Способ производства ростовой среды с содержанием нанофильтрата творожной сыворотки, предназначенной для выращивания пробиотических культур Российский патент 2021 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 

Описание патента на изобретение RU2757137C1

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности, к способам получения ростовой среды для пробиотических (лакто- и бифидобактерий) бактерий и может быть использовано для производства лечебно-профилактических и лечебных препаратов.

В настоящее время в Российской Федерации идет активная разработка и внедрение безопасных, эффективных пробиотических препаратов при выращивании сельскохозяйственных животных и получении продукции животноводства. Пробиотики, нормализуя микрофлору кишечника животных, подавляют развитие кишечной палочки и гнилостных бактерий. Продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий благотворно влияют на секреторную деятельность желудочно-кишечного тракта, возбуждают аппетит, повышают усвояемость корма.

Важное значение имеет среда, на которой культивируют бактерии. Она должна быть достаточно бюджетной для производства, иметь низкую стоимость, включать белковые основы и специфические стимулирующие компоненты, соответствующие потребностям бактерий.

Изобретение позволяет получить питательную среду обеспечивающую накопительный рост, длительное хранение при поддержании определённой массы жизнеспособных микроорганизмов, без утраты их пробиотических свойств и не требовать особенных условий хранения.

Широко известна кукурузно-лактозная среда (КЛС) для культивирования бифидобактерий и молочнокислых бактерий (ТУ 10-02-02-789-192-95). Однако КЛС не содержит гидролизованных белковых компонентов, что не обеспечивает при культивировании длительных сроков сохранности конечного продукта. Кроме того, она обладает высокой стоимостью.

Известен способ получения среды для выращивания пробиотических микроорганизмов на основе печеночного настоя. Для его приготовления к 1000 мл дистиллированной воды добавляют пептон, хлористый натрий, глюкозу, дрожжевой экстракт и печеночный настой. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через ватно-марлевый фильтр и устанавливают рН - 6,8. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда имеет соломенный цвет с серо-белым осадком, легко разбивающимся при встряхивании (ТУ 9337-001-00668554-03 «Бифидобактерин», изготовляемый в Вологодском филиале ФГБНУ ВИЭВ). Недостатком известного способа получения ростовой среды является высокая себестоимость препарата. Использование компонентов животного происхождения при производстве биологических препаратов в ряде стран ограничено, в связи с эпизоотической ситуацией. Также в продуктах животноводства могут содержаться антибиотики, что отрицательно влияет на культивирование микроорганизмов.

Известна также питательная среда для накопления биомассы бактерий на основе молочной сыворотки (RU 2326939). Среда хотя и дает высокую скорость роста, не имеет достаточного количества питательных веществ (белков, пептидов, аминокислот) для длительной сохранности микробных клеток, что очень важно для препаратов-пробиотиков. Дополнительным эффектом высоких ростовых показателей является повышение титруемой кислотности, негативно отражающееся на органолептических свойствах продукта и сохранности микроорганизмов.

Известен способ приготовления гидролизатной среды с использованием в качестве белковой основы смеси компонентов животного и растительного происхождения (Биологически активная добавка к пище и способ ее приготовления, RU 2207019).

Известен способ предусматривающий приготовление питательной среды для производства бактериальной закваски на основе ферментативного гидролизата белкового компонента с использованием соевого молока. Недостатком данного способа – многокомпонентность, сложность и длительность приготовления, ограниченный срок хранения – заявленный периода хранения закваски 30 суток (Патент РФ №2169472, МКП А23С9/12, А61К35/74.опубликовано 27.06.2001).

Известен способ культивирования бифидобактерий на питательной среде включающей, мас. %: лактопептон (5,0-7,0), цистеин солянокислый (0,001-0,005), дрожжевой автолизат (2,0-4,0), обрат молока (основа) - остальное (RU 2326940 С1). Недостатком описанной среды является нестабильность культивирования бактерий из-за несбалансированности по минеральному составу (отсутствуют минеральные компоненты).

Известен способ культивирования бифидобактерий в питательной среде, содержащей гидролизат гороха, отвар листьев и стеблей люцерны, кукурузный экстракт, Д(-)-лактозу, натрий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат железа семиводный, цистеин и осветленную творожную сыворотку (RU 2644679).

Известен способ получения питательной среды для культивирования лактобактерий, включающей отвар капусты, глюкозу и в качестве дополнительных источников питания гидролизат крови убойных животных, дрожжевой аутолизат и молочную сыворотку (RU 2551960). Недостатком является специфичность ингредиентов (необходимость использования свежей крови животных) и сложный процесс кислотного гидролиза последней.

Известен способ получения кормового соево-кукурузного субстрата, предназначенного для выращивания пробиотических культур. Способ предусматривает использование измельченных бобов сои и зерна кукурузы для получения выварочного бульона и питательного субстрата для выращивания пробиотических культур (RU 2685886 C 1).

Наиболее близким по технической сущности, выбранным в качестве прототипа, является «Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур». Способ предусматривает получение соевого гидролизата из расчета 24 – 28 граммов сухого соевого молока на 1 л воды. Гидролиз проводится под воздействием фермента пепсина в течение 48 часов, обеспечивая полный гидролиз белков. Гидролизат подвергают фильтрации и стерилизации, с последующим добавлением пептона, глюкозы и воды в заданном соотношении компонентов с получением питательной среды. Питательную среду фильтруют, устанавливают рН в пределах 6,8 – 7,0 и стилизуют при заданных параметрах (RU 2646163 C1). Среда позволяет в течение короткого времени получить большую массу микроорганизмов. Недостатком данного способа получения является ограниченность среды по питательным компонентам. Интенсивный рост микроорганизмов приводит к быстрому истощению питательных ресурсов среды и ее закислению, что негативно сказывается на сохранении жизнеспособности пробиотических микроорганизмов. Кроме, того в жидкой питательной среде происходит быстрое осаждение микробной массы, приводящее к пространственной ограниченности, снижению контакта клеток со средой, нарушению обменных процессов.

Целью наших исследований была разработка новой питательной среды для выращивания пробиотических культур (бифидобактерий), обеспечивающей оптимальное накопление и сохранение микробной массы в жизнеспособном состоянии, простой в производстве.

Наша задача решается тем, что на стадии приготовления ростовой среды в воду, помимо соевого гидролизата и пептона, вносится нанофильтрат творожной сыворотки, содержащий лактулозу в массовой доле 70% в сухом веществе. Технология производства нанофильтрата творожной сыворотки защищена патентом RU 2617940 (владелец  ФГБОУ ВО Вологодская ГМХА) (RU)). Нанофильтрат вносится в количестве 3% от объёма подготавливаемой питательной среды. Лактулоза обладает одним из самых высоких пребиотических индексов, кроме того попадая в организм она не расщепляется в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, переходит в толстый кишечник, выполняя роль пребиотика. Продукт растительного гидролиза обеспечивает полноценный белковый состав питательной среды, а лактулоза служит источником углеводов.

Кроме того в ростовую среду вносится агар-агар в количестве, обеспечивающем его содержание в объёме подготавливаемой среды 0,2%, что обеспечивает равномерное распределение микробной массы в процессе роста по объему среды.

Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию «новизна».

Анализ патентной и научно-технической информации показал отсутствие аналогичных способов экстренной профилактики иерсиниозов животных. При анализе известных решений в области ветеринарии признаки, отличающие заявляемое решение от прототипа, не выявлены. Это позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «существенные отличия».

Пример 1. Приготовление питательной среды в оптимальных параметрах.

Сухое соевое молоко в количестве 28 г размешивают в одном литре воды подогретой до 45-50°С, постоянно помешивая до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37ºС в неё вносят фермент и помещают в термостат. Через 48 часов гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атм в течение часа. Далее готовят ростовую среду. Для ее приготовления к фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 120 мл соевого гидролизата, 30 мл нанофильтрата творожной сыворотки и 2 г агар-агара микробиологического. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН - 6,8 – 7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда готова для использования. В ростовую среду вносят посевной материал, приготовленный на чистых культурах Bifidobacterium thermophilum тп-87 из расчёта соотношения посевного материала и ростовой среды - 1:20. В серии посевов получена конечная концентрация 1,3×107 КОЕ/г. Лактулоза в оптимальной концентрации обеспечивает высокую ростовую продуктивность пробиотической культуры. Проверка жизнеспособности микробных клеток через 3 месяца показала рост до 9 разведения 1,4×109 КОЕ/г.

Пример 2. Приготовление притягательной среды с внесением увеличенного количества нанофильтрата творожной сыворотки - 50 г.

Сухое соевое молоко в количестве 28 г размешивают в одном литре воды подогретой до 45-50°С, постоянно помешивая до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37ºС в неё вносят фермент и помещают в термостат. Через 48 часов гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атм в течение часа. Далее готовят ростовую среду. Для ее приготовления к фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 120 мл соевого гидролизата, 50 мл нанофильтрата творожной сыворотки и 2 г агар-агара микробиологического. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН - 6,8 – 7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда готова для использования. В ростовую среду вносят посевной материал, приготовленный на чистых культурах Bifidobacterium thermophilum тп-87 из расчёта соотношения посевного материала и ростовой среды - 1:20. В серии посевов получена конечная концентрация 2,5×104 КОЕ/г. Лактулоза в больших количествах оказывает угнетающее действие на рост пробиотической культуры.

Пример 3. Приготовление питательной среды без внесения агар-агара микробиологического

Сухое соевое молоко в количестве 28 г размешивают в одном литре воды подогретой до 45-50°С, постоянно помешивая до получения однородной жидкости. После охлаждения смеси до 37ºС в неё вносят фермент и помещают в термостат. Через 48 часов гидролизат фильтруют и автоклавируют при 1 атм в течение часа. Далее готовят ростовую среду. Для ее приготовления к фильтрованной воды добавляют 1 г пептона, 120 мл соевого гидролизата, 30 мл нанофильтрата творожной сыворотки. Смесь нагревают до кипения. После охлаждения фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН 6,8–7,0. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм 30 минут. Среда готова для использования. В ростовую среду вносят посевной материал, приготовленный на чистых культурах Bifidobacterium thermophilum тп-87 из расчёта соотношения посевного материала и ростовой среды - 1:20. В серии посевов получена конечная концентрация 2,5×109 КОЕ/г. Проверка жизнеспособности микробных клеток через 3 месяца показала рост до 5 разведения 3,2×105 КОЕ/г. Таким образом, агаризация среды приводила к замедлению скорости накопления микробной массы, но способствовала их более длительной сохранности.

Похожие патенты RU2757137C1

название год авторы номер документа
Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур 2016
  • Воеводина Юлия Александровна
  • Макарова Вера Николаевна
  • Корюкина Марина Вениаминовна
  • Горбатов Александр Вениаминович
  • Гулюкин Михаил Иванович
RU2646163C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА БИФИДОБАКТЕРИЙ В ЖИДКОЙ ФОРМЕ 2013
  • Хамагаева Ирина Сергеевна
  • Замбалова Наталья Александровна
RU2540022C2
МОЛОЧНАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ БАКТЕРИЙ-ПРОБИОТИКОВ 2006
  • Зыкова Наталья Альгимантасовна
  • Молокеев Алексей Владимирович
  • Ильина Рома Мирославовна
  • Никулин Леонид Георгиевич
  • Куслий Александр Георгиевич
  • Мироненко Вячеслав Владимирович
  • Ясудис Галина Владимировна
  • Гусева Ирина Александровна
RU2326939C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИСЛОМОЛОЧНОГО ПРОДУКТА 1995
  • Казаков Андрей Васильевич
  • Журов Сергей Алексеевич
RU2092068C1
Способ производства постбиотического продукта (варианты) 2017
  • Казаков Андрей Васильевич
  • Казаков Павел Андреевич
  • Казаков Илья Андреевич
RU2658777C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОЧАСТИЦ СЕЛЕНА В КОЛЛОИДНОЙ ФОРМЕ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК 2018
  • Хамагаева Ирина Сергеевна
  • Кузнецова Ольга Степановна
  • Замбалова Наталья Александровна
RU2717997C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ. 2013
  • Хамагаева Ирина Сергеевна
  • Буянтуева Лариса Валерьевна
  • Замбалова Наталья Александровна
RU2541778C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМОРОЖЕННОЙ КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ ЗАКВАСКИ НА ОСНОВЕ СИМБИОЗА ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ 2008
  • Хамагаева Ирина Сергеевна
  • Митыпова Наталья Васильевна
  • Хамагаева Наталья Александровна
RU2372782C1
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ БИФИДОБАКТЕРИЙ 1994
  • Лищенко Н.Н.
RU2087532C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОГО ИЛИ СУХОГО КОНЦЕНТРАТА ИЛИ ЗАКВАСКИ БИФИДОБАКТЕРИЙ 2006
  • Байбаков Владимир Иванович
  • Молокеев Алексей Владимирович
  • Карих Татьяна Леонидовна
  • Яцентюк Раиса Михайловна
  • Никулин Леонид Георгиевич
  • Куслий Александр Георгиевич
  • Мироненко Вячеслав Владимирович
  • Ясудис Галина Владимировна
  • Гусева Ирина Александровна
RU2326940C2

Реферат патента 2021 года Способ производства ростовой среды с содержанием нанофильтрата творожной сыворотки, предназначенной для выращивания пробиотических культур

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ производства ростовой среды для выращивания культур рода Bifidobacterium, включающий использование на 1000 мл фильтрованной воды 120 мл соевого гидролизата, 1 г пептона, нанофильтрат творожной сыворотки в концентрации 3% от общего объема питательной среды и микробиологический агар-агар в концентрации 0,2% в готовой среде, обеспечивающей гелезирование среды. Изобретение обеспечивает расширение арсенала питательных сред для оптимального накопления и сохранения микробной массы бифидобактерий в жизнеспособном состоянии. 3 пр.

Формула изобретения RU 2 757 137 C1

Способ производства ростовой среды, предназначенной для выращивания культур рода Bifidobacterium, включающий использование на 1000 мл фильтрованной воды 120 мл соевого гидролизата, 1 г пептона и отличающийся от аналогов тем, что содержит нанофильтрат творожной сыворотки в концентрации 3% от общего объема питательной среды и микробиологический агар-агар в концентрации 0,2% в готовой среде, обеспечивающей гелезирование среды.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2021 года RU2757137C1

Способ приготовления питательной среды для выращивания пробиотических культур 2016
  • Воеводина Юлия Александровна
  • Макарова Вера Николаевна
  • Корюкина Марина Вениаминовна
  • Горбатов Александр Вениаминович
  • Гулюкин Михаил Иванович
RU2646163C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА БИФИДОБАКТЕРИЙ В ЖИДКОЙ ФОРМЕ 2013
  • Хамагаева Ирина Сергеевна
  • Замбалова Наталья Александровна
RU2540022C2
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ БИОМАССЫ БИФИДОБАКТЕРИЙ 1994
  • Лищенко Н.Н.
RU2087532C1
ШОХАЛОВА В.Н
и др
"Деминерализация и нейтрализация творожной сыворотки в процессе нанофильтрации".//Молочный вестник, 2016, N 1(2), I кв., с.98-104.

RU 2 757 137 C1

Авторы

Новикова Татьяна Валентиновна

Воеводина Юлия Александровна

Шестакова Светлана Викторовна

Рыжакина Татьяна Павловна

Шевчук Владимир Борисович

Фиалкова Евгения Александровна

Гнездилова Анна Ивановна

Виноградова Юлия Владимировна

Кузин Андрей Алексеевич

Даты

2021-10-11Публикация

2020-06-04Подача