Способ определения антител к миокарду Советский патент 1988 года по МПК G01N33/535 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике аутоиЯмунно- |го поражения миокарда, : Целью изобретения является упроще- |ние способа.

i Способ осуществляют следующим образом.

I Из сердец 25 эмбрионов человека ;j возрасте 20-24 недедь готовят гомо- , который фракционируют методом дифференциального центрифугирования 1ри 45000-50000 об/мин. Необходимая 5елковая фракция при данной частоте :вращения остается в супернатанте, а 1ри большей осаждается на дне пробирки вместе с другими белковыми фракциями. После обессоливания суперна- ганта проводят гель-фильтрацию на колонке сефадекса G-75 для выделения шсокоочищенной белковой фракции миокарда с молекулярной массой 25000- J5000, что соответствует массе клеточных мембран кардиомиоцитов Полу- 1енный антиген миокарда (белок мемб- ан кардиомиоцитов) имеет морфологическую (в том числе и антигенную) структуру, идентичную миокарду взрослого человека. Плод считается жизне- :пособным в возрасте свьше 28 недель, а к 20 неделе развития уже пол- ;иостью формируются элементы сердечнососудистой системы. Использование : мбрионального антигенного материала 11иокарда является наиболее благопри- тным, так как миокард эмбриона, :Ьзятый сразу после его гибели, не Подвергался воздействию вредных аген- jroB, способных влиять на антигенную Структуру кардиомиоцитов. Полученный тиген миокарда не содержал миогло- бин (мол,масса J7600), что было под- |гверждено при радиоиммунологическом $1сследоваш1И с набором антител к Циоглобулину Atomique Nucleare, Для вязь1вания антигена миокарда с твердой фазой (внутренней поверхностью юлистироловой пробирки) в полисти- |роловые пробирки помещали раствор антигена миокарда в концентрации 25 мкг/мл, Данная концентрация антигена является наиболее оптимальной, Так как использование концентраций антигена 12,5 мкг/мл и меньше существенно снижает чувствительность спосо Ба, тогда как при применении концент рацкя антигена миокарда 50 мкг/мл и больше заметно не повышает чувстви- ельность способа, а расход ценного

,

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

реактива - антигена миокарда - значительно увеличивается. Пробирки инкубируют в течение 1,5 ч при во влажной среде, содержащей 5% СО. При инкубации более 2 ч чувствительность способа повышается незначительно, а при инкубации менее 1 ч отмечено значительное снижение чувствительности метода. Температурный режим и уровень концентрации СО соот-/ ветствуют внутренней среде живого организма и наилучшим образом влияют на кислотно-щелочное равновесие используемых растворов.

После инкубации проводят пятикрат ную отмывку фосфатным буфером (рН 7,2) и 0,05%-ным раствором Твин-20 для уменьшения неспецифического свя- зывйния белков. Пять последователь- ных отмывок достаточно для полного удаления из пробирок реактивов, участвовавших в предыдущем этапе исследования. После этого в пробирки добавляют 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, обеспечивающего полное закрытие оставшейся свободной поверхности полистирола, способного участвовать в неспецифической сорбции белков. Использование альбумиеа в концентрации меньше 1% не обеспечивает полного закрытия полистироловой поверхности, что в значительной мере снижает специфичность способа, а при применении концентрации альбумина , . больше 1,3% существенно не влияет на специфичность способа и приводит к большему расходу реактива (альбумина) . Эти данные получили при использовании альбумина в интервалах кон- це нтрации от 0,05 до 2%. Параллельно формируют контрольную группу пробирок, численно равную опытной, которые заполняют только указанньм раствором альбумина. Все пробирки инкубируют и отмывают в указаньых условиях. Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного, формируя три разведения сыворотки 1:10, 1:100 и 1:1000, которые вносят в три пробирки из контрольной и три пробирки из опытной rpyni:, создавая серию из шести пробирок, соответствующую каждому больному. Указанные пробирки инкубируют и отмывают в указанных условиях.В отмытые пробирки добавляли сьшоротку крови кролика, содержащую антитела к иммуноглобулинам человека, в разведении 1:1000, Данное разведение сыво3lAl

ротки является наиболее оптимальдым для увеличения чувствительности и специфичности способа Инкубацию и отмывку проводят в указанных условиях,После этого в пробирки вносят сыворотку свиньи, содержащую антитела к иммуноглобулинам кролика, меченую пероксидазой, в разведении 1:1000. Данное разведение сыворотки обеспечивает избыточное содержание антител, меченных пероксидазой, что необходимо для следующего этапа способа.

После инкубации и отмывки в указанных условиях в пробирки вносят субстратную систему, состоящую из ABTS и НаОе (ABTS - 2,2-азидоди-З этилбентиазолинсульфоновой кислоты) , Проводят инкубацию при комиатной температуре в течение 25-20 мин, В течение этого времени цветная реакция достигает достаточной для измерения интенсивности. После этого в пробирки добавляют раствор азида натрия для блокирования цветной реакции,Степень окраски оценивали при спектрофо- тометрии при длине волны 650 нм, i.;; Волновые параметры подобраны для использования этой ферментной системы. Степень окраски в каждой пробирке из опытной серии и соответствующей пробирке из контрольной серии характеризовали индексом абсорбции, который вычисляли по формуле

01П

ИА

где ИА - индекс абсорбции;

ОПр показатель оптической плотности в опытной серии пробирок ;

ОП..- показатель оптической плотности к контрольной серии пробирок.

Обследовали J08 доноров. Антитела к миокарду диагностируют при значениях индекса абсорбции больше 0,75, Антитела к миокарду не выявляют при значениях индекса абсорбции меньше 0,37, Результаты считали недостоверными, если индекс абсорбции находился в интервале 0,37-0,75,

Пример 1, Кролика иммунизируют очищенным антигеном миокарда, выделенным в указанных условиях, после чего у него забирают сыворотку крови. Полученную от кролика сыворотку исследовали при помощи иммунофер672

ментного способа на наличие антител к миокарду, В качестве контроля использовали сыворотку, полученную из крови здорового человека, В резуль- тате проведенного исследования получили следую1дие данные: индекс абсорбции в опыте составил 0,99, в контроле - 0,44, Данные позволяют гово..

рить о наличии антител к миокарду в

сьшоротке крови иммунизированного . кролика, тогда как в сьшоротке контрольного животного антител к миокарду не выявили,

5 Пример 2, Исследовали сыворотку больного через 20 дней после операции на сердце (крмиссуротомии) по поводу порока сердца (митрального стеноза). В пост операционном периоде

0 У больного развился постперикардио- томический синдром, в патогенезе которого антитела к миокарду играют .ведущую роль, В результате-исследования при помощи иммуноферментного спо5 соба получены данные: индекс абсоррг- ции в опыте (сыворотка-больного) 0,89, а в контроле - 0,54. Результаты исследования указывают на наличие антител к миокарду в сыворотке бола-.

0 ного. На основании клинических симптомов заболевания, а также данных, полученных при помощи иммунофермент - ного способа, больному был поставлен Диагноз постперикардиотомического

5 синдрома аутоиммунной природы и проведен курс иммуностатнческой тера- ,пии с положительным клиникр-лаборат торным эффектом, Эффективность предлагаемого спосо0 ба определения антител к миокарду в сьшоротке крови больных состоит в том, что он обладает специ(|«чностью, для исследования достаточно наличия сыворотки больного, что исключает 45 проведение биопсии миокарда и упрощает метод.

Формула изобретения

gQ Способ определения антител к миокарду, включающий выделение карди апьного антигена и добавление его к исследуемой сыворотке с последукяцим определением антител в иммунологичес еких реакциях, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа, кардиальный антиген выделяют из эмбриональной сердечной ткани человека с помощью гель-хроматографии,

514116726

а определение противокардиальных ан- муноферментным методом по.интенсивнос- гител осуществляют твердофазным им-ти развивающейся цветной реакции.

Изобретение относится к медицине, касается диагностики аутоиммунного поражения миокарда. Цель изобретения - упрощение способа. Для этого из сердечной ткани эмбриона человека готовят- гомогенат, который фрик- ционируют методом дифференциального центрифугирования при 45000- 50000 об/мин. После обессоливания су- пернатанта проводят гель-фильтрацию на колонке сефадекса С-75 для выделения высокоочищенной белковой фракции миокарда, которую помещают в пробир,ки и инкубируют 1,5 ч, затем пятикратно отмывают фосфатным буфером ;(рН 7,2) и 0,05%-ным р-ром Твин-20. В пробирки после отмывки добавляют 1%-ный р-р бычьего сывороточного альбумина (БСА). Контрольную группу проI бирок заполняют только р-ром БСА. Затем вновь проводят инкубацию и отмывку в аналогичных условиях. Последующую инкубацию проводят с сыворотками больного при трех разведениях сыворотки - 1:10,1:100, 1 :1000. В отмытые пробирки опыта и контроля добавляют сыворотку крови кролика с антителами к иммуноглобулинам человека в разведении 1:1000. Вновь проводят инкубацию и отмывку и вносят сыворотку свиньи с антителами к иммуноглобулинам кролика, меченную пероксидазой в разведении 1:1000. После инкубации и отмывки в пробирки вносят субстратную систему ABTS и HgOj,, вновь инкубируют 25 мин, добавляют р-р азида натрия для блокирования цветной реакции, оценивают степень окраски спектрофотометричес- ки при / 650 нм. По интенсивности развивающейся цветной реакции твердофазным иммунньш методом определяют противокардиальные антитела. (Л о ч ю