Способ диагностики аутоиммунного поражения миокарда при миокардитах Советский патент 1992 года по МПК G01N33/543 

Изобретение относится к области медицины, а именно к изучению аутоиммунных заболеваний сердца.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Получают препарат белков мембран кардиомиоцитов методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Для этого 70 г сердечной мышцы на льду измельчают ножницами и гомогенизируют в 500 мл 10 мМ раствора 4-морфолинпропансульфата (МПС) С1 буфера (рН - 7,4), содержащего 10 М фенилметилсульфанилфторид, по 50 мл ножевым гомогенизатором при максимальной скорости оборотов. Все операции выделения проводят при 4°С. Гомогенат фильтруют через 2 слоя марли и центрифугируют в течение 10 мин при 3500 оборо гов в минуту (ротор Т:21)

на центрифуге Весктап L4-40. Супернатант отбирают и центрифугируют в течение 40 мин при 20000 оборотах в минуту. Осадок ресуспендируют в 150 мл 0,6 мМ раствора К1 и 10 мМ раствора МПС, а затем экстрагируют в течение 2 ч при слабом перемешивании. После этого проводят центрифугирование в течение 40 мин при 20000 оборотах в минуту. Осадок ресуспендируют в 30 мл 8%-ного раствора сахарозы и 10 мМ раствора МПС, после чего наносят супернатант на ступенчатый градиент плотности сахарозы 17%, 35% и 45%, центрифугируют в течение 2 ч при 25000 оборотах в минуту (ротор - 27у.Клеточные мембраны, флотирующие на интерфазах 17-35%, 35-45%, собирают, ресуспендируют в 10 мМ растворе МПС, после чего проводят анализ электрофорезом. Электрофорез проводят в градиенте 5-15% полиакриламидного геля. Образцы, содержащие 5-6 мг/мл белка, солюбилизируют, добавляя 1/5 часть буфера (10%-ный раствор додецил-сульфата натрия, 50 мМ раствор Трис, 0,2°/о-ный раствор бета-меркаптоэтанол). Прогревают в течение 5 мин при 95°С и центрифугируют в течение 20 мин при 20000 оборотах в минуту. После добавления 10%-ного раствора глицерина и бромфенолового синего наносят 50 мкг белка мембран кардиомиоцитов на дорожку или 2 мг в 300 мкл на пластинку 20x10 см, залитую препаративной гребенкой. Проводят электрофорез при постоянном напряжении 100 В в течение 3,5 ч.

Для получения диагностических полосок переносят белок мембран кардиомиоцитов на нитроцеллюлозу методом иммуноблоттинга при охлаждении с напряженностью электрического поля 25 В/см, силе тока 0,45 А в течение 1,5 ч на приборе TransBlot (фирма Bio-Rad) в буфере (192 мМ глицин. 25 мМ Трис НС1, 20% метанол) (рН 8,3).

Определение антител к миокарду в сыворотке крови больного осуществляют после блокирования полос нитроцеллюлозы путем инкубации при комнатной температуре в 3% растворе желатина в течение 40 минут. После этого осуществляют инкубацию этих полос с исследуемыми сыворотками крови больных в разведении 1:50-1:100, положительным контролем - сыворотками кровл больных с высоким титром искомых антител, отрицательным контролем - сыворотками крови доноров в 500 мМ растворе NaCI, 50 М Трис, 0,5% Tween-20(A), содержащем 1% желатина, в течение 2-12 ч. Проводят 3 основных отмывки буфером А по 20 мин каждая. После этого осуществляют инкубацию с меченными пероксидазой кроличьими антителами против иммуноглобулинов человека в разведении 1:400 в течение 2 ч. Проводят 3 отмывки в течение 20 мин каждая. Проявление осуществляют с хлоронафтолом до появления слабо г о окрашивания на контрольных образцах.

Если первые 2 этапа {получение белков мембран кардирмиоцитов и приготовление диагностикума) осуществляют в условиях специализированного производства, то 3 этап (собственно выявление антител к белкам мембраны кардиомиоцитов) можно проводить в любом учреждении практического здравоохранения.

Пример 1. Исследовали сыворотку крови больного с миокардитом ревматической природы, диагноз которого поставили на основании клиники, ревмотестов, а также данных инструментального обследования, включая эндомиокардиальную биопсию, В качестве положительного контроля

использовали сыворотку крови с высоким титром антител к миокарду, в качестве отрицательного - сыворотку крови донора. Результаты показали наличие антител против белка мембраны кардиомиоцитов с мол.массой 67 кД, что свидетельствует об аутоиммунной природе поражения миокарда.

П р и м е р 2. Исследовали сыворотку

крови больного миокардитом типа Фидлера, Диагноз заболевания поставили на основании клинического течения, данных лабораторного и инструментального обследования, включая эндомиокардиальную биопсию. В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови с высокими титрами искомых антител к миокарду, отрицательного - сыворотку крови донора.

Результаты позволили сделать заключение о наличии антител против белка мембраны кардиомиоцитов с мол,массой 67 кД в сыворотке крови данного больного, что свидетельствовало об аутоиммунном поражении

миокарда у данного больного.

Способ апробирован на 30 донорах, 20 больных миокардитом, 10 больных дилатационной кардиомиопатией, 20 больных ишемической болезнью сердца. Антитела к

детерминанте с молекулярной массой 67 килодальтон, экспрессируемой на поверхности кардиомиоцитов человека, обнаружили только в сыворотке крови больных миокардитом с точностью 85%, а по прототипу 60% (т.е. точность способа увеличивается на 25%).

Способ определения антител к белкам мембраны кардиомиоцитов может использоваться в широкой сети лечебных учреждений, не имеющих специального оборудования, так как результаты определяются визуально, для обследования пациентов с заболеваниями сердца с диагностической целью, а также для выбора адекватной патогенетической терапии и контроля за ее эффективностью. Способ высокоспецифичен, значительно упрощает исследование, поэтому может осуществляться неподготовленным персоналом, исключает проведение биопсии миокарда.

Формула изобретения

Способ диагностики аутоиммунного поражения миокарда при миокардитах, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее с антигеном миокарда, выявление иммунопреципитатов, отличающ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа в качестве антигена ис517800076

пользуют мембраны кардиомиоцитов, фик- нопреципитата, содержащего белок с сированных на нитроцеллюлозе с помощью мол.м. 67 KD, диагностируют аутоиммунное иммуноблоттинга. и при выявлении имму- поражение миокарда,

Изобретение относится к области медицины, а именно к изучению аутоиммунных поражений сердца. Цель изобретения - повышение точности способа. У больного производят забор крови, выделяют из нее сыворотку, которую инкубируют в присутствии нитроцеллюлозной мембраной с фиксированными к ее поверхности мембранной фракцией кардиомиоцитов. И при выявлении иммунопреципитата. содержащего белок с мол. м. 67 KD, диагностируют аутоиммунное поражение миокарда. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа на 25%.