Средство, обладающее антигерпетическим действием Советский патент 1992 года по МПК A61K37/50 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве лекарственного препарата для лечения поражений, вызываемых вирусом герпеса простого.

Из белковых препаратов, используемых для лечения герпетических инфекций, известен препарат реаферон, который представляет собой полученный генной инженерией а - интерферон человека.

Недостатком указанного препарата является его малая эффективность, что требует высоких концентраций препарата.

Целью изобретения является повышение активности действия средства, обладающего антигерпетическим действием.

Указанная цель достигается тем, что средство, обладающее антигерпетическим действием, содержащее активное вещество, содержит а -лизин-а-оксидазу и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.%:

а -лизин-а- оксидаза 0,001-0,1; наполнительостальное.

Отличительным признаком нового средства является то, что оно содержите -лизина -оксидазу (ЛО) как ингибитора вирусов группы герпеса простого, при этом лечебные свойства средства проявляются именно с использованием гелеобразного препгра- TO, способствующего усилению необходимого эффекта фермента, а также пролонгирующего его действие.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

В опытах использовали штамм Л2 вируса герпеса простого 1-типа (ВГП-1), полученный из музея Института вирусологии АМН СССР им.И.Д.Ивановского и кроликов породы шиншилла весом 1000-1100 г. Вирус размножали путем пассирования на перевиваемой клеточной линии Vero, про лс- ходящей из почек зеленой мартышки.

Высокоочищенный препарат а - ти- зин- а - оксидазы получали по следую 1ей методике.

Получение бесклеточной культуралы-юй жидкости, содержащей Л О.

Продуцент фермента Trichodei na harzianum Rifal F-180 культивировали глубинным способом в стерильных условиях на

сл С

ч

vl Ю CJ 00

питательной среде следующего состава: 5 кг пшеничных отрубей и б кг сульфата аммония на 100 л питательной среды. Культивирование вели при перемешивании и аэрации 3 куб.м/ч при 28°С в ферментере объемом 250 л в течение 5 суток (120 ч). Во время ферментации рН не поддерживали. По окончании ферментации к культураль- ной жидкости добавляли сульфат аммония до 20% насыщения и инкубировали 3-4 ч. Далее культуральную жидкость центрифугировали при 3-4 тыс. об/мин и супернагант (около 90 л) подвергали дальнейшей обработке. Содержание ЛО составляло 4-6 Е/мг супернатанта.

Получение высокоочищенного фермента ЛО.

К супернатанту, полученному, как описано выше, добавляли сухой сульфат аммония до примерно 50% насыщения и инкубировали в течение 3-4 ч. Центрифугировали при 3-4 тыс, об/мин и супернат.ант отбрасывали. Осадок промывали дважды сульфатом аммония (50% насыщения) и затем растворяли в буфере, содержащем 20 мМ трис-IHCl рН 7,2-7,6. Объем буфера составлял 1/50-1/100 объема исходной культу- ральной жидкости.

К полученному раствору (объем 1-2 л) добавляли диотомовую землю (бентонит) в количестве 49-50 г/л и перемешивали в течение 1-1,5 часа. Фильтровали смесь через воронку Бюхнера с мелким стеклянным фильтром (20-40 мкм) под слабым вакуумом.

Фильтрат наносили на колонку с DEAE- целлюлозой объемом 500-600 мл, уравновешенную 10 мМ трис-HCI буфером рН 7,2-7,6 (объем буфера для уравновешивания при- мерно5-6л). Скорость протока буфера через колонку 150-200 мл/ч. После нанесения материала колонку промывали буфером 10 мМ трис-НС ; 0,2 М NaCI. Контроль проводили по измерению оптической плотности при 280 им.

Элюцию фермента вели буфером 10 мМ трис-НС рН 7,2-7,6; 0,5 М NaCI и собирали фракции, содержащие Л О активность. В результате было получено 900 мл фермента с удельной активностью 150 Е/мг белка. Выход по активности составил 70-75%. Полученный препарат фермента диализовали при 4°С против 0,01 М Na-фосфатного буфера рН 7,2 и затем лиофильно высушивали. В результате был получен гомогенный препарат ЛО.

в/Испытания а -лизин-а-оксидазы.

Для испытания ЛО в составе мази использовались соотношения компонентов, мас.%:

а -Лизин-а -оксидаза 0,001 Наполнитель99,999

Заражение ВГП-1 кроликов приводит к развитию инфекционного процесса. Исходя

из этого, кролики являются удобным экспериментальным объектом для моделирования герпетической инфекции и испытания антивирусных препаратов.

В наших условиях моделирование ин0 фекционного процесса достигалось путем инфицирования стандартизованных повреждений роговицы и кожи кроликов.

Эксперименты проводили по следующим схемам.

5С х е м а 1. Кроликам проводили скарификацию роговицы обоих глаз (5-10 поверхностных разрезов) бифуркационной иглой. Немедленно после нанесения повреждения на левый глаз и кожи на поврежденный уча0 сток наносили 1000 тканевых цитопатиче- ских доз ВГП-1, что составляло 50% от летальной дозы. Правый глаз и поврежденную зону кожи использовали как контроль. Препарат, обладающий антигерпетиче5 ским действием, вводили ежедневно в течение 5 дней (0,42 мкг/мл). Контрольным зараженным животным вводили ежедневно по 0,5 мл физиологического раствора. Оценку действия препарата проводили по следу0 ющим параметрам: макроскопическая картина (ежедневно), иммунологический анализ отделяемого из поражений на левой стороне (через день), гистологический анализ роговицы и участка кожи, пораженных

5 вирусом (на 7-й день после заражения). В трех исследуемых группах использовали по три кролика.

Схема N1 демонстрирует достижение поставленной цели.

0Влияние препарата в виде мази изучалось на экспериментальной герпетической генитальной инфекции у морских свинок.

В работе использовали вирус герпеса простого 2 типа (ВГП-2), штамм MS, пол5 ученный из национальной коллекции вирусов США (Rockville, Man/lend,USA). Вирус поддерживали в пассажах на чувствительной культуре клеток Vero вереде RPMI-1640, содержащей 500 Е/мл бензилпенициллина.

0Биологическую активность вируса определяли титрованием в культуре клеток Vero стандартным методом. Результаты выражали в ТЦД/50/мл. Специфичность вирусного ЦПД в культуре клеток подтверждалась ме5 тодом иммунофлюоресценции с использованием противогерпетических кроличьих антител, меченых ФИТЦ.

В опытах использовали самцов морских свинок весом 300 г. Перед заражением хи- вотным давали наркоз внутримышечными

(в/м) инъекциями Кетяллара в дозе 100 мг/животное. На предварительно скарифицированную поверхность слизистой полового члена наносили 0,1 мл вирусной суспензии в дозе 100000 БОЕ/мл (ЛД/100) на одно животное. Клиническое проявление острой герпетической генитальной инфекции у морских свинок оценивали по 5-баль- ной шкале (Mayo et al, 1983).

Использование модели герпетической генитальной инфекции подтвердило терапевтический эффект препарата в указанных концентрациях ЛО и наполнителя.

П р и м е р 2. Использование препарата следующего состава, в мас.%.

В качестве наполнителя использовали гелеобразное вещество Сакап.

Полное восстановление структур глаза при введении препарата после заражения, а также полное восстановление архитекто- ники кожи в местах повреждения на 5-ые - 6-ые сутки. При введении препарата через 28 ч наблюдается также положительный эффект, хотя он несколько снижен по сравнению с введением препарата сразу после заражения.

П р и м е р 3. Использование препарата следующего состава, в мас.%.

ЛО-0,2

наполнитель-99,8.

Наблюдается полное восстановление структур глаза при введении препарата сразу после заражения, а также полное восстановление архитектоники кожи Р местах повреждения. При введении препарата че- рез 28 ч эффект несколько снижен по сравнению с введением его сразу после заражения. Увеличение дозы ЛО в препарате более 0,1% не приводит к улучшению терапевтического эффекта. Наблюдается

некоторая аллергизация, выраженная в по краснении роговицы глаза.

П р и м е р 4. Использование препарата следующего состава, мзс.%:

ЛО0,0001

Наполнитель 99,999

Наблюдается эффект улучшения структур глаза при введении препарата, хотя он слабо выражен и проявляется только на начальном этапе течения патологического процесса как при введении препарата сразу после заражения, так и через 28 ч после заражения животного. Снижение терапевтического эффекта связано с недостаточной дозой ЛО в используемом для лечения животных препарата.

В результате проведенных исследований показана высокая эффективность препарата на основе ЛО на моделях офтальмогерпеса и генитального герпеса при использовании его 1 раз в день в течение 5-7 дней после заражения животных, что выгодно отличает данный препарат от прототипа, которой применяется до 5-7 раз в день. По сравнению с прототипом дозы препарата при лечении вышеуказанных заболеваний снижены в 5 раз, что, в свою очередь, чрезвычайно существенно для предотвращения развития аллергизирующих процессов, характерных при применении различных белковых препаратов.

Формула изобретения

Средство, обладающее антигерпетическим действием, содержащее активное вещество, отличающееся тем, что, с целью повышения активности действия, оно содержит а-лизин-а -оксидазу, наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас.%:

а -Лизпн-а-оксидаза 0,001-0,1

НаполнительОстальное

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в качестве лекарственного препарата для лечения поражений, вызываемых вирусом герпеса простого. С целью повышения активности действия средства последнее содержит а-лизин-а -оксидазу и наполнитель при следующем соотношении компонентов, мас,%. а -лизин-а -оксидаза 0,001-0,1; наполнитель остальное.

Вводимые растворы

Эффект антигерпетического действия

Глаз

Кож

Кожа