ИНГИБИТОР ВИРУСА ГЕРПЕСА ПРОСТОГО I ТИПА Российский патент 1994 года по МПК C12N9/00 

Изобретение относится к медицине.

Известно вещество, используемое в качестве ингибитора герпеса - ацекловир [1].

Однако этот препарат закупается за рубежом и для ингибирования вируса его необходимо применять в относительно больших дозах.

Другие широкораспространенные наиболее эффективные противогерпетические препараты представляют собой ациклонуклеозиды типа ацекловира и флаваноиды, из которых активным в отношении ВГП-1 является лютеолин [2].

При концентрации этих препаратов 50-100 мкг/мл ингибиторный эффект, оцененный по снижению ЦПД/50 ВГП-1 на клетки, культивируемые ин витро, составляет 3,5-4 х х10².

Целью изобретения является повышение специфичности вещества и снижение цитопатического действия.

Это достигается тем, что в качестве ингибитора вируса герпеса простого типа используют фермент L-лизин-α-оксидазу.

Фермент L-лизин-α-оксидаза обладает следующими свойствами:
субстратная специфичность: подвергает необратимому окислительному дезаминированию аминокислоту L-лизин,
высокая степень субстратной специфичности по отношению к основному субстрату L-лизину,
значение константы Михаэлиcа-Км равно 1,4±0,1˙ 10^-2 мМ (субстрат L-лизин).

рН-оптимум каталитической активности равен 7, 4,
изоэлектрическая точка - Р равна 4,25,
мол.м. по данным гель-фильтрации на сефадексе - 200 и гель-электрофореза равна 114±39 кДа,
молекула фермента состоит из двух идентичных субъединиц с мол. м. 60 кДа каждая,
при 60^оС и рН 7,4 через 2 ч инкубации в плазме крови человека и трис-НСl буфере фермент сохраняет 75% и 68% активности соответственно,
ингибиторами фермента являются 4-азо-DL-лейцин и 6-диазо-5-оксинорлейцин,
в замороженном или лиофилизованном виде фермент хранится в течение года без падения ферментативной активности.

Для изучения ингибирующего действия L-лизин-α-оксидазы на экспрессию антигенов вируса герпеса простого 1 типа (ВГП-1) была использована чувствительная к репродукции вируса клеточная линия почек зеленой мартышки verо. Клетки культивировали ин витро на стандартной методике на среде РРМI, содержащей 100 ед/мл ампициллина (натриевой соли) и 10% сыворотки крупного рогатого скота. Клетки выращивали в стандартных стеклянных пробирках при 37^оС. Посевная доза составляла 5х10⁵ клеток в 1 мл культуральной среды. После образования сплошного монослоя (контроль под световым микроскопом) клетки заражали ВГП-1 из расчета 1 и 0,1 БОЕ/клетку (бляшкообразующая единица), далее культуральную среду удаляли, к монослою клеток добавляли указанные дозы вируса в 1 мл среды РРМ1 1640 и инкубировали с вирусом при 37^оС в течение 30 мин. Далее вирусосодержащую жидкость удаляли, клетки трижды промывали средой и затем добавляли культуральную среду, содержащую ЛО.

Результаты определения цитотоксичности на клетках приведены в табл.1.

Проба на цитотоксичность считалась положительной, если количество мертвых клеток в опыте превышало на 5% их количество в контроле.

Через 24 ч культуральную среду в пробирках удаляли и клетки снимали со стекла в лизирующем буфере следующего состава: 8% додуцилсульфат натрия, 30% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол в 1,25 М трис-НСl буфере рН 6,8. Лизаты прогревали при 100^оС в течение 1 мин, после чего содержащиеся в лизатах белки разделяли электрофорезом в 0,5 мм блоке 12% полиакриламидного геля в присутствии 0,1% додуцилсульфата натрия по методу Ламли. Процедуру электрофореза проводили в течение 18 ч при напряжении 50 В.

Электроперенос белков на нитроцеллюлозные мембраны с диаметром пор 0,45 мкм осуществляли при силе тока 400 мА в течение 1,5 ч. Для предотвращения неспецифической сорбции нитроцеллюлозные мембраны блокировали 0,55% твин-20 в фосфатно-солевом буфере (ФСБ-Т) в течение 1 ч, добавляли поликлональные иммуноглобулины против ВГП-1 в разведении 1 : 200 в ФСБ-Т и инкубировали в течение 18 ч. Несвязавшиеся иммуноглобулины удаляли (трехкратная промывка ФСБ-Т), инкубировали с конъюгатом пероксидаза - антивидовые иммуноглобулины в течение 1,5 ч, отмывали ФСБ-Т и затем окрашивали диаминобензидином или хлорнафтолом по стандартной методике.

Параллельно на модели перевиваемых клеток vero проводили определение задержки размножения ВГП-1 различными концентрациями L-лизин-α-оксидазы. Эффект оценивали по цитопатическому действию ВГП-1 на клетки. Титр вируса составлял 10^-7 ЦПД/50, исходная доза заражения 1 БОЕ/клетку, время инкубации 24 ч.

Результаты представлены в табл.2.

Как видно из полученных результатов, концентрация ЛО 10^-2 Е/мл (0,3 мкг/мл) вызывает снижение цитопатического действия ВГП-1 на клетки, культивируемые ин витро, примерно в 100000 раз и активно подавляет экспрессию вирусных антигенов.

Таким образом, можно сделать вывод, что высокоочищенные препараты L-лизин-α-оксидазы являются более эффективными агентами, подавляющими репродукцию ВГП-1 по сравнению с ацекловиром и лютеолином.

Использование: медицина. Сущность изобретения: применение в качестве ингибитора вируса герпеса простого I типа фермента L-лизин- α -оксидазы. Фермент подвергает необратимому окислительному дезаминированию аминокислоту L-лизин. 2 табл.

Применение L-лизин- α -оксидазы в качестве ингибитора вируса герпеса простого I типа.