Способ определения бактерицидной активности тканей Советский патент 1992 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области медицины, в частности к микробиологии, и может быть использовано в клинической ортопедии и травматологии для лабораторного определения показателей обеззараживающей активности тканей и оценки на этой основе течения чрескостного остеосинтеза на различных его этапах.

Известны способы определения бактерицидных свойств тканей, которые основаны на подавлении роста тест-культуры на агаровых апликаторах, снятых с поверхности кожи, либо путем подавления роста тест- культуры в жидких средах Однако эти

известные способы позволяют определять бактерицидные свойства только кожи, крови и ее компонентов.

Известен также способ диагностики заживления послеоперационной раны, который на основе выявления зон задержки роста тест-культуры на агаровом газоне, позволяет диагностировать наличие или отсутствие начального этапа воспалительного процесса в послеоперационной ране.

В случае неблагополучного течения процесса заживления послеоперационной раны в свежем раневом экссудате происходит разрушение факторов неспецифической рео 2

зистентности в результате протеазной активности размножающихся гноеродных бактерий. При этом действие известного способа строго ограничено сроками зпите- лизации раневой поверхности. В силу этого, известный способ не позволяет оценивать обеззараживающую активностьтканей в условиях многомесячного длительного процесса чрескостного остеосинтеза и, практически, полного отсутствия раневых повреждений. того, известная методика не позволяет получать конкретные показатели уровней обеззараживающей активности тканей в эквивалентах антибиотиков и на этой основе производить объективный прогноз течения остеосинтеза.

Целью изобретения является оценка течения остеосинтеза путем определения показателей обеззараживающей активности тканей.

Указанная цель достигается тем, что в способе включающем забор биологического материала на диск фильтровальной бумаги, размещение исследуемых проб на стандартном агаровом газоне микробной культуры, ее термостатирование и определение размеров зон задержки роста тест-культуры, одновременно размещают диски содержащие стандартные количества антибиотика и после получения, соответствующей, для данного антибиотика зоны задержки роста тест-культуры, сопоставляют ее с зонами у исследуемых проб, исходя из диапазона средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации используемого антибиотика рассчитывают уровень обеззараживающей активности тканей в эквиваленте антибиотика и при получении средних или высоких уровней эквивалента обеззараживающей активности тканей диагностируют благополучное течение, а при отсутствии или низком уровнях такого эквивалента - неблагополучное течение остеосинтеза.

Способ осуществляется следующим образом: у больных с ортопедо-травматологи- ческой патологией, лечащихся методами чрескостного остеосинтеза, начиная с 4-6 дня после операции и на протяжении всего периода лечения компрессионно-дистрак- ционным аппаратом и создаваемых им условии напряжения растяжения или напряжения сжатия, осуществляют забор тканевых компонентов. В качестве тканевых компонентов могут быть использованы тканевая жидкость из спицевых каналов, разрезов и трещин кожи реплики-отпечатки со свежих разрезов тканей, суспензии тканепых гомогентов при биопсии и др За бирают исследуемые компоненты гканей с расчетам фиксации мх стандартного количества в каждой пробе путем засасывания всегда с одинаковым объемом диском из фильтровальной бумаги диаметром 5 мм. Исследуемые пробы помещают на поверхность также стандартного агарового газона любой микробной культуры, продуцирующей каратиноидный пигмент из семейства Micrococacceae рода Micrococcus. Если исследование выполняют на микробном газоне

0 состоящем из тест-культуры семейства Micrococacceae то необходимо предварительно тщательно подобрать такую ее микробную нагрузку для газона, чтобы в конце выращивания достигались бы постоянные

5 результаты при замере зон торможения вокруг исследуемых дисков, Как правило, это достигается при несплошном росте колоний тест-культуры в массе газона.

Традиционно, в качестве такой микро0 бной тест-культуры используют Micrococcus lysodeicticus по отношению роста которого тарировали диаметры задержки роста.

Одновременно на этот же микробный газон помещают стандартный диагностиче5 ский диск с антибиотиком, например, моно- мицином, эритромицином или пенициллином.

Исследуемые пробы с компонентами тканей и диагностический диск с избранным

0 антибиотиком, помещенные на микробный газон, термостатируют на протяжении 48 ч, После этого в первую очередь замеряют образовавшуюся зону задержки роста тест- культуры вокруг диска с избранным

5 антибиотиком. При этом,диаметр этой зоны задержки, если все компоненты газона стандартны, должны быть типичными именно для этого антибиотика. Так например, многократно выполненные исследования

0 на стандартных агаровых газонах с тест- культурой Micrococcus lysodeicticus концентрации 250000 клеток в мл при заливке на поверхность агара показали, что для диагностического диска, содержащего по ГО5 СТу 30 мкг мономицина диаметр зоны задержки роста тест-культуры составляет всегда 22 мм. Для диска, содержащего по ГОСТу 16 ЕД пенициллина - 26 мм, а для диска, содержащего по ГОСТу 15 мкг эрит0 ромицина - 20 мм.

Образование указанных размеров зон задержки вокруг диагностических дисков с избранным антибиотиком свидетельствует о соответствии стандарту как собственно

5 используемого диска с антибиотиком, так и стандартности применяемого микробного газона тест-культуры

Отклонения от указанных показателей тон задержки вокруг дисков г избранными антибиотиками укаччвают на то что либо

используемый диагностический диск не содержит обусловленное ГОСТом количество антибиотика, либо микробная нагрузка тест-культуры в газоне не соответствует оттитрованному стандарту, либо не стандартен состав применяемого питательного агара. В этом случае исследование повторяют до получения стандартных результатов.

При выявлении стандартных размеров зон торможения вокруг диска с антибиотиком приступают к определению размеров аналогичных зон у исследуемых проб тканей.

Наличие вокруг дисков с пробами тканей зон задержки роста тест-культуры свидетельствует о возникновении в тканях пораженного сигмента повышенной обеззараживающей активности. А если таких зон нет, то это указывает на отсутствие формирования в тканях повышенного обеззараживающего эффекта.

Далее измеряют размеры зон торможения роста тест-культуры вокруг дисков с исследуемыми пробами тканей, сопоставляют их с размерами зоны вокруг диагностического диска с антибиотиком и выражают обеззараживающую активность о показателях эквивалента избранного антибиотика. А уровень обеззараживающей активности диагностируют по отношению этих показателей к диапазону средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации (МПК) данного антибиотика. При этом, исходят из того, что диапазоны таких средней терапевтических МП К составляют для моно- мицина 15-20 мкг/мл, для эритромицина при парэнтеральном введении - 9-12 мкг/мл, для пенициллина - 7-10 ЕД/мл и т.д.

Следовательно, если исследуемая проба тканей образовала зону торможения роста тест-культуры, например, диаметром 18 мм, то ее сопоставление с зоной задержки роста в 22 мм, образовавшейся в этом же исследовании вокруг диагностического диска содержащего 30 мкг мономицииа, позво- ляет определить эквивалент еь обеззараживающей активности в 24,6 мкг/мл мономицина.

Если же эквивалент обеззараживающей активности определяют по отношению антибиотика эритромицина, то проба ткани образовавшая зону торможения в 18 мм, при размерах зоны торможения роста в 20 мм вокруг диагностического диска содержащего 15 мкг эритромицина, будет иметь эквивалент обеззараживающей активности в 13,5 мкг/мл эритромицина.

Если же в качестве диагностического диска использовали диск содержащий 16

ЕД пенициллина, то при размерах зоны торможения роста с пробой ткани в 18 мм, эквивалент ее обеззараживающей активности в исследуемой пробе будет составлять 5 11,1 ЕД/мл пенициллина. Далее, исходя из диапазона средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации используемого антибиотика - диагностируют уровень обеззараживающей активности

0 тканей.

При этом, давая оценку показателю выявленного эквивалента антибиотика для данной пробы ткани, одновременно, судят о высоком, среднем или низком уровнях обез5 зараживающей активности по соответствию этого уровня диапазону среднего МПК.

Так, например, наличие зоны задержки роста тест-культуры вокруг диагностического диска содержащего 30 мкг мономицина

0 диаметром в 22 мм свидетельствует о стандартности постановки исследования. Сопоставляя эти величины с размерами зоны торможения роста тест-культуры вокруг диска С исследуемой пробой в 17 мм, делают

5 вывод, что в тканях исследуемой пробы эквивалент обеззараживающей активности равен 23,8 мкг/мл мономицина. А поскольку средняя МПК для этого антибиотика составляет 15-20 мкг, делают вывод о том, что в0 тканях сформировался высокий уровень обеззараживающей активности.

Если бы зоны задержки роста тест-культуры в этом же анализе у исследуемых проб были бы, например, диаметрами в 9 и 12 мм,

5 то это соответствовало бы эквиваленту концентрации мономицина, соответственно, в 12,3 и 16,4 мкг/мл, что позволило бы сделать вывод 6 низком и среднем уровнях обеззараживающей активности в исследуемых тка0 нях.

Полученные данные служат объективным критерием для диагностики течения ос- теосинтеза. И при получении средних или высоких уровней эквивалента обеззаражи5 вающей активности тканей диагностируют благополучное течение, а при отсутствии или низком уровнях эквивалента - неблагополучное течение остеосинтеза.

Диагностику течения остеосинтеза, на

0 основе предлагаемого способа выполняют в динамике в течение всего периода лечения методом чрезкостного остеосинтеза с интервалами о 3-4 недели, а при необходимости выполняют чаще. При этом, в связи с

5 медленным появлением и также медленным затуханием процесса повышения обеззараживающей активности в тканях поврежденногосегментавсистемеаппарат+конечность первое исследование выполняют не ранее чем через 48 часов

с момента начала действия факторов напряжения растяжения или напряжения сжатия и не позднее 48 ч после прекращения действия указанных факторов.

Больной Ц. 30 лет, архивная карта 16018, поступил в клинику ВКНЦ ВТО с диагнозом: Неправильно сросшийся перелом костей голени, хронический остеомиелит, свищевая форма. Была выполнена операция: Секвестрнекрэктомия участка большеберцовой кости, остеотомия боль- шеберцовой и малоберцовой кости, остео- синтез аппаратом Илизарова. Тактика остеосинтеза состояла в проведении било- кал ьного дистракционно-компресссионно- го остеосинтеза. В результате лечения был замещен костный дефект, достигнуто хорошее сращение отломков, купирован остеомиелит, выправлена ось конечности. На 16 день после операции - в аппарате выполнялся режим дистракции.

Проведено лабораторное исследование по предлагаемому способу. На стандартный газон тест-культуры поместили диагностический диск, содержащий 30 мкг мономици- на и диски пропитанные тканевой жидкостью из тканей соответствующих верхней и нижней опорным базам аппарата. Посевы термостатировали в течение 48 часов. В результате исследования выявлено образование стандартной зоны торможения роста тест-культуры вокруг диагностического диска с мономицином диаметром 22 мм. Проба тканевой жидкости из спицевого канала верхнего кольца образовала зону торможения роста диаметром 17 мм, а из нижнего кольца - диаметром 15 мм, эквиваленты которых по мономицину составляют 23,3 и 20,4 мкг/мл. Так как диапазон средней терапевтической концентрации моно- мицина составляет 15-20 мкг/мл, то в исследуемых пробах тканевой жидкости можно определить, соответственно, высокий и средний уровни обеззараживающей активности тканей в пораженном сегменте и на основании этого диагностировать благополучное течение остеосинтеза.

Клинические проявления на данном этапе определялись следующим образом: повязки сухие, болезненность отсутствует, ходит с нагрузкой на конечность с дополнительной опорой; рентгенологически течение остеосинтеза в норме; анализ крови - Эр,- 4.62.1012; Нв - 149 г/л; Цв.п. - 0,9; лейкоциты- 10,74109; Э - 1; пал.--1; сегм.-54; лимф. - 39; мон. - 5; СОЭ - 15 мм/ч.

Обследование на 54-й день после операции - в аппарате продолжается выполнение этапа дисгракции. Забраны две пробы тканевой жидкости из спицевых каналов в

верхнем и нижнем кольцах аппарат, которые вместе с диагностическим диском с 30 мкг мономицина помещены на стандартный микробный газон тест-культуры и термостатированы в течение 48 ч, В результате были выявлены следующие зоны задержки роста на газоне тест-культуры: вокруг диагностического диска с 30 мкг моиомицина - 22 мм вокруг диска с пробой тканевой жидкости из

0 верхнего кольца 16 мм; вокруг диска с пробой тканевой жидкости из нижнего кольца 8 мм.

Наличие зоны торможения роста стандартного размера в 22 мм вокруг диагности5 ческого диска содержащего 30 мкг мономицина позволяет рассчитать его эквивалент обеззараживающей активности в исследуемых пробах тканевой жидкости, который составлял в проксимальном и дис0 тальном участках поврежденного сегмента, соответственно, 2-1,8 и 10,9 мкг/мл. Сопоставление с диапазоном средней минималь- ной подавляющей концентрацией мономицина в 15-20 мкг/мл позволяет диаг5 ностировать в исследуемых пробах высокий и низкий уровни обеззараживающей активности тканей. Клиническая картина характеризовалась следующими данными: повязки сухие, ран и свищей нет, температура в нор0 ме, анализ крови: Эр. - 4,43-Ю12; Нв - 130 г/л; Цв.п, - 0,85; лейкоциты - 11,0-109; Э - 2; пал. - 2; сегм. -56; лимф, - 35; Мон. - 6; СОЭ -18 мм/ч.

Лабораторная диагностика снижения

5 уровня до низкого эквивалента обеззараживающей активности тканей на уровне дис- тальной опоры аппарата указывала на нарушение здесь условий оптимального течения остеосинтеза о чем было сообщено

0 лечащему врачу и сделано соответствующее заключение в истории болезни. Однако, обосновываясь на внешне благополучной картине клинического течения остеосинтеза, ревизии систем аппарата лечащий врач

5 не предпринял.

В результате этого, через 6 дней (60-е сутки после операции)после данного обследования у больного отметили появление следующих клинических симптомов: повы0 шение температуры .от 37,5 до 37,&0С в вечернее время, сильная болезненность в области тканей дистальной опоры аппарата, появление серозно-геморрагического отделяемого из отверстий обоих спицевых кана5 лов в дистальном кольце. Анализ крови: Эр. - 4,60.1012; Нв - 144 г/л; Цв.пок. - 0,9; лейкоциты - 11, Э - 1; пал; -4; сегм. - 54; лимф. - 28; Мон. - 4; СОЭ - 19 мм/час. При ревизии систем аппарата обнаружено прорезывание спицами мягких тканей в результате чего произошло нарушение стабильности фиксации костных отломков.

Выполнение в этот же день лабораторное исследование по предлагаемой методике установлено образование следующих диаметров зон торможения роста на газоне тест-культуры:

вокруг диска содержащего 30 мкг моно- мицина - 22 мм

вокруг диска с пробой тканевой жидкости из тканей на уровне верхней опоры аппарата - 12 мм

вокруг дисков с пробами тканевой жидкости из тканей среднего дистального кольца - зоны торможения роста отсутствовали1.

На основании проведенных расчетов по предлагаемому способу уровни обеззараживающей активности в эквиваленте антибиотика мономицина в тканях верхнего кольца составили 16,4 мкг/мл, а в нижней опорной базе - полностью отсутствует, что свидетельствует о явном нарушении благополучного течения остеосинтеза в дисталь- ной опорной базе аппарата и явную тенденцию к нарушению в целом общего течения остеосинтеза на данном этапе лечения больного.

На следующие сутки, в-срочном порядке, больному был произведен перемонтаж аппарата, выполнена новыми спицами коррекция центрации концов отломков и траектории их перемещения по оси сегмента, достигнута стабильная фиксация отломков в обеих опорных базах аппарата.

Через 15 дней после перемонтажа аппарата - признаки воспаления тканей вокруг спиц были купированы. Выполнено очередное лабораторное исследование при котором эквивалент обеззараживающей активности тканевой жидкости из проксимального спицевого канала по мономицину составлял 21,8 мкг/мл, а в нижнем кольце - 15 мкг/мл, что позволяло диагностировать высокий и средний ее уровни при которых течение остеосинтеза происходит без осложнений. Клиническая картина характеризовалась наличием сухих повязок вокруг отверстий спицевых каналов, нормальной температурой, отсутствием болезненности; анализ крови: Эр. - 4.48-1012, Нв - 140 г/л; Цв.п - 0.9: лейкоциты - 7 МО9; Э - 1; пал. - 1; сегм - 64; димф - 34 Мои - 3; СОЭ - 17 мм/ч.

В дальнейшем, до окончания срока выращивания костного регенерата в зоне костногодефектамногократнодиагностировали высокие и средние уровни обеззараживающей активности в обоих опорных базах аппарата что успешно сочеталось с замещением дефекта и купированием остеомиелитического процесса, при благополучном течении остеосинтеза

Предложенный способ обеспечивает возможность оценки течения остеосинтеза 5 на основе объективных показателей уровней обеззараживающей активности тканей.

Данная методика позволяет прогнозировать клиническое течение остеосинтеза.

0 При этом следует иметь ввиду, что показатели обеззараживающей активности тканей в условиях чрескостного остеосинтеза позволяют судить о характере его течения еще до появления конкретных клинических прояв5 лений: болевых ощущений, изменения температуры тела, показателей общего анализа крови, данных локального статуса и рентгенографической картины.

В силу этого, использование предло0 женной методики позволяет клиницисту принимать оперативные меры по предупреждению возможных нежелательных осложнений или констатировать правильность выбранной тактики остеосин5 теза. Более того, количественные показатели уровней обеззараживающей активности тканей, определяемые по настоящей методике, позволяет сделать вывод о том или ином характере течения остеосинтеза еще

0 до получения данных свидетельствующих об явном улучшении или ухудшении - путем сопоставления результатов ранее выполненных исследований и выявления на основании этого тенденции их изменения.

5 Полученные данные свидетельствующие об неблагополучном течении остеосинтеза служат объективным обоснованием для принятия оперативных мер по предотвращению возможных осложнений.

0 Данное положение представляется особенно актуальным если учесть, что в клинической практике, до настоящего времени, процесс течения остеосинтеза, как правило, оценивается по клиническим показателям.

5 Т.е. тогда, когда те или иные осложнения уже имеют место и, естественно, на их устранение необходимо затратить дополнительное время, что не только увеличивает сроки лечения, но и может отрицательно

0 сказываться на его результаты.

В тоже время, полученные с помощью предложенной методики данные, свидетельствующие о благоприятном течении остеосинтеза не только объективно

5 подтверждают правильность выбранной тактики лечения, но и позволяют клиницисту активно воздействовать на лечебный процесс. Зачастую объединять решения нескольких лечебных задач: купирование остеомиелитического процесса как такового,

возмещение дефекта костной ткани, исправление деформации сегмента конечности, что, естественно, сказывается на сокращении сроков лечения.

Полученные данные могут подвергаться математической обработке и построению на этой основе программ компьютерного контроля за течением лечебного процесса при чрескостном остеосинтезе.

Формула изобретения Способ определения бактерицидной активности тканей, включающий зазор биологической пробы на диск фильтровальной бумаги, размещение его на микробном газоне тест-культуры, термостатирование и последующее определение зоны задержки роста тест-культуры вокруг диска с исследуемой пробой, отличающийся тем, что,

с целью повышения точности определения и расширения функциональных возможностей способа для оценки течения остеосин- теза, на микробном газоне дополнительно

размещают контрольный диск, содержащий стандартное количество антибиотика, и после получения соответствующей для данного антибиотика зоны задержки роста тест-культуры определяют в опыте обеззараживающую активность тканей в эквиваленте избранного антибиотика, сопоставляют ее с диапазоном средней терапевтической минимальной подавляющей концентрации данного антибиотика и при

превышении или соответствии этому диапазону судят о высокой бактерицидной актив- ности тканей при чрескостном остеосинтезе, а при снижении или отсутствии - о низкой.

,

Использование: изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в клинической ортопедии и травматологии для лабораторного определения показателей антимикробной активности тканей на этапах лечения методом чрескост- ного остеосинтеза. Целью изобретения является повышение точности определения и расширение функциональных возможностей. Сущность изобретения: методика предусматривает забор тканевых компонентов, помещение их на газон одновременно со стандартным диагностическим диском с антибиотиком и по сопоставлению зон задержки роста тест-культуры определяют уровень бактерицидной активности в эквиваленте антибиотика. Положительный эффект: способ точен и прост в исполнении, не требует наличия дефицитных реактивов или дорогостоящей аппаратуры. Применение способа при чрескостном остеосинтезе является важным лабораторным тестом, подтверждающим условия благополучного течения остеосинтеза. (Л