Способ определения сочетанной активности антибиотиков Советский патент 1992 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано при определении чувствительности бактерий к антимикробным препаратам.

Известен способ определения сочетан- ного действия двух или более антибиотиков на испытуемый микроб путем серийных разведений этих препаратов их сочетаний в плотных или жидких питательных средах.

Однако данный метод лабораторного исследования чрезвычайно трудоемок.

Известен также способ определения со- четанного действия препаратов с помощью

дисков при плоском наложении их на засеянную тест-микробную плотную среду.

Однако, известный способ не позволяет осуществлять количественную оценку соче- танной активности антибиотиков, так как является качественным, ориентировочным.

Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа.

Способ осуществляют следующим образом.

П р и м е р 1. Использованы плотная питательная среда АГВ с толщиной слоя 2 мми тест-микроб Ацинетобактер анитратус, суточную бульонную культуру которого в необходимой для метода дисков концентрач

OJ

о

СП

со

ции наносили на поверхность среды в чашке Петри и избыток отсасывали. Использованы диски с карбенициллином (К), метицилли- ном (М) и гентамицином (0- Указанные диски не накладывали на среду плоско, а устанавливали в нее вертикально на ребро до дна чашки. Сначала устанавливали диск с карбенициллином, затем на расстоянии не менее 1 диск с метициллином, далее (тоже с интервалом) - соединение двух дисков (плоскость к плоскости) - блок карбени- циллин-метициллин (КМ), дальше на некотором расстоянии - диск с гентамицином (Г) и, наконец, блок карбенициллин-ме- тициллин - гентамицин (КМГ). После обычной выдержки чашки при 37°С измеряли величины зон задержки роста от отдельных дисков и их соединений. При этом зоны имели овальную форму, вытянутую вдоль плоскости диска. Именно этот размер зон измеряли вдоль плоскости дисков. Полученные результаты вписывали в табл. 1, вертикальные графы которой отражали последовательность самого опыта, а горизонтальные строки - этапы математической обработки,

После заполнения первой строки таблицы устанавливали вклад каждого препарата в суммарную активность сочетания, представленного соединением дисков (вторая .строка). Так, вклад карбенициллина аактив- ность соединения карбенициллин-метицил- лин равен 12 - 6 + 6 (из общей зоны вычитали зону метициллина), а вклад мети- циляина равен 12 - 13 -1.

Присоединение третьего антибиотика - гентамицина - повысило суммарную активность соединения на величину 14 - 12 +2, Но это лишь дополнительный прирост к имеющейся уже общей активности. Тогда фактическая полная величина вкладка гентамицина определится из алгебраической суммы: +6 - 1 +7.

В третьей строке записывали полную величину вклада каждого антибиотика, т.е. коэффициент его сочетанной активности: +6, -1 и +7.

В последней, четвертой, строке записывали полную комплексную характеристику каждого испытанного препарата - потенциал антибиотика. Последний включал коэффициент сочетанной активности (цифра со знаком) и через запятую величину зоны индивидуальной активности. При этом зону в 6 мм (как у метициллина) считаем нулевой зоной индивидуальной активности. В итоге потенциалы карбенициллина, метициллина и гентамицина выразились соответственно тремя следующими числами: +6,13; -1,0 и +7,14.

Потенциал антибиотика в данных конкретных условиях - величина постоянная и не зависит от того, в какой последовательности ведется опыт, т.е с какого антибиотика начинается и каким заканчивается, но лишь при условии максимальной стандартизации исследования. Знание потенциалов антибиотиков дает возможность сразу без дополнительного исследования количест0 венно оценить активность того или иного сочетания препаратов. Теоретически возможны 3 варианта сочетаний:

1)Целесообразные (допустимые) сочетания активных препаратов (с положитель5 ными потенциалами), здесь возможны индифферентное действие, суммация и си- нэргизм в зависимости от активности сочетаемых препаратов и их соотношения;

2)Нецелесообразные сочетания анти- 0 биотиков-антагонистов (с отрицательными

потенциалами), которые между собой дают индифферентное действие при малой или нулевой индивидуальной активности;

3)Нецелесообразные антагонистиче- 5 ские сочетания антибиотиков с разными по

знаку потенциалами, в которых активные антибиотики инактивируются антибиотиками-антагонистами (не менее, чем в 2 раза). В данном конкретном случае (табл. 1)

0 возможны 1-й и 3-й варианты.

Допустимее .сочетание высокоактивных гентамицина и карбенициллина синэргизма не дает. Малое расхождение (не больше -И) или полное совпадение положительных ко5 эффициентов сочетанной активности таких препаратов дает эффект суммации (при большем расхождении показателей возможно индифферентное действие - маскировка сильным антибиотиком более

0 слабого). Сочетание карбенициллина и гентамицина в обычных дозах дает эффект, больший одной дозы гентамицина, т.е. +7,16, но меньший двойной дозы этого препарата, т.е. +8,17 (удвоение концентрации

5 антибиотика увеличивает на единицу его со- четанную активность и размер зоны задержки роста).

Недопустимы сочетания карбенициллина или гентамицина с метициллином. Анти0 биотик-антагонист с коэффициентом сочетанной активности, равным -1, снижает концентрацию активного препарата в 2 раза и на 1 уменьшает его коэффициент сочетанной активности. Следовательно, потенциал

5 сочетания карбенициллина с метициллином равен; +6,13 - 1,0 +5,12; а гентамицина с метициллином +7,16 - 1,0 +6,15.

В табл. 2 приведены результаты определения активности карбенициллина, метициллина и гентамицина и их сочетаний

методом двухкратных последовательных разведений в жидкой среде (тест-микроб тот же - Ацинетобактер анитратус).

Исходные концентрации антибиотиков соответствовали их содержанию в стандартных дисках промышленного изготовления, следовательно, соотношение доз в сочетаниях не нарушалось. ..Г

Приведенные в табл. 2 результаты подтверждают ранее сделанный вывод о целесообразности (допустимости) сочетания гентамицина С;карбенициллином и о недопустимости сочетания гентамицина с мети- циллином. Минимальное расхождение результатов в рядах объясняется грубостью метода двукратных последовательных разведений (ошибка метода ± 50% плюс нарастающая ошибка переноса).

Проверку результатов, полученных вертикальной установкой дисков, с помощью плоского наложения последних на засеянную среду выполняли в 2 этапа. Сначала определяли величины зон задержки роста, получаемых при плоском наложении отдельных дисков этих антибиотиков. На 2-й день выполняли основной опыт. Диски с активными антибиотиками укладывали на среду на таком расстоянии друг от друга, чтобы их зоны только достигали (или почти достигали) друг друга. Для проверки взаимодействия активного антибиотика с неактивным диск с последним располагали на таком расстоянии от первого, чтобы зона задержки роста от активного препаратаока- залась вблизи диска с неактивным антибиотиком.

В итоге двухсуточного опыта выяснилось, что гентамицин и карбенициллин дают увеличенную, сливную зону задержки роста в месте стыковки их индивидуальных зон. Неактивный метициллин уменьшает радиус зоны активного антибиотика на прилегающей к нему стороне (сплющивает ее).

Пример 2. По. способу, описанному в примере 1, произведено определение соче- танной активности 5 антибиотиков: левоми- цетина (Л), стрептомицина (С) мономицина (М), канамицина (К) и карбенициллина (Кб) по отношению к культуре синегнойной itaЛОЧКИ. .: .: ;.:

В табл. 3 приведены результаты опыта.

В примере 2 возможны все известные варианты сочетаний, но особый интерес представляют два следующих момента:

1) Два антибиотика из одной и той же группы - мономицин и канамицин - при одинаково малой индивидуальной активности показали противоположную активность в сочетаниях, соответственно -4 и -1. Канамицин вместе с левомицётином образует группу антибиотиков-антагонистов.

2) Мономицин при минимальной индивидуальной активности (7 мм) способен по- 5 вышать в 2 раза активность гораздо более активных стрептомицина и карбенициллина в сочетаниях с ними, т.е. проявляет выраженный синэргизм по отношению к ним. Таким образом, по отношению к взятой

0 культуре .синегнойной палочки недопустимы сочетания стрептомицина и карбенициллина с левомицётином и канамицином, а целесообразны их сочетания с мономици- ном, так как потенциал сочетаний во втором

5 случае возрастает благодаря синэргизму: +3,10 + 4,7 +4,11 (абсолютная активность удваивается). Такого же эффекта можно добиться сочетанным применением самих стрептомицина и карбенициллина в резуль0 тате суммации их действия:+3,10+ 3.10 +4,11.. ..

Таким образом, способ вертикальной установки дисков в тонком слое среды (2-2,5 мм), засеянной тест-микробом, позволяет в

5 одном компактном исследовании (до 8 антибиотиков на одной чашке) определить индивидуальную активность, коэффициенты сочетай ной активности испытуемых антибиотиков и рассчитать степень антимикроб0 ной активности их различных сочетаний.

Компактность исследования объясняется рядом моментов. Так. размер зон задержки роста уменьшен по сравнению со способом плоского наложения дисков на ве5 личину диаметра дисков (6 мм), так как диффузия антибиотика идет со всей погруженной в среду части диска, а не с краев его, как при плоском наложении. Сложение активностей происходит не в линей0 ном, а в логарифмическом масштабе (удвоение концентрации увеличивает зону на 1 мм). Отпадает необходимость непосредственного опробования (переборки) всех возможных сочетаний и т.д. На малой

5 площади среды в чашке Петри получается большая и ценная информация, подлежащая дальнейшей математической обработке. Поэтому выполнять такое исследование необходимо тщательно и с максимальным

0 обеспечением стандартности условий: состав и качество среды, толщина слоя, качество дисков и т.д. Сам способ помогает контролировать эту стандартность.

5 Кроме того, предлагаемый способ помогает решить и еще одну важную практическую задачу - кратчайшим путем отыскать способ преодоления антибиотикорезистен- тности возбудителя с помощью суммарного и синэргидного действия препаратов.

Компактность, экономичность способа в плане материальных и трудовых затрат, быстрота выполнения (сама постановка опыта занимает несколько минут), расширенный объем получаемой информации, включающий количественную характеристику сочетаний препаратов, позволяют использовать предлагаемый способ определения сочетанной активности антибиотиков в практической работе медицинских и ветеринарных бактериологов.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я Способ определения сочетанной активности антибиотиков путем посева исследуемой культуры микроорганизма на плотную питательную среду, наложения дисков с испытуемыми антибиотиками на посев, инку0

5

бирования и выявления зон задержки роста микроорганизмов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и упрощения способа, диски с испытуемыми антибиотиками располагают вертикально в слое питательной среды толщиной 2-2,5 мм индивидуально и в виде сочетаний из двух и более дисков с разными антибиотиками, измеряют величины зон задержки роста для индивидуальных дисков и их сочетаний, вычисляют величину изменения антимикробной активности сочетаний дисков за счет каждого дополнительного присоединяемого индивидуального диска и коэффициенты сочетанной активности антибиотика и на основании этих показателей определяют соче- танную активность антибиотиков.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано при определении чувствительности бактерий к антимикробным препаратам. Цель изобретения - повышение точности и упрощение способа. На плотную питательную среду толщиной 2-2,5 мм засевают культуру микроорганизма, затем вертикально устанавливают диски с испытуемыми антибиотиками индивидуально и в виде блока из индивидуальных дисков таким образом, чтобы за каждым индивидуальным диском следовал блок, увеличивающийся на каждый последующий индивидуальный диск с антибиотиком. После инкубирования измеряют величины зон задержки роста у всех испытуемых дисков и их соединений (блоков). На основании полученных данных определяют изменение активности соединений дисков за счет каждого антибиотика, коэффициенты соче- танной активности и затем вычисляют потенциал антибиотика. Потенциал антибиотика позволяет количественно оценить активность того или иного сочетания антибиотических препаратов. 3 табл. сл С

Определение сочетанной активности карбенициллина. метициллина и гентамицинэ

Т а б л и ца 1

20

Та бл ица 2