Штамм бактерий BacILLUS SpecIeS - деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений Советский патент 1992 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки морской и пресной воды .от нефтяных и фенольных загрязнений.

Известен штамм Streptomyces albo- axiales С, используемый для очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктов.

Штамм способен окислять нефть и вазелиновое масло на высокоминерализованных средах при повышенных температурах культивирования в пределах 60 сут.

Наиболее близким к заявляемому является Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм осуществляет деградацию нефти остаточной замазученности и может быть использован при очистке воды и почвы от загрязнений нефтепродуктами.

Недостатком указанного штамма является невысокая скорость роста Pseudomonas putida 36, т.к. максимальная плотность 1,5 х 10 кл/мл штамма Pseudomonas putida 36 достигает только на 5-е - 6-е

сутки. Повышенная температура культивирования (30°С) усложняют применение штамма Pseudomonas putida 36 в полевых и производственных условиях для очистки воды и почвы. Длительность процесса деградации нефти Pseudomonas putida 36 - 30 сут. Количество нефти, утилизированной за это время, достигает 68,4-74,5% - это составляет невысокий уровень утилизации. Неспособность штамма Pseudomonas putida 36 расти при 4°С и невозможность его использовать при очистке воды и почвы в холодных районах,

Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, обладающего высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводород- и фенолсодер- жащих соединений в сильно минерализованных средах,

Поставленная цель достигается тем, что Bacillus species 205 - 1/0 обладает способностью использовать, в качестве источника питания и энергии, дизельное топливо, гек- сан, бензол и фенол, окислять углеводороды

сл

с

XJ

оо

-N сл

ю ю

и фенолы при широком диапазоне их концентрации.

Анализ предлагаемого технического решения на критерий существенное отличие показал, что штамм Bacillus species 205 - 1 /0 является наиболее активным деструктором нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений и может быть использован в нефтеперерабатывающей промышленности для очистки сточных вод, содержащих нефтепродукты и фенрл. Следовательно, техническое решение соответствует критерию существенные отличия.

Штамм Bacillus-species 205-1/0 выделен из морской воды Южно-Сахалинского побережья научно-исследовательской экспедицией в 1988 году и задепонирован ВКПМ соответственно под № В-5467.

Штамм выявлен экспресс-методом индикации на стандарт-индикаторной среде СИ, позволяющей эффективно выделять штаммы бактерий-деструкторов различных загрязнителей из природной среды (пример

1).

Новый штамм Bacillus species 205-1/0 получен методом накопительной культуры, т.е. многократным пересевом на жидкую минеральную среду МА-1 (предложенную Моисеевой Л.В и Н.Г.Астротвой) с нефтепродуктами - дизельное топливо, гексан, бензол и фенол.

Выращивание проводили в колбах на качалках (110 об/мин). Обьем среды 200 мл, концентрация нефтепродуктов и фенола 1%.

Полученный штамм бактерий Bacillus species 205-1/0 депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-4567 и штамм Bacillus species ВКПМ В-5467 характеризуется следующими культурально-мор- фологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой гр+, подвижные, перитрихиальное жгутование, спорообразующие палочки, размером 1,0- 1,5 х 0,6-0,8 мкм, образует термоустойчивые эндоспоры - размер 0,8 х 0,5 мкм. МПА (28°С, 48 ч) образуют плотные белые колонии, потом становятся бурые, пигмент проникает в субстрат, окрашивает его в соответствующий Цвет. Образование пигмента происходит от края к средней части, колонии гладкая блестящая. МПБ (28°С, 48 ч - образует пленку и муть. Агаризованная среда Кинга - образует пигмент коричнево- бурого цвета. Синтетическая среда на морской воде (28°С, 48 ч) образует мелкие серовато-белые колонии диаметром 1,5-2.3

мм. Колонии на твердых агаризованных средах не ослизняются в течение 30 дней.

Физиолого-биохимические признаки Факультативный анаэроб. Температурный диапазон роста в пределах +4 + 43,5°С, оптимум температуры - 27°С. Оптимум рН - 7,0-7,2. Рост при 7% NaCI. Желатину разжижает; крахмал гидролизует; нитраты восста- навливает до нитритов; индол, сероводород, аммиак не образует. Катала- зоположительные. Липолитическая активность - отрицательная. Лецитиназная - вариабильна. Реакция Фогес-Проскауэра - положительная. Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет с образованием кислоты на глюкозе, арабинозе, манните, ксилозе.

Штамм хранится на агаризованной среде МА-1 следующего состава (г/л): Вода водопроводная1 л

МПА30 г

КМОз1 г

NaHP041 г

NaCI1,5 г

d,l, а -/ -аланин1 у/мл

Дестибиотин1 у/мл

рН7,0-7,2

В качестве источника углерода вносится 1 % нефтепродуктов или фенола. Хранят под слоем стерильного вазелинового масла, пересев 2 раза в 4 года.

В табл.1 представлены данные по влиянию различных антибиотиков на штамм Bacillus species ВКПМ В-5467. Штамм Bacillus species ВКПМ В-5467

идентифицирован по определителю Верги (1974) какк разновидность группы Bacillus. П р и м е р 1. Экспресс-метод индикации бактерий-деструкторов углеводород- и фенолсодержащих соединений.

Приготовление стандартно-индикаторной среды осуществляют путем смешивания агар-агара-с синтетической средой (МА-1) и добавлением дибромтимосульфофталеином (1 мг в 1 мл 96° спирта и 1 капля глицерина) + продукт метаболизма тест-культуры Bacillus species 13a. Тест-культура получена на жидкой синтетической среде МА-1 на 16 сутки культивирования при температуре 25- 27°С. Подвержена тепловой обработке методом 3-х разовой пастеризации с последующей фильтрацией. Добавляется fi- аланин, необходимый для роста в среде бактерий-деструкторов нефти, нефтепродуктов и фенола.

Состав индикаторной среды (г/л): Водопроводная вода1 л

Агар-агар20 г

Индикатор1 мл

метаболизма

15 мл 1 г 1 г

1 у/ мл 7,0-7,2 5

Стерильную индикаторную среду разливают в пластмассовые бакпечатки в количестве 10 мл. На остывшую поверхность среды накладывают бумажные диски, пропитанные нефтью, нефтепродуктами или высокотоксичными соединениями типа фенола. Среда может храниться в течение 3 месяцев при температуре +3 +15°С. На подготовленную т.о. поверхность наносят пробы морской или пресной воды в количестве 0,1 мл, оставляют при температуре 18-25°С в течение 12-24 ч. По изменению цвета среды первоначального желто-соломенного цвета в интенсивный темно-зеленый - судят о наличии бактерий-деструкторов, способ- ных расти в присутствии углеродсодержа- щих и фенольных соединений.

Полученные штаммы бактерий-деструкторов очищают путем многократных пересевов на твердой синтетической среде МА-1.

Штамм проверятся на деструктивную активность и способность разлагать дизельное топливо, гексан, бутанол, фенол.

П р и м е р 2. Микробная деструкция дизельного топлива осуществляется штам- MOM Bacillus species ВКПМ В-5467 на морской среде следующего состава:

Морская соль2%

(аммоний

хлористый)1 г/л

Калий фосфорнокислый

двузамещенный К2НРСм , или (МааНРСм1 г/л

Дестибиотин0,001% или

Дрожжевой экстракт 1 мл/л

Вода водопроводная 1 л

рН7,2-7,5

1

В качестве субстрата для деструкции вводили: дизельное топливо в количестве 500 мг/л, 250 мг/л, 150 мг/л, 100 мг/л, 50 мг/л, 1050 мг/л

рН среды регулировали 10% раствором NaOH. Деструкцию проводили штаммом Bacillus species ВКПМ В-5467 на, носителе перлит фильтровальный (ТУ-21-3144-82) в количестве 10 г/л

В колбы объемом 1 л вводили морскую среду - 500 мл, бактерии носитель вводили одновременно. Колбы помещали в первые 6 часов на качалки 100-120 об/мин.

Последующее культивирование осуществляли в стационарных условиях при 18°С Результаты деструкции учитывались через 24, 48, 72 и 120 ч, методом количественного определения.г Результаты представлены в табл.2.

Таким образом, скорость микробной деструкции дизельного топлива штаммом Bacillus species 50 мг в сутки. Результаты микробного разложения бензола приведены в примере 3.

П р и м е р 3. При микробной деструкции бензола готовили раствор морской воды вышеприведенного состава (пример 2).

Бензол в качестве субстрата вводили в количестве 500 мг, 250 мг, 150 мг, 100 мг, 50 мг и 1050 мг/л. Результаты деструкции учитывали через 24, 48, 72 и 120 ч. Результаты представлены в табл.3.

Таким образом, скорость микробной деструкции бензола составляла 100 мг в сутки

П р и м е р 4. Микробную деструкцию в комплексе гексан + фенол осуществляли способом, описанным в примере 1. Гексан + фенол в качестве субстрата для деструкции, вводили в соотношении 1:1 в количестве 250 мг/л, 150 мг/л 50 мг/л и 25 мг/л.

Результаты деструкции учитывали через 3, 5, 8, 10 и 16 суток, методом количественного определения субстрата. Результаты представлены в табл.4.

Таким образом, скорость микробной деструкции гексана + фенола составляла 100 мг за 8 сут.

Сопоставив приведенные примеры можно сделать вывод, что использование предлагаемого штамма Bacillus species ВКПМ В-5467 позволяет осуществлять деструкцию дизельного топлива со скоростью 50 мг в -сутки, бензола - 100 мг в сутки, гексан + фенол - 100 мг за 8 сут на 98-100% в морской воде

Применение предлагаемого штамма Bacillus species ВКПМ В-5467 увеличит эффективность очистки от нефтепродуктов и фенола в условиях реального производства

Формула изобретения

Штамм бактерии Bacillus species ВКПМ В-5467 - деструктор нефтепродуктов и фе- нолсодержащмх соединений.

Таблица 1

Использование: очистка воды от нефтяных и фенольных загрязнений. Сущность: штамм бактерий Bacllfus species депонирован под номером ВКПМ В-5467. Штамм способен разрушать на 98-100% нефтепродукты и фенолсодержащие соединения в морской среде, 4 табл.

Таблица-2

Микробная деструкция штаммом Bacillus species

ВКПМ В-5467 дизельного топлива в морской воде

/периодических условиях/

Микробная деструкция бензола в морской воде штаммом Bacillus species ВКПМ В-5467 /периодическое культивирование/

Микробная деструкция гексана и фенола штаммом

Bacillus species ВКПМ В-5467 в морской воде

/при периодическом культивировании/

Редактор Т.Горячева

Составитель Н.Асторова Техред М.Моргентая

Заказ 4346

Тираж

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 1113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Таблица 3

Таблица 4

Корректор Е.Папп

Подписное