45 мин.

В полученный гидролизат добавляют активированный уголь из расчета 20 г/л и равную часть водопроводной воды. 0 Смесь перемешивают в течение 60 мин, после чего фильтруют под вакуумом.

Фильтрат оттитровывают с помощью раствора щелочи до рН 6,5, повторно добавляют активированный уголь и снова фильт- 5 руют.

Молочная сыворотка подвергается тепловой обработке с целью коагуляции сыво- 4 роточных белков.

Оптимальный режим коагуляции сыво- роточных белков можно принять следующий: нагревание до температуры 92.5± 2,5°С; подкислениедорН 4,5±0,1. что соответствует 30-35°Т; выдержка при данной температуре 5 мин; раскисление до рН 6,25±0,25 (10-15°Т); выдержка не менее 15 мин, фильтрация.

Затем кислотный гидролизат крови смешивается с осветленной молочной сывороткой.

Приготовленную по предлагаемому способу смесь сгущают на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 20- 25% и высушивают на распылительной сушилке до остаточного содержания влаги 5-6%.

Обычно гидролиз животных белков осуществляют 6н раствором соляной кислоты. Однако применение сильных кислот способствует более глубокому распаду белков. тем самым ухудшая качество гидролизата. В связи с изложенным, для проведения гидролиза нами была опробована муравьиная кислота, которая по сравнению с соляной считается более мягкой. Но применение одной муравьиной кислоты для гидролиза крови при указанных режимах не дало должного эффекта. Отрабатывались различные соотношения соляной и муравьиной кислот: 2:1; 1:1: 1:2. Оптимальным по амин- ному азоту оказалось соотношение кислот 1:1. При проведении кислотного гидролиза немаловажным фактором является гидромодуль. Оптимальным принят гидромодуль

, так как при более низких концентрациях

кислоты получаются гидролизаты, не поддающиеся фильтрации.

Последующие операции осуществляются с целью обесцвечивания гидролизата и частичного удаления кислот адсорбцией древесным углем.

При проведении исследований выяснилось, что основным условием фильтрования полученных гидролизатов является 2-х кратное разведение их водопроводной водой. Затем вносят активированный уголь.

Недостаток витаминов и минеральных веществ, удаленных из гидролизата вследствие его очистки активированным углем будет восполнен при внесении 10-12% осветленной молочной сыворотки, которая по набору и абсолютному содержанию витаминов является биологически полноценным продуктом. Количество отдельных еитами- нов в сыворотке несколько выше, чем в молоке в результате молочнокислого процесса.

При коагуляции белка под действием температуры и изменений рН в сыворотке осуществляется некоторый распад углевода -лактозы. Таким образом, питательная основа в своем составе содержит как дисаха- рид, так и моносахарид, и, следовательно, ее можно использовать при выращивании различных групп микроорганизмов.

Кроме того, добавление 10-12% освет0 ленной сыворотки в питательной основе является оптимальным, поскольку общее содержание углеводов будет в пределах 0,45-0,53% что вполне обеспечивает энер- гетический обмен микроорганизмов.

5 Полученные питательные основы с 8- 9% и 13-14% молочной сыворотки при испытании в средах показали несколько меньший рост микроорганизмов, напри0 мер, стафилококков.

Полученная основа является достаточно полноценной. Содержание аминного азота 620-800 мг%, общего азота 1000-1200 мг%. Степень расщепления белка 0,63±0,1.

5 На полученной основе можно готовить общепринятые питательные среды для выращивания широкого спектра микроорганизмов. В питательную основу добавляют агар-агар микробиологический 2-5%, дру0 гие компоненты в зависимости от питательных потребностей микроорганизмов и автоклавируют при 121°С в течение 15 мин. Питательные среды с использованием предлагаемой основы не уступают обще5 принятым по биологическим показателям, что показано в таблице.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что состав основы отличается от известных питатель0 ных сред в результате использования нового совмещенного компонентного состава сырья мясной и молочной промышленности, полученного в результате гидролиза белковых молекул крови и последующего

5 обогащения ее витаминным и углеводным составом молочной сыворотки, что соответствует критерию новизна.

Существенными признаками изобретения являются;

0 1) Использование в качестве исходного сырья цельной крови животных вместо эритроцитов крови лошади по прототипу. Это упрощает способ (нет необходимости выделять эритроциты и вести длительный

5 гидролиз при высокой температуре), обогащает основу (за счет использования белка плазмы крови), дает возможность расширить границы определения различных . групп микроорганизмов (на основе по прототипу растут только патогенные микроорганизмы, в то время как на предлагаемой

основе, кроме патогенных, растут молочнокислые и др. микроорганизмы), экономит энергию и материалы (за счет сокращения длительности гидролиза, более низкой температуры и меньшего расхода кислоты);

2)Проведение кислотного гидролиза б н раствором смеси соляной и муравьиной кислот в соотношении 1:1, вместо 0,66 н соляной кислоты (что обеспечивает менее жесткий гидролиз и сохраняет необходимые для роста различных групп микроорганизмов вещества в основе).

3)Количество вносимой кислоты: 5,3 объема кислоты на 1 объем эритроцитов по прототипу и 0,34 объема кислоты на 1 объем крови по предлагаемому способу (повышает экономичность способа).

4)Добавпение 10-12% осветленной молочной сыворотки (обогащает основу углеводами и сывороточными белками, что способствует расширению границ определения различных групп микроорганизмов).

Значения рН в предлагаемом способе в пределах 6,5-6,8 вместо 4,7-4,8 по прототипу предполагают большую возможность варьирования в зависимости от вида микроорганизмов, для которых готовится основа.

Высокая температура и длительность автоклавирования в прототипе необходимы для гидролиза эритроцитов. При более низкой температуре процесс не пойдет, в то время, как гидролиз крови идет значительно быстрее и при более низкой температуре.

В табл. 4 показана зависимость роста микроорганизмов от соотношения кислот при гидролизе основы и значения рН. Оптимальным является соотношение 1:1.

Анализ известных составов питательных сред, используемых в микробиологии показал, что для приготовления сред используется сырье мясного производства. Однако по способу обработки и химическому составу эти среды существенно отличаются от предлагаемого, что придает новые свойства средам, приготовленным на предлагаемой питательной основе. Это позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию существенные отличия. -

Осуществление заявляемого способа поясняется с помощью примеров:

Пример 1. Берут 0,5 л цельной крови животных, смешивают с 35 мл 10%-ного раствора лимоннокислого натрия. Стабилизированную кровь смешивают с 0,17 л смеси (1:1) 6 н растворов соляной и муравьиной кислот. Смесь тщательно перемешивают и автоклавируют при 121 °С и давлении 1 атмосферы в течение 45 мин. По окончании гидропиза к полученному гидролизату в количестве 0,5 л добавляется такое же количе ство водопроводной воды и 20 г активированного угля, тщательно перемешивают в течение 1 ч, после чего фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр.

Активную кислотность фильтрата доводят с помощью Юн раствора КОН до рН 6,5-6,8 и добавляют еще раз 10 г активированного угля. Смесь перемешивают и через

0 30 минут фильтруют.

Параллельно с проводимой работой подготавливают молочную сыворотку, С целью коагуляции сывороточных белков подсырную сыворотку подкисляют до рН 55 4,5, нагревают до температуры 95°С и выдерживают 5 мин, а затем фильтруют.

Полученный гидролизат крови в количестве 1 л смешивают со 100 мл осветленной молочной сыворотки.

0 Подготовленную смесь сгущают на вакуум-выпарной установке при температуре не выше 65°С до содержания сухих веществ 20-25% и высушивают на распылительной сушилке до остаточного содержания влаги

5 4-6%. Допустимая температура нагрева в процессе сушки 130°С.

Питательная основа, приготовленная по предлагаемому способу, может использоваться при приготовлении сред для выявле0 ния и учета молочнокислых бактерий, кишечной палочки, стафилококков.

Примеры 2,3,4 осуществляются по примеру 1. Данные приводятся в таблице. Изучен рост различных видов микроор5 ганизмов (молочнокислых бактерий Str. lactls, Str. dlatetllactls, Lcb. bulgaricum; ко- лиформных бактерий Е. coli; патогенных Staphilococcus aureus) на опытной питательной основе с различным процентным

0 содержанием молочной сыворотки.

Максимальный рост молочнокислых бактерий отмечен на среде, приготовленной на питательной основе с содержанием молочной сыворотки 12-13%; максимальный

5 рост патогенной микрофлоры на средах, приготовленных на питательной основе с 9-10% молочной сыворотки.

Использование заявляемого технического решения в качестве основы для пита0 тельных сред позволяет: а) увеличить границы определения различных групп микроорганизмов; б) увеличить высеваемость живых клеток микроорганизмов; в) максимально использовать вторичное сырье мяс5 ной и молочной промышленности, что имеет экологическое значение в масштабах страны.

Формула изобретения Способ приготовленмч пигл пьмой основы микробиологически I г.счючаю

щий добавление к исходному сырью хлористоводородной кислоты,автоклавирование, фильтрацию полученного гидролизата, нейтрализацию его, осветление нейтрализата с помощью активированного угля и сушку целевого продукта при температуре 150°С на входе и 75°С на выходе сушильной установки, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и расширения спектра культивируемых микроорганизмов, в качестве исходного сырья используют стабилизированную кровь животных, к которой добавляют в соотношении 1:0,34 смесь 6 н

0

растворов хлористоводородной кислоты и муравьиной кислоты, взятых в соотношении 1:1, автоклавирование проводят при 121°С в течение 45 мин, после автоклэвирования полученный гидролизат разводят водопроводной водой в соотношении 1:1 и добавляют активированный уголь, полученную смесь фильтруют, а фильтрат нейтрализуют гидроокисью калия до рН 6,5-6.8, к осветленному нейтрализату добавляют 10-12% осветленной молочной сыворотки, перед сушкой смесь сгущают до массовой доли сухих веществ 20-25%.

Использование: в области культивирования микроорганизмов, в частности для производства бактериальных сред различного назначения. Сущность способа: 0,5 л цельной крови животных стабилизируют 35 мл 10%-ным раствором лимоннокислого натрия. К 0,5 л стабилизированной крови добавляют0.17л смеси растворов хлористоводородной и муравьиной кислот, взятых в концентрации 6н и соотношении 1:1. Смесь автоклавируют при 121°С и давлении 1 атм в течение 45 мин, получают гидролизат. К гидролизату добавляют равную часть водопроводной воды и активированный уголь в количестве 20 г/л, тщательно перемешивают смесь в течение 1 ч. Смесь фильтруют под вакуумом через бумажный фильтр. Доводят рН фильтрата ЮН р-ром гидроокиси калия до значения 6,5-6,8. Вновь добавляют 10 г активированного угля, смесь перемешива- ют и через 30 мин фильтруют. В полученный фильтрат вводят 10-12% осветленной молочной сыворотки, перемешивают смесь. Смесь упаривают на вакуум-выпарной установке до содержания сухих веществ 20- 25%. Сушеную смесь высушивают при температурах: 70± 5°С на выходе и 150± 5°С на входе распылительной сушилки до остаточного содержания влаги5 ± 1 %. (Л С

Физико-химические показатели крови и молочной сыворотки

Таблица

20

Та б л и ца2

ТаблицаЗ

WSSSSASSff I ffi ЯЈ IКоличество шшрооргашзмов

}pa, $ модочнохислнх бакгвций коастлззополоаитвльных

1 стафилококков

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6