Способ определения чувствительности к иммуномодуляторам Советский патент 1992 года по МПК G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, в частности к аллергологии и иммунологии, и может быть использовано в биологии.

Определение in vitro чувствительности иммунокомпетентных клеток к воздействию иммунокорректоров имеет важное значение в связи с различными эффектами их воздействия на субпопуляции иммунокомпетентных клеток, что приводит к развитию нежелательных побочных эффектов.

Известны способы оценки и отбора адаптогенных препаратов по их эффективности в эксперименте. Способ осуществляется введением экспериментальным животным изучаемых препаратов с учетом их воздействия по летательности. Однако указанный способ применим только при определении общих механизмов действия препаратов и не учитывает как индивидуальных особенностей, так и особенностей воздействия на иммунную систему.

Известен также способ автоматизированной оценки индивидуальной лекарственной чувс г-зи гельногти по свойству

лекарственных веществ повреждать мембрану эритроцитов in vitro при инкубации крови с лекарственными препаратами и оценке повреждения спектрофотометриче- ски по скорости реакции кислотного гемолиза. Способ прост в выполнении и информативен, однако не применим к исследованию иммунокомпетентных клеток, а также при тестировании препаратов, не обладающих повреждающим мембрану действием.

Известен способ прогнозирования чувствительности нейтрофилов к иммуномоду- ляторам со стимуляцией зимозаном, продигиозаном, трипсином, пептидогликэ- нами, лизоцимом, левамизолом по восстановлению нитросинего тетразолия с визуальным учетом К достоинствам способа относится быстрота испопнения. к недостаткам - отсутствие возможности определения чувствительности лимфоцитов и их субпопуляций применение токсических веществ (пиридин).

ел

G

3

ч1

°

VI 00

Известны также способы индивидуального прогнозирования эффективности лева- мизола у больных талассемией путем выделения мононуклеаров, инкубации их с левамизолом (опытная проба) или контрольным раствором и определения в пробах количества Т-лимфоцитов и их активной фракции по розеткообразованию с эритроцитами барана (Е-РОК и Еа-РОК) и фагоцитарной активности. К недостаткам способа относится отсутствие стандартизации в связи с зависимостью-от качества эритроцитов, применение разнородных методических приемов при оценке количества розеткообразующих и фагоцитирующих клеток, отсутствие оценки В-клеток.

Наиболее близким к изобретению техническим решением является способ оценки эффективности иммуномодулирующих препаратов в реакции бластной трансформации. Иммунокомпетентные клетки пациента инкубируют с иммуномодулятором или митогеном, после чего исследуют изменения проллферативной активности по включению ЗН-тимидина с автоматизированным учетом на сцинтилляционном счетчике или подсчитывают количество властных клеток под микроскопом. Метод считается достаточно информативным, К недостаткам его относятся длительность инкубации (от 72 ч при исследованиях с РИА до 96 ч при исследовании активности иммуномодуляторов, аллергенов и др.) биологически активных веществ, низкая эффективность при исследовании воздействия митогенов на очищенные субпопуляции клеток в связи с необходимостью их предварительного выделения из суспензии мононуклеаров с помощью проточной цитофлюориметрии или другими дополнительными способами с проведением всех указанных этапов в стерильных условиях.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение его точности, а также снижение побочного действия.

Указанная цель достигается тем. что в способе определения чувствительности к иммуномодуляторам производится измерение экспрессии поверхностных диффе- ренцировочных антигенов кластера CD 23, а также антигенов главного комплекса гис- тосовместимости II класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклональными антителами ИПО-3 и ИКО-1 в опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически. Моноклонапьные антитела ИПО-3 первоначально разработаны для выявления количественного содержания В-бластов человека, ИКО-1 - для определения количества нормальных и лейкозных клеток, несущих HLA- Dr антигены .

Пример. Данные клинико-иммунологического мониторинга больного N., 40 лет. При обследовании 23.05.90 содержание лейкоцитов 4,6 х 10 в 9/л; лимфоцитов 33% (1,52 х 10 в 9/л). CD3 + 37,9% (0,57 х 10 в

9/л), CD4 + 12,4% (0,19 х 10 в 9/л), CD8 + 20,8% (0,32 х 10 в 9/л), CD4 + /8 + 0,60. CD22 + 17,9% (0.27 х 10 в 9/л), HLA-Dr + 11,8% (0,18 х 10 в 9/л). У больного взята кровь из вены в количестве 5 мл, разведена в 2 раза

забуференным раствором Хэнкса (0,1 М фосфатный буфер, рН 7,4). Суспензия мононуклеаров выделена на рефрижераторной центрифуге К-80 (ГДР) в градиенте плотности фиколла(Pharmacia Diagnostics)- верографина, d - 1,076. Суспензия доведена до концентрации 1x10 клеток в мл на проточном цитоанализаторе Laborscale PSL-1- PSA-1 (Венгрия). В лунки 96-луночного планшета (Flow) внесено по 50000 клеток, из расчета 1 опытная и 1 контрольная лунки для моноклонального антитела ИПО-3 и столько же для ИКО-1. В опытные лунки внесено по 50 мкл тактивина в концентрации 2 мг/мл. Планшет инкубировали при 37°С в течение

60 мин, после этого осторожно стряхнули и внесли по 20 мкл моноклональных антител в рабочем разведении. После 45 мин инкубации при постоянном смешивании на вор- текс-миксере отцентрифугировали планшет

при ЮОд в течение 5 мин и отмыли 0,9% раствором натрия хлорида. В опытные и контрольные лунки внесли по 20 мкл меченных флюоресцеина изотиоцианатом антител к Fab-фрагментам иммуноглобулинов

мыши, инкубировали 60 мин в темноте при перемешивании. После инкубации суспензию клеток отмыли физиологическим раствором, предварительно проверенным на отсутствие флюоресценции, в лунках оставили по 20 мкл клеточной суспензии. Измерение флюоресценции проводили на однокзнальном спектрофотометре - флюо- риметре для 9б-луночных планшетов Sumal РЕ2 производства Carl Zelss (ГДР) при

длине волны возбуждения 488 нм, светофильтре фотоумножителя с максимумом трансмиссии 530 нм, в качестве стандартного образца использовали темное поле, опорных - 3 лунки, заполненных 0,9% рас5 твором натрия хлорида. Результаты получали в виде показателей для каждой пробы, коэффициенты вычисляли по формуле

f

где К - коэффициент экспрессии (чувствительности к иммуномодулятору);

А - показатель флюоресценции для лунки с иммуномодулятором.

Ь - показатель флюоресценции для кон- трольной лунки

Результаты исследования чувствительности к иммуномодуляторам: ИКО-1: К для тактивина 1,19, вилозена 0,99, ИПО-3: К для тактивина 1,05, вилозена 1,02. В соответст- вии с данными обследования (затяжное течение хронического обструктивного бронхита, сниженное относительное и абсолютное содержание CD3+, CD4+ лимфоцитов, соотношения CD4+/8+, количества клеток, экспрессирующих HLA-Dr, чувствительности субпопуляции к тактивину In vitro) принято решение о назначении курсовой терапии тактивином. После проведенной комплексной терапии с включением тактивина отмечено значительное улучшение клинического состояния. При обследовании 27.06.90 содержание лейкоцитов 5,7 х 10 в 9/л; лимфоцитов 29% (1,65 х 10 в 9/л), CD3 + 44,1 % (0.73 х 10 в 9/л), CD4 + 28,4% (0,47 х 10 в 9/л), CD8 +21,2% (0,35x10 в 9/л), CD4+/8 + 1,34, CD22 + 26,7% (0,45 х 10 в 9/л). HLA-Dr+ 22,3% (0,37 х 10 в 9/л), ИКО-1: К для тактивина 1,04, вилозена 1,03; ИПО-3: К для тактивина 1,02, вилозена 1,03. Таким образом, отмечена корреляция между данными исследования In vitro и клинической эффективностью. Отдаленные результаты терапии изучены через 6 мес. и показали удовлетворительное состояние больного и нормальные значения показателей иммунного статуса.

В табл. 1-3 представлены данные сопоставительного анализа исследования чувст- вительности к тактивину, вилозену, преднизолону. по способу-прототипу и заявляемому способу

Как видно из табл.1, отмечена корреляция экспрессии HLA-Dr антигенов (антитело ИКО-1) при исследовании суммарной флюо- ресценции клеточной суспензии при инкубации с иммуномодулятором и индекса

включения ЗН-тимидина при инкубации с РИА и тактивином. Экспрессия антигена CD23 (антитело ИПО-3) по данным суммарной флюоресценции коррелирует в меньшей степени, что связано с тем. что антиген характерен для В-иммунобластов и отражает активацию В-звена, наступающую в результате изменений Т-звена иммунитета.

Из табл.2-3 видно, что использование заявляемого способа возможно при определении чувствительности к различным модуляторам, обладающим как стимулирующим, так и ингибирующим действием на пролифе- ративную активность иммунокомпентент- ных клеток.

Указанный способ использован в Институте клинической радиологии ВНЦРМ АМН СССР при исследовании чувствительности к иммуномодуляторам (тактивин, ви- лозен) более чем у 800 больных с проявлением иммунодефицитов, подвергшихся воздействию ионизирующих и неионизирующих излучений. Отмечена положительная коррелятивная зависимость с результатами назначения в необходимых случаях иммунокорригирующей терапии (г - 0,76), что свидетельствует о полученном положительном эффекте - улучшении состояния здоровья больных.

Формула изобретения

Способ определения чувствительности к иммуномодуляторам, включающий инкубацию иммунокомпетентных клеток с испытуемым препаратом, с последующей оценкой функционального состояния клеток по регистрируемому биофизическому показателю, отличающийся тем. что, с целью повышения точности способа, его упрощения, а также снижения побочного действия, инкубацию проводят в присутствии моно- клональных антител ИКО-1 и ИПО-3. а функциональное состояние клеток оценивают по уровню флуоресценции, при этом регистрируют величину флуоресценции в пробе, не содержащей испытуемый препарат, и в пробе с препаратом и затем рассчитывают их соотношение

Таблица 1

Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к тэктивину

(концентрация 2 мг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению

флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами

ИПО-3 и ИКО-1 спектрофлюориметрически на анализаторе Sumal PE2

(Carl Zeiss, ГДР).

Использование: медицина, аллергология, иммунология. Цель: упрощение и повышение точности способа, а также снижение побочного действия. Сущность изобретения: проводят измерение экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов кластера CD 23, а также антигенов главного комплекса гистосовместимости II класса по интенсивности флюоресценции при инкубации с моноклональными антителами ИПО-3 и ИКО-1 в опытных пробах по отношению к контрольным с интегральным учетом интенсивности флюоресценции клеточной суспензии спектрофлюориметрически. 3 табл.

При расчете не включались данные по наблюдению Мо90/3456 (диагноз лимфобластный лейкоз) в связи с особенностями экспрессии антигенов мости от типа моноклональной пролиферации,

Таблица 2

Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к вилозену

(концентрация 5 мг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению

флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами

ИПО-3 и ИКО-1 спектрофлюориметрически на анализаторе Sumal PE2

(Carl Zeiss)

- острый в зависиta6n й цй 3

Сравнительный анализ результатов исследования чувствительности к предниэолону

(концентрация 3 мкг/мл) в реакции бластной трансформации и по измерению

флюоресценции клеточной суспензии с моноклональными антителами

ИПО-3 и ИКО-1 спектрофлюориметрически на анализаторе Sumal РЕ2

(Carl Zeiss)