Способ определения в кормах микотоксина патулина Советский патент 1983 года по МПК A23K1/00 C12Q1/00 C12Q1/02 

СО О) &д Изобретение относится к методам мйсотокснкологических исследований кормов для животных. Известен способ для определения биологически активного патулина, эаключающийся в том, что яультурЬй &qcieeue meg ateHuvn NR.RV, laes ино кулируется жидкая питательная среда ТДГ, состоящая из 0,5 г триптона, 0,25 г дрожжового экстракта и О,1 г глюкозы, растворенных в 1ОО мл дистиллированной воды. Инокулированная среда инкубируется а термостате в Tieчение 15-20 ч. Конечная густота микробных клеток в среде проверяется с помощью спектрофотометра. Коэффициен поглощения (Т при использовании кювет 1 см и длине световой волны 520 должен равняться 7O%.J .В случае, если густота культуры не соответствует эти показателям, ее разбавляют физиологическим раствором. 2% инокулята добавляют в-среду ТДГ, содержащую 1% агара, и разливают ее в чашки Петри по 10 мл. Темперагура ТДГ-агара при введении инокулята должна быть не более БОС. На антибиологические диски размером 6,35 мм наносят растворенный стандарт патулина в количествах %, 3, 5, 10 и 2О мкг, экстракт исследуемог образца яблочного сока или зерна в количествах 1, 5,; 10 мкл, а также20 м растворителя, применяемого для растворения микотоксина патулина и экстраги|рования исследуемых образцов. Диски раскладывают на чашки Петри проводят предварительное преинкубирова ние в термостате при в течение 45 ми а затем инкубируют в термостате при в течение 12-15 ч. Измеряют зо ны задержки, роста культуры раш{ыми количествами стандарта токсина и стро кривую зависимости размера зоны задержки роста культуры от количества внесенного микотоксина. По размеру зо ны задержки зоны роста тест культуры следуемым экстрактом корма определяю количество микотоксина патулина в пробе. Чувствительность дшшого способа к патулину колеблется в пределах от 1,7 до 2,2 мкг токсина, нанесенного иа антибиотический диск. Точность определения микотоксина патулина данным способом сравнима с другими хрюматографическими и спектре графическими способами определения. Коэффидиент корреляции при сравнении этих способов 0,996% Одншсо данный способ не может быть использован как специфический для определения патулина при наличии других антибиотических веществ потому, что применяемый при определении штамм ВаcitRue meQfobeHum NRRU 1368, как и все другие микроорганизмы, чувствителен в равной степени и к аругим антибиотикам и веществам, обладающим антибактериальными свойст,вами. Цель изобретения - повьшение точности определения количества биологически активного патулина в пробе корма, исключение биологического действия других антибиотических веществ, наличие которых возможно в экстракте, и достижение высокой чувствительности при определении. Цель достигается тем, что согласно -.способу определения в нормах микоток-; сина патулина,. включающему экстракцию образца корма гексаном и этилацетатом, пропитку полученным экстрактом антибиотических дисков и их наложение на заселенный тест-микроорганизмом агар, в качестве тест-микроорганизма используется штамм Eciier-icdla coKi М4 Кроме того, для дифференциация патулина от других антибиотических веществ дополнительно проводят хроматографию экстракта и наложение хроматограмм на агар, засеянный указанным тест -микро- организмом Ecbericb a CDd М4. Способ осуществляют следующим образом. Пробу корма двукратно экстрагируют гексаном с последукхцим трехкратным экстрагированием этилацетатом. Этилацетатный экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия и упаривают до получения 1-5 мл и наносят его на стерильные антибиотические диски. Диски с определенным количеством нанесенного экстракта раскладывают на засеянный МПА. Для получения инокулированн(го агара его расплавляют, доводят до50с и вносят взвесь от односуточной культуры EcVier-icViio coCi WV4 (1x10 . микробных тел в 1 мл взвеси) из расчета 1 мл на 1ОО мл МПА. МПА с культурой разливают на горизонтально расположенные бактериологические чашки в количестве по 10 мл 1Ц 1. Диски на среду раскладывают равномерно от края чашки и других дисков. Чашки с разложенными писками вы-. дврвкивают 16-18 ч при . Затем учитывают характер роста E.co6i АА4н сравнивают зоны Зааержки роста культур исследуемым экстрактом с зонами задержек роста чистым препаратом патупина. Патулин наносится на диски в коли честве 0,7, 1,5 и 1О мкг в виде О,1% раствора в этилаце-гате. При обнаружении задержек роста кулъ туры исследуемым экстрактом его наносят в двукратном количестве (начиная с минимального количестве, дающего зону угнетения роста культуры) на хромотографическую пластинку Силуфол UV-254 и разгоняют в системе Б-У (бензол - уксусная кислота 1:3), высушивают, раэ рэзают вдоль хода экстракта пдполам н обе половЕШЫ пластин кладут силикагелем вниз на повервшость инркулированного МПА. Аналогично выдерживают при 37 с. В случае, если вдоль внутренней стор ны хроматограммы обнаружена лишь одна зона задержки роста теcIwкyльтypы, R которой равен стандарту патулина, расчет количества патулина в пробе производят по размеру зон задержки роста исследуемым экстрактом, нанесенным на диски, по формуле V А X В Л -., , - - гI где А - наименьшее количество патулина которое вь зывает образование задержки роста культуры; В объем экстракта пробы; Б - вес испытуемой пробы корма; Г - наименьшее количество экстракта, которое подавляет рост твст-культу1я. Лля большей точности определения количества патулина в испытуемом образце можно строить график зависимости размера зон подавления роста культуры EcbericViio coBi М4 от количества нанес нногч на диск чистого препарата патулина, с помсхдью которого опре деляют количество пагулина в экстракте, нанесенном на антибиотический диск. Если пре оавтографическом проявлении хроматограмм; исследуемого экстракта вдоль внутренней стороны обнаруживается две или более зоны задержки роста культуры, количество патулина определяют по той же формуле, но при 3154 этом учитьшают количество экстракта, нанесенное на хроматограмму А X В Х- т:Г .(2) Б X Г где А - наименьшее количество патулина, нанесенное на хроматограмму, которое вызывает образование зоны задержки роста культуры биоавтографическом проявлении хроматограммы; В - объем экстракта пробы; Б - вес испытуемой пробы Г - наименьшее количество экстракт та, нанесенное на хроматограм му, которое вызывает образование зон задержки культуры при биоавтографкческом проявлении хроматограммы./, , Аналогично количество патулрна мож но определять по графику зависимости э°« подавления роста культуры EcV.eHcViiQ Coei количества нанесенного . «® хроматограмму стандарта патулина. П р и м е р . 5О г сухого измельченного корма экстрагируют двукратно: 1 раз в 100 мл гексана в течение 1 ч, вторично в течение 10 мин 50 мл гексана. Затем пробу высушивают и экстрагиру- ют 2ОО мл этилацетата в течение 1 ч с повторным двукратным экстрагированием по 15 мин с 100 мл этилацетата. Этилацетатные экстракты сливают в одну колбу и выпаривают (лучше под ваку умом притемпературе до ) до обье ма 2 мл и наносят в количестве от 1 до 40 мкл на антибиотические диски. В качестве контроля на диски наносят 0,7, 1, 5 и 10 .мкг патулина в виде О,1% раствора в этилацетате. Диски решноме у но раскладывают на бактериальные чашки с засеянным:. МПА (10 мл МПА на 1 чашку содержащего 0,2 мл взвеси су точной культуры EcVierichio CoCi М4, 1 X микробных тел в 1 мл взвеси. Чашки с дисками вьщерживают в тече ние 16-18 ч в термостате при , после чего учитывают характер роста культуры. При учете размеров зонаа деркки роста, например, подавление роста культуры дисками, содержашими 20 мкл экстракта и выше. Исходя из этого, на хррматографнческу|1 пластинку наносят экстре1кт в количе- стве от 4О до 80 мкл и стандарт пату- лина от 1,4 до Ю мкл. Пластину высу шивают и разгсжяют в системе Б-У. После разгонки пластинки снова высушивают, разрезают по оси, раскладывают силикагелем вниз на аналогично инокулированный МПА и выдерживают в том же температурном режиме. В случае обнаружения на пластинах лишь однсА зоны задержки роста культу. рь1 с Ri , равным патулину, делают расчет патулина в образце корма по разм&рам зон задержки роста культуры иссле.дуемым экстрактом на диске путем построения калибровочного графика или же по формуле (1): 0,V мкг к 2000 мкл 14мкг/г. 50 г X 20 мкл В случае, если обнаружено две зоны задержки роста вдоль внутренней стороны разрезанной хроматограммы, проводят расчет количества патулина в пробе, применяя для этого размеры зон угнетения роста культуры экстрактом, нанесенным на хроматографические пластинки путем построения графика или по форму- ле (2) 1,4 мкг X 2000 мкл Х , 9,33мкг 50 г X 6О мкл Способ определения патулина прост в исполнении и экономичен, позволяет определять биологически активный патулин в количествах 0,7 мкг в грамме корма и выше. Чувствительность способа может быть повышена путем увеличения навески исследуемого образца для экстрагирования, а также увеличением количества экстракта, наносимого на антибиотический диск. Теоретически предельная чувствительность способа - 0,7 мкг на навеску исследуемого образца, что исходит из чувствительности Ес41е с 1а cot 4 -.к о,7 мкг/диск и выше. Цпя исполнения способа определения патулина в кормах для животных не требуется дорогостояших и дефицитных реактивов и питательных сред, исходя из чего ои вполне выполним в любой мико- или химикотоксикологической лабораториях. Применение изобретения в практике ветеринарных лабораторий позволяет своевременно профилактировать патулинотоксикозЫ сельскохозяйственных животных, а также их диагностику на начальной стадии отравления животных.

l.cnOCOB ОПРЕДЕЛЕНИЯ В КОРМАХ МИКОТОКСИНА ПАТУДИНА, включающий экстракцию образца корма гексаном и этвлапётатом, пропитку полученным экстрактом антвбиотяческЕх писков и юс наложение на засеянный тест) Микроорганизмом агар, о т л я чающийся тем, что, с палью повышения чувствительности способа, в качестве тес1 -микроо(ганизма испот зуют штамм EcViericVua . Способ по п. 1, о т л в ч а ш и и с я тем, что, с целью двфферевциации патулина в других антибиотических веществ, дополнительно .проводят хроматографию экстракта и валожеине хроматеграмм на arapi э&сеянный указанным тест микроорганизмом EcVieHcl iQ coti М4