СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АУТОАНТИТЕЛ И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИСТЕМНЫХ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ Российский патент 2001 года по МПК G01N33/483 G01N33/564 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и может быть использовано в диагностике системных аутоиммунных заболеваний и для контроля эффективности лечения.

Известен способ определения каталитических аутоантител в сыворотке крови больных астмой, каталитически активных в отношении вазоактивного интестинального пептида (S.Paul et al., Catalitic Hydrolysis of Vasoactive Intestinal Peptide by Hyman Autoantibody., Science, v. 2446, p. 1158-1161, 1989).

Известен метод выделения каталитических аутоантител и их фрагментов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, каталитическую активность которых в отношении вазоактивного интестинального пептида регистрировали по радиоактивной метке, после проведения электрофореза в полиакриламидном геле (Патент США 5229272, 1993 г.).

Недостатком этих способов является сложная методика очистки каталитических аутоантител и длительное время выявления этих аутоантител.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения каталитических аутоантител в сыворотках крови больных аутоиммунным тироидитом (АТ) и системной красной волчанкой (СКВ), где в качестве субстрата использован тироглобулин (Tg). Из сыворотки крови больного или донора выделяют фракцию IgG антител с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, добавляют субстрат Ig, меченный ¹²⁵I, реакционную смесь инкубируют в течение 16 часов при t +37^oC, проводят электрофорез в полиакриламидном геле, каталитическую активность антител регистрируют с помощью радиоактивной метки, а также методом иммуноферментного анализа, где продолжительность проведения реакции составляет 21 час. Количественная оценка каталитических антител вычисляется по интегральной формуле Михаэлиса-Ментэна. Каталитическая активность сывороток от больных АТ и СКВ была намного выше доноров, однако эта активность оказалась значительно ниже в сыворотках больных СКВ по сравнению с больными АТ. (S.Paul et al., Characterization of Thyroglobulin-Directed and Polyreactive Catalytic Antibodies in Autoimmune Disease., J.Immunology, v. 159, p. 1530-1536, 1997). Сыворотки всех больных СКВ (10 человек) оказались активны по отношению к Tg, в то время как из 8 больных, только у 4 была обнаружена каталитическая активность. Наибольшей каталитической активностью обладали препараты IgG антител от 4-х больных СКВ и 1-го больного АТ (более 50% расщепления Tg). Таким образом, чувствительность теста по определению каталитических аутоантител для СКВ составила 40%, для АТ соответственно 12,5%.

Недостатком этого способа является то, что он предусматривает сложную методику очистки фракции IgG антител, что снижает достоинства способа выделения каталитических антител, а использование узкоспецифического субстрата (Tg) также снижает чувствительность способа определения каталитических аутоантител при системных аутоиммунных заболеваниях, как и длительное время инкубации фракции IgG с субстратом.

Задача, поставленная авторами, - устранить указанные недостатки путем снижения трудоемкости выделения каталитических антител, а также повышения чувствительности, при одновременном уменьшении времени проведения исследований за счет использования в качестве субстрата для определения каталитической активности исследуемой сыворотки суперспирали ДНК.

Для этого в способе определения каталитических аутоантител, включающем выделение фракции IgG антител из крови, добавление субстрата и инкубацию полученной реакционной смеси с последующим электрофорезом в геле, предложено в качестве субстрата использовать плазмидную ДНК в соотношении с фракцией IgG антител 1 мкг : 2-10 мкг соответственно, при этом инкубацию реакционной смеси осуществлять в течение 25 - 30 мин при температуре 35 - 37^oC, а электрофорез проводить в 0,8% агарозном геле при постоянном токе 15 мА в течение 20 - 30 минут.

Предложенная методика выделения каталитических аутоантител, использующая в качестве субстрата плазмидную ДНК, позволяет сократить время электрофореза и повысить точность определения аутоантител, что дает возможность проводить диагностику больных в более ранние сроки и с большей степенью достоверности.

Известен способ диагностики аутоиммунных заболеваний, включающий клинико-лабораторные исследования, электрофоретический и количественный анализ выделенных каталитических аутоантител (см. S.Paul et al., Characterization of Thyroglobulin-Directed and Polyreactive Catalytic Antibodies in Autoimmune Disease., J. Immunology, v. 159, p. 1532, 1997).

Недостатком этого способа является то, что количественная оценка аутоиммунного процесса проводилась по регистрации радиоактивной метки, временной интервал которой составляет 12 - 21 час, из-за длительной инкубации исследуемых сывороток с тиреоглобулином.

В предлагаемом способе диагностики системных аутоиммунных заболеваний, включающем клинико-лабораторные исследования, электрофоретический и количественный анализ выделенных каталитических аутоантител, предложено дополнительно в выделенных каталитических аутоантителах по п.1 исследовать кинетику разрезания плазмидной ДНК фракцией IgG антител сыворотки крови больного и при получении менее 25% линейной формы плазмидной ДНК диагностировать отсутствие аутоиммунного процесса, от 25% до 50% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму диагностировать низкую степень активности аутоиммунного процесса, свыше 50% - активность высокой степени.

Кроме того, при высокой степени активности аутоиммунного заболевания количественное определение уровня каталитической активности IgG антител предложено осуществлять методом линейного дихроизма. Это позволяет сократить сроки постановки диагноза, что необходимо, несмотря на высокую стоимость проведения данного исследования, при высокой степени активности аутоиммунного процесса, несовместимого с жизнью пациента.

Плазмидная ДНК, при действии на нее каталитических Ig антител в электрофорезе, реагирует (распрямляется) в различной степени на это действие в зависимости от степени активности антител.

То, что диагностика проводится по результатам исследования выделенных предложенным способом каталитических аутоантител, позволяет повысить точность диагноза, дает возможность осуществлять прогнозирование течения аутоиммунного процесса и соответствующим образом корректировать курс лечения.

На чертеже представлена электрофореграмма, пример. 1.

Способ осуществляется следующим образом.

Из образцов сыворотки крови больного или донора выделяют фракцию IgG антител с помощью (NH₄)₂SO₄ (40% степень насыщения), в качестве иммуносорбента используется протеин-сефароза А. В отличие от прототипа исключается высокоэффективная жидкостная хроматография, акцентируется внимание на "кислом шоке". Смыв фракции с аффинного носителя осуществляют 0,1 М солянокислым глицином, pH 2,5, с последующей нейтрализацией элюента буфером A (20 мм Трис HCl, pH 7,5, NaCl 50 mM).

Выделенную фракцию IgG антител больного или донора (2-10 мкг) смешивают с суперскрученной плазмидной ДНК (1 мкг) в буфере A + 20 мМ MgCl₂, реакционную смесь инкубируют 25 - 30 минут при t 35 - 37^oC, наносят на пластинку с агарозным гелем, электрофорез проводят в 0,8% агарозном геле при постоянном токе 15 мА в течение 20 - 30 минут. Полосы электрофоретической подвижности кинетики разрезания плазмидной ДНК антителами просматривают в ультрафиолетовом свете, после окраски агарозной пластинки 0,1% раствором бромфенолового синего. Сущность анализа основана на эффекте различной электрофоретической подвижности плазмидной ДНК в суперскрученной и линейной формах.

Использование в качестве субстрата ДНК дает возможность проводить более информационный и качественный анализ исследуемых каталитических аутоантител. Сокращение времени инкубации фракции IgG с субстратом до 1 часа 20 минут, включая проведение электрофореза, увеличивает значимость этого способа по сравнению с прототипом, среднее время инкубации в котором составляет около 21 часа.

В зависимости от глубины разрезания субстрата (плазмидная ДНК) исследуемым сывороткам дают следующие обозначения (см. чертеж): "+" до 25% перевода суперскрученной (СС) ДНК в линейную форму - дорожка C, "++" от 25 до 50%, соответственно дорожка D, "+++" - свыше 50% активности - дорожка E, плазмидная ДНК на старте (дорожка A) - отсутствие активности.

Предлагаемое изобретение в части применения каталитических аутоантител в диагностике системных аутоиммунных заболеваний решает задачи возможности использования этих антител как маркеров. Этот способ диагностики включает несколько этапов.

1-й этап: из образцов сыворотки крови больных или доноров выделяют фракцию IgG антител по описанной выше методике. Далее образцы инкубируют с плазмидной ДНК в течение 30 минут и наносят на агарозу для электрофореза. В результате каталитической активности антител больного или донора плазмидная ДНК во времени превращается из суперскрученной в линейную форму, что позволяет диагностировать аутоиммунный процесс, стадию его протекания в зависимости от глубины разрезания плазмидной ДНК. При получении менее 25% линейной формы плазмидной ДНК диагностируют отсутствие аутоиммунного процесса. От 25% до 30% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму означает низкую степень активности этого процесса, свыше 50% - высокоактивный аутоиммунный процесс.

На каталитическую активность по кинетике разрезания ДНК с помощью электрофореза исследованы сыворотки 10 больных СКВ, 6 больных склеродермией, 15 - ревматоидным артритом, 10 - псориазом и 12 доноров.

Все больные обследованы в клинике института ревматологии и МОНИКИ, проведены клинико-лабораторные исследования. Диагноз был достоверен и соответствовал критериям Американской ревматологической ассоциации.

2-й этап: с помощью электрофореза, по кинетике разрезания ДНК можно качественно оценивать уровень каталитической активности антител больных, проводить скрининговый анализ каталитических аутоантител, при этом для инкубации выделенных IgG фракций из сывороток больных с плазмидной ДНК используют 96-луночные иммунологические планшеты. Вся скрининговая процедура, включая постановку электрофореза, занимает 1 час 30 минут. Одновременно можно проанализировать 50 образцов фракций IgG, выделенных из исследуемых сывороток.

3-й этап: отобрав больных по сывороточным образцам, обладающим каталитической активностью, далее может быть детально исследована глубина аутоиммунного процесса больного, проведен мониторинг и терапия через количественную регистрацию каталитической активности исследуемых сывороточных образцов методом линейного дихроизма (ЛД). Метод основан на линейном дихроизме в потоке и позволяет количественно, с большой точностью оценить уровень каталитической активности аутоантител у больных с аутоиммунными патологиями. Метод ЛД впервые использован для регистрации кинетики разрезания ДНК при воздействии каталитических аутоантител. Время разрезания 1 мкг плазмидной ДНК составляет 2 часа, этот отрезок времени позволяет оценить удельную каталитическую активность антител, которая рассчитывается по интегральной формуле Михаэлис-Ментон и выражается в условных единицах.

Для измерения ЛД в потоке в проточную кювету вносят 1 мкг плазмидной ДНК + 10 мкг фракции IgG антител, выделенных из сыворотки крови больного в буфере A+мМ MgCl₂. Регистрируют кинетику разрезания ДНК исследуемой сыворотки на дихрографе, при длине волны 260 нм. Регистрация кинетической кривой осуществляется непрерывно на самописце. Сигнал линейного дихроизма меняется при нарушении целостности ДНК. Таким образом, процесс деградации ДНК под действием каталитических антител регистрируется непрерывно, количественно и с большой точностью. В процессе терапевтического воздействия можно наблюдать за изменением удельной активности каталитических аутоантител больного, и уменьшение этого параметра свидетельствует о положительном эффекте терапевтического воздействия.

Методом линейного дихроизма исследованы сыворотки крови тех же больных, в сыворотках которых каталитическая активность регистрировалась по кинетике разрезания ДНК в агарозном геле. Обнаружена зависимость удельной активности каталитических антител от вида и стадии заболевания, что в принципе может послужить основой для выработки прогностических критериев развития аутоиммунного процесса. Показано, что удельная активность каталитических аутоантител при различных аутоиммунных патологиях зависит от стадии заболевания и значительно выше, чем у антител сыворотки крови доноров.

Пример 1
Донор В., 40 лет. К выделенной фракции IgG антител из сыворотки крови 10 мкг добавили 1 мкг суперскрученной плазмидной ДНК, смесь инкубировали 30 мин при t +37^oC, наносили на пластинку с 0,8% агарозным гелем, а электрофорез проводили при постоянном токе в 15 мА, в течение 20 минут. На чертеже представлена электрофореграмма: на дорожке B показано отсутствие каталитической активности в сыворотке крови донора и соответствие ее контролю. Для измерения ЛД в проточную кювету внесли 10 мкг IgG антител + 1 мкг плазмидной ДНК в буфере A + 20 мМ MgCl₂. Измерения проводили на дихрографе при длине волны 260 нм, зарегистрировали каталитическую активность выделенных антител, равную 0,012 у.е., что было на порядок ниже аналогичных показателей у больных СКВ.

Пример 2
Больная И. Е.Н., 37 лет, N ист. болезни 37860 - ревматоидный артрит, по клиническим данным с низкой степенью активности аутоиммунного процесса. В выделенной фракции IgG антител сыворотки крови больной определяли каталитическую активность по кинетике разрезания плазмидной ДНК с помощью электрофореза, как описано в примере 1. Исследуемая сыворотка имела активность, соответствующую "+" - 25% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму, что свидетельствует о низкой степени активности аутоиммунного процесса. При изменении ЛД удельная каталитическая активность фракции IgG антител, выделенных из сыворотки крови больной, равная 1,95 у.е., была на 3 порядка ниже, чем у больной СКВ.

Пример 3
Больная Д. М.Ю., 46 лет. N ист. болезни 1675000, системная красная волчанка, по характеру течения болезни - хронический, по клинико-морфологической характеристике поражений: симптом "бабочки" и экссудативная эритема кожи, острый полиартрит, выраженный миокардит, хроническая пневмония, титры антинуклеарных антител повышены в 3 раза по сравнению с референс-сывороткой, степень активности аутоиммунного процесса высокая (III). Определение каталитических аутоантител и их активности проводили тем же способом, который описан в примерах 1 и 2. Исследуемая сыворотка соответствовала активности "+++" - 100% разрезания плазмидной ДНК, что свидетельствует о высокой степени активности аутоиммунного процесса. Измерение ЛД в потоке показало очень высокую каталитическую активность сыворотки крови этой больной, удельная активность фракции IgG, равная 1890 у.е., была на 6 порядков выше, чем у донора, и на 3 порядка, чем у больных с ревматоидным артритом.

Пример 4.

Больная Х. Н. Д. , 48 лет, N ист. болезни 35547, системная красная волчанка, характер течения болезни - хронический, по клинико-морфологической характеристике поражений: экссудативная эритема кожи, подострый полиартрит, умеренный миокардит, антинуклеарные антитела повышены в 2 раза по сравнению с референс-сывороткой, степень активности аутоиммунного процесса умеренная (II). Определение каталитической активности сыворотки больной проводили тем же способом, что описан в примерах 1, 2, 3. Исследуемая сыворотка соответствовала активности "++" - 50% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму и умеренной степени активности аутоиммунного процесса. Далее каталитическую активность этой сыворотки исследовали методом ЛД. Для этого в проточную кювету вносят 10 мкг фракции IgG антител, выделенных из сыворотки больного + 1 мкг плазмидной ДНК в буфере A + 20 мМ MgCl₂. Регистрируют кинетику разрезания ДНК исследуемой сыворотки на дихрографе, при длине волны 260 нм. Измерение ЛД в потоке показало, что удельная активность каталитических антител, равная 925 у.е., в 2 раза ниже, чем у больной в примере N 3 с высокой активностью процесса, и на 5 порядков выше, чем у донора.

После проведения курса терапии гликостероидами, больная была вновь обследована на присутствие каталитических аутоантител. Анализ кинетической кривой показал, что произошло изменение ЛД под действием каталитических аутоантител, выделенных из сыворотки крови больного после его лечения, что позволяет сделать вывод об эффективности терапии. Удельная каталитическая активность ДНК-антител сыворотки крови больной до лечения была на два порядка выше сыворотки донора (1,85 у.е.), а каталитическая активность аутоантител больной до лечения была выше таковой после лечения на три порядка.

Приведенные примеры свидетельствуют, что данный способ определения каталитических антител в сыворотке крови может быть использован в диагностике системных аутоиммунных заболеваний. С помощью предлагаемого способа можно не только проводить диагностику заболевания, но, используя метод ЛД, количественно определять каталитические аутоантитела, прогнозировать течение аутоиммунного процесса и вести контроль за эффективностью лечения.

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и может быть использовано в диагностике системных аутоиммунных заболеваний и для контроля эффективности лечения. Способ определения каталитических аутоантител включает выделение фракции IgG антител из крови, добавление субстрата и инкубацию полученной реакционной смеси с последующим электрофорезом в геле, при этом в качестве субстрата используют плазмидную ДНК в соотношении с фракцией IgG антител 1 мкг : 2 - 10 мкг соответственно, инкубацию реакционной смеси осуществляют в течение 25 - 30 мин при 35 - 37°С, а электрофорез проводят в 0,8% агарозном геле при постоянном токе 15 мА в течение 20-30 мин и по распрямлению плазмидной ДНК определяют присутствие каталитических аутоантител. В способе диагностики системных аутоиммунных заболеваний, включающем клинико-лабораторные исследования, электрофоретический анализ выделенных каталитических аутоантител, диагностику осуществляют по количеству распрямленной плазмидной ДНК и при получении менее 25% линейной формы плазмидной ДНК диагностируют отсутствие аутоиммунного процесса, 25 - 50% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму диагностируют низкую степень активности аутоиммунного процесса, свыше 50% - активность высокой степени. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности и сокращения времени проведения процесса. 2 с. и 1 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Способ определения каталитических аутоантител, включающий выделение фракции IgG антител из крови, добавление субстрата и инкубацию полученной реакционной смеси с последующим электрофорезом в геле, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют плазмидную ДНК в соотношении с фракцией IgG антител 1 : 2 - 10 мкг соответственно, при этом инкубацию реакционной смеси осуществляют в течение 25 - 30 мин при 35 - 37°С, а электрофорез проводят в 0,8% агарозном геле при постоянном токе 15 мА в течение 20 - 30 мин и по распрямлению плазмидной ДНК определяют присутствие каталитических аутоантител. 2. Способ диагностики системных аутоиммунных заболеваний, включающем клинико-лабораторные исследования, электрофоретический и количественный анализ каталитических аутоантител, отличающийся тем, что диагностику проводят по количеству распрямленной плазмидной ДНК и при получении менее 25% линейной формы плазмидной ДНК диагностируют отсутствие аутоиммунного процесса, от 25 до 50% перевода суперскрученной ДНК в линейную форму диагностируют низкую степень активности аутоиммунного процесса и свыше 50% - активность высокой степени. 3. Способ диагностики по п.2, отличающийся тем, что при высокой степени активности аутоиммунного процесса количественное определение каталитических аутоантител осуществляют методом линейного дихроизма.