Способ получения диплоидных апомиктов табака душистого Советский патент 1993 года по МПК A01H1/06 

Изобретение относится к биологии, а именно к прикладной генетике, и может быть использовано в селекции и в цветоводстве для получения диплоидных эпомиктов материнского происхождения у цветковых растений с целью их дальнейшего использования в качестве исходного материала для создания высокогомозиготных, или чистых линий, а также сортовыведения.

Важной задачей современной генетики и селекции цветковых растений и, в частности табака, является разработка быстрого, простого и эффективного метода получения высокогомозиготных растений, который заменил бы широко применяющийся в настоящее время метод продолжительного инбридинга в ряде поколений из-за его значительной трудоемкости. В этой связи наиболее перспективен метод индуцированного диплоидного партеногенеза, позволяющий получать генетически устойчивые растения с удвоенным мат еринским гено- мом, которые не подвержены генетическому расщеплению в дочерних поколениях. Диплоидные апомикты могут быть сразу включены в процессе семенного размножения для производства чистых линий и сорто- выведения. Однако, существующие в настоящее время способы получения апо- миктов цветковых растений не позволяют одноэтапно получать диплоидные апомикты материнского происхождения.

Известен способ, согласно которому получение диплоидных апомиктов материнского происхождения у табака осуществляется в два этапа. В начале в результате

XJ

со

xj

00

|оо ел

самоопыления гамма-облученной в дозе 7 Гр пыльцой получают гаплоидные семена, а затем путем колхицинирования по методу переводят эти семена на диплоидный уровень.

Метод имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, это необходимость проведения скрининга полученного семенного потомства с целью выявления гаплоидных семян. Во-вторых, потребность вдиплоиди- зации семян при помощи высокотоксичного ядохимиката колхицина, что сопряжено с опасностью в работе и трудозатратами на отработку методики колхицинирования.

Известен способ прямого получения диплоидных апомиктов табака-путем опыления гамма-облученной в дозе 200 Гр пыльцой. Основным недостатком метода является возможность его применения только к табаку-махорке и очень низкий выход диплоидных апомиктных семя.н (2 семени на 10 опылений).

Известен способ получения диплоидных апомиктов табака с помощью культуры ткани при культивировании микроспор и последующего перевода гаплоидных проростков на диплоидный уровень колхицинированием. Метод имеет ряд недостатков, которые связаны с большими денежными и временными затратами на получение гаплоидных проростков в искусственных условиях, необходимостью прове- дения скрининга потомства с целью идентификации гаплоидов среди анеуплои- дов. Кроме того, сохраняется определенная опасность в работе из-за использования колхицина для целей диплоидизации. Полученные диплоидныё апомикты имеют, однако, не материнское, а отцовское происхождение.

Наиболее близким по технической сущности из известных способов получения диплоидных материнских апомиктов является способ.

Согласно этому способу получение ди- гаплоидов производится поэтапно. Сначала получают гаплоиды в результате опыления растений смесью пыльцы, состоящей из собственной, облученной в дозе 1000 Гр, и чужеродной, взятой с растений другого вида этого же рода, которые проявляли перекрестную межвидовую несовместимость в пестике с опыляемым растением, причем объединение геномов в гибриде не препятствовало эмбриональному развитию. Цель достигалась применением в опылении сме- си пыльцы, где отношение облученного и необлученного компонентов было 4:1. Метод был успешно апробирован только на

тополях. После получения семенного потомства и проведения скрииинга на присутствие гаплоидов выявленные гаплоиды обрабатывали колхицином и получали диплоиды.

Настоящий метод не требует использования техники культуры ткани и позволяет получать апомикты непосредственно в опылении. Однако настоящий способ обладает

недостатками, которые лимитируют его повсеместное применение, поскольку он не является прямым и не позволяет сразу получать диплоидныё апомикты уже в опылении, что обусловливает необходимость

последующего использования в работе опасного ядохимиката колхицина.

Целью изобретения является одноэтап- ное, или прямое, получение диплоидных семян материнского происхождения у

цветковых растений, например, табака душистого, в результате проведения опыления пыльцесмесью из собственной облученной и чужеродной несовместимой, но жизнеспособной пыльцы.

Указанная цель достигается тем, что в

известном способе получения материнских

апомиктов, включающем сбор пыльцы с

пыльников, ее высушивание в комнатных

условиях, облучение гамма радиацией Со60

в дозе 1000 Гр/с и смешивании с предварительно высушенной таким же образом, но необлученной пыльцой петунии гибридной в равных соотношениях. Отличительным признаком заявляемого способа является

режим проведения опыления пыльцесмесью, а которой компоненты берутся в равных соотношениях, а необлученная пыльца в данной системе опыления проявляла как пестичную, так и зиготическую несовместймость. Последнее сказывалось на полной невозможности образования семян посредством амфимиксиса из-за расщепления геномов у гибридов и постепенной элеминаций хромосом, что приводило к ранней гибели гибридных зародышей,

Облучение собственной пыльцы душистого табака в дозе 1000 Тр при мощности 0,2 Гр.с лишало ее оплодотворяющей способности, что гарантировало отсутствие об- разования жизнеспособных .семян вследствие самооплодотворения. Использование способа позволяет избежать применение колхицина, а также временных и

трудовых затрат на перевод гаплоидных растений на дигаплоидный уровень и дает ряд дополнительных преимуществ, которые будут раскрыты ниже.

Способ осуществляют следующим образом.

Собирают пыльники табака и петунии перед началом энтезиса, т.е. перед самым раскрытием, помещают в чашки Петри на 30 ч при температуре 26°С. Путем быстрого ручного перемещения чашек Петри в разные стороны производят отделение пыльцы от пыльниковой ткани, после чего высушенную пыльцу переносят в закрытые бюксы и хранят при -20°С.

Пыльцу табака душистого перед опылением облучают в закрытых бюксэх при температуре 20°С гамма-лучами Со при мощности дозы 0,2 Гр/с в дозе 1000 Гр. После облучения производят смешивание равных частей облученной пыльцы табака душистого с необлученной пыльцой петунии гибридной. Полученной смесью опыляют растения табака душистого, причем предварительную кастрацию растений проводят за 1-2 дня до опыления, когда на них одевают изоляторы. Облучение и опыление проводят в утренние часы. Для удобства применения способа возможно также временное хранение облученной пыльцы сроком до двух суток в холодильнике при -20°С. После проведения опыления на растения снова одевают изоляторы, которые затем снимают через 10 дней. Полученные в опылениях семена оставляют храниться в,комнатных условиях в бумажных пакетиках сроком на 1 мес. После этого семена проращивают на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при 25 °С. Проросшие семени переносят в горшки с почвой, т.е. непосредственно в условия почвенной культуры.

Сущность заявляемого способа можно проиллюстрировать таблицей, в которой раскрыто влияние режима опыления и состава пыльцесмеси на образование дипло- идных апомиктов табака душистого.

Пример.С растений табака душистого и петунии гибридной собирали пыльники перед началом антезиса и помещали в чашки Петри в условиях комнатной температуры и 60%-ной влажности воздуха на 30 ч. После этого с помощью ручного перемещения чашек Петри из стороны в сторону обеспечивали отсоединение пыльцы от пыльниковой ткани и ее концентрированна у края чашки, что облегчало сбор пыльцы и ее перенос с помощью скальпеля в бюкеы.

Пыльцу табака душистого облучали гамма-радиацией Со60 в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с в течение 83 мин 10 с, а затем смешивали уже облученную пыльцу с равным количеством необлученной нормальной пыльцы петунии гибридной. Смесь хорошо перемешивали, а затем использовали для опыления предварительно кастрированных за 1-2 дня до этого цветков табака

душистого. Кастрированные цветки табака размещали под изоляторами, которые снимали лишь спустя 10 дней после опыления, Из собранных плодов вытрушивали семена 5 и помещали их в бумажные пакетики. После хранения в течение 1 мес семена проращивали в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге при температуре 25°С. Проросшие семена переносили затем в ус0 ловия почвенной культуры в горшки, набитые землей, и все размещали в теплице.

Таким образом, удалось вырастить полноценные растения, фенотипически идентичные материнским. Как видно из таблицы,

5 проведение опыления пыльцесмесыо (1:1), которая состояла из равных количеств сла- , тающих ее компонентов, позволяет получить стабильное плодообразование, сопровождающееся появлением семян раз0 ных типов - нормальных с Зародышем и эндоспермом; фенотипически нормальных, но пустых из-за деградации эмбриональных тканей, а также полностью разрушенных семян. Кроме того, встречались и абортивные

5 семена с остатками зародыша или эндосперма. В среднем в опылении образовывалось до 8 нормальных диплоидных семян, имеющих апомиктное происхождение. Сравнительно низкий показатель всхоже0 ста семян указывает на присутствие в семенном потомстве после опыления высокого процента пустых семян с деградировавшими зародышевыми тканями.

П р и м е р 2. Сбор пыльцы петунии

5 гибридной и табака душистого проводили по методике, описанной в примере 1. Высушенную пыльцу табака облучали в закрытых бюксах при температуре 20°С гамма-радиацией Со в дозе 1000 Гр при мощности

0 0,2 Гр/с. Затем сразу готовили пыльцес- месь (4:1) путем смешивания 4 ч. облученной пыльцы табака с 1 ч пыльцы петунии гибридной, Этой пыльцесмесыо проводили опыление предварительно кастрированных

5 за 1-2 дня до опыления цветков табака душистого, помещенных под изоляторы. После появления плодов изоляторы убирали, Собранные семена выдерживали в течение месяца в бумажных пакетиках с целью мак0 симальной активации их прорастающей способности. Проращивание семян проводили на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 25°С. Проросшие семена переносили в условия по5 чвенной культуры в горшки с землей и таким образом получали зрелое растение. Как видно из таблицы, в данном варианте опыления наблюдается некоторое снижение плодо- образования до 95%, которое сочетается с

резким падением показателя семяобрэзования в б раз по сравнению с получаемым в опылениях пыльцесмесью типа (1:1). В плодах в основном преобладали разрушенные, пустые и абортивные семена, хотя было получено и значительное количество нормальных семян, способных к прорастанию и давших начало диплоидным апомиктным растениям. По этой причине всхожесть семян снизилась до 3%.

П р и м е р 3. Сбор пыльцы петунии и табака, а также облучение пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1. Для опыления готовили пыльцес- месь из 2 ч. облученной в дозе 1000 Гр пыльцы табака и одной части пыльцы петунии. Опыление, а также проращивание полученных семян проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена переносили в горшки с почвой, которые устанавливали в теплице, что обеспечивало в дальнейшем по. учение сдвоенных растений, являющихся исключительно диплоид- ными апомиктами. Как видно из таблицы, плодообразование в опылениях достигало 98% и сопровождалось появлением в некоторых случаях до 30 семян в плоде. В то же время в семенном потомстве преобладали пустые и абортивные семена, способные лишь к спорадическому кратковременному прорастанию без последующего развития проростка в растение. Всего в опылениях было получено до 70 полноценных семян, что определило средний показатель выхода диплоидныхапомиктов в пределах 2 на опыление.

П р и м е р 4. Сбор пыльцы петунии и табака, а также облучение п шьцы табака проводили по методике примера 1. Пыль- цесмесь типа (1:2) для опыления готовили из одной части облученной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и 2 ч. пыльцы петунии гибридной. Опыление кастрированных растений табака душистого, а также сбор и проращивание семян полученных в опылениях; проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена затем доводили до стадии зрелого растения путёмтперёнбса в НЬчвённую культуру в горшки с землей, размещенные в теплице. Как видно из таблицы, изменение соотношения компонентов пыльцесмеси в сторону нео- бл учённогб несовместимого компонента привело к снижению плодообраэования до 80%, а также к заметному падению количественного содержания семян в плодах в среднем до 4 на плод. Низкий уровень семя- образования, однако, сочетался с общей вы- сокой всхожестью семян, которая отражала присутствие в семенном потомстве большого процента полноценных семян. Это обеспечило сравнительно высокий показатель выхода диплоидных апомиктов в опылении, в среднем равный 1.

Пример 5. Сбор пыльцы петунии и

табака, а также гамма-облучение пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1. Для опыления готовили пыльцес- месь типа (1:4), состоящую из 1 ч. обученной в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с

пыльцы табака и 4 ч. пыльцы петунии гибридной. Опыление растений табакз, а также сбор и проращивание полученных в опылении семян проводили по методике, описанной в примере 1. Проросшие семена

высаживали в горшки с почвой, которые затем выставляли в теплицу, Как видно из таблицы, опыление пыльцесмесью типа (1:4) обусловило снижение плодообразования до 67% при одновременном уменьшении среднего количества семян в плодах до 2. Как оказалось, все семена были пустыми или сильно абортивными, что не позволило получить ни проростков, ни зрелых растений. П р и м е р 6. Сбор пыльцы табака проводили по методике, описанной в примере 1. После этого ее облучали гамма-радиацией Со60 в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с в закрытых бюксах при температуре 20°С. Опыление кастрированных растений табака

собственной облученной пыльцой проводили в утренние часы. Семена проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашках Петри при температуре 26°С. Как видно из таблицы для этого варианта опылений (тип

пыльцесмеси 1:0), жизнеспособных семян в опылениях получено не было.

Пример, Сбор пыльцы петунии гибридной проводили путем помещения пыльников перед их раскрытием в чашки

Петри на 30 ч при температуре 2б°С. С помощью ручного перемещения в чашках Петри вытрушивали пыльцу из раскрывшихся пыльников, а затем уже скальпелем ее переносили в закрытые бюксы, Опыляли такой

пыльцой кастрированные цветки табака душистого. Как оказалось (см.табл.; тип пыльцесмеси 0:1) в опылениях не было получено ни плодов, ни семян, что указывает на блокирование роста пыльцевых трубок петунии

0 в пестике табака из-за существования межродовой инконгруиции, обусловленной различиями в длинах пестиков у петунии и табака.

Таким образом, использование заявля5 емого способа получения диплоидных апомиктов у цветковых растений по сравнению с прототипом обеспечивает получение диплоидных апомиктов в выращенном растительном потомстве. Только использование смеси пыльцы типа (1:1) из собственной гамма-облученной е дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и необлученной нормальной пыльцы петунии гибридной, для которой характерно проявление межродовой инконгруиции в пестике табака, обеспечи-. вает достижение намеченной цели, а изменение пропорции компонентов пыльцесмеси влечет резкое эффективности способа, что было продемонст- рировано примерами. Появление диплоидных апомиктов табака обеспечивается тем, что пыльцевые трубки гаммз-облу- ченной в дозе 1000 Гр пыльцы табака в процессе самоопыления проникают не во все семяпочки, В этом случае создаются предпосылки для индукций партеногенеза в некоторых интактных семяпочках растущей сзади пыльцой петунии. В случае же осуществления межродового амфимиксиса образование полноценных семян невозможно из-за появления межродовой зиготической несовместимости геномов, ведущей к деструктивным процессам и гибели эмбрио- идов. В этой связи появление жизнеспособных семян в опылениях может иметь место только благодаря их партеноге- нетическому происхождению. Изменение соотношения компонентов в пыльцесмеси в сторону увеличения облученной пыльцы /(2:1) и (4:1)/ приводит к снижению вероятности проникновения пыльцевых трубок петунии гибридной в область семязачатков, что, в свою очередь, влечет уменьшение потока веществ-индукторов партеногенеза в семяпочки. Последнее негативно сказывается на эффективности опыления и выходе диплоидных апомиктов. В тоже время изменение соотношения компонентов в пыльцесмеси в сторону уменьшения облученной пыльцы /(1:2) и (1:4)/ также обусловливало снижение концентрации пыльцевых трубок петунии гибридной вблизи отдельного се- мязачатка, что было вызвано как ослаблени- ем менторного эффекта со стороны облученной пыльцы табака, так и увеличением количества интактных семяпочек вследствие уменьшения стерилизующего эффекта облученной пыльцы на зародышевые мешки.

Использование заявляемого способа позволит получить специалистам-селекционерам целый ряд преимуществ по сравнению с прототипом: во-первых это разработка режима опыления, обеспечивающего одноэтапное получение диплоидных материнских апомиктов непосредственно в процессе опыления пыльцесмесью, состоящей из равных частей собственной облуче н- ной в дозе 1000 Гр при мощности 0,2 Гр/с пыльцы табака и пыльцы петунии гибридной, растения другого рода семейства пасленовых. Во-вторых, это полный отказ от применения в экспериментальной работе ядохимиката колхицина. В-третьих - это ис- 5 пользование жесткого традиционного режима культивирования семян, который обеспечивает стопроцентный выход диплоидных апомиктов в выращенном растительном потомстве. В-четвертых, это

0 значительная экономия времени из-за отсутствия необходимости в проведении цитологического скринйнга семян и выращенных растений в отношении плойд- ности генома. В-пятых, это существенное

5 уменьшение денежных расходов ввиду полного отказа от использования техники культуры ткани, а следовательно, дорогостоящего оборудования и реактивов. В-шестых, это значительное в 30-50 раз повышение выхода

0 апомиктных семян в опылениях.

Предлагаемый способ при сравнении его с прототипом позволяет добиться значи-. тельного уменьшения абортивных семян в опылениях при одновременном увеличений

5 числа нормальных семян, которые имеют партеногенетическое происхождение и обладают высокой всхожестью. Выбор в качестве второго компонента пыльцесмеси пыльцы петунии гибридной, доля которой

0 характерно проявление межродовой инкон- груиции в комбинации с душистым табаком, а также зиготической несовместимости родительских геномов, позволяет избежать появления в потомстве семян гибридного

5 происхождения. Последнее условие обеспечивает 100% выход диплоидных апомиктов душистого табака в растительном потомстве, выращенном в условиях традиционного высевания семян в почву. Способ гаранти0 рует появление диплоидных апомиктов материнского происхождения в семенном потомстве после опыления.

Заявляемый способ воспроизводим, не требует от селекционера специального обу5 чения, может использоваться в теплице и в открытом грунте.

Применение способа наиболее целесообразно производить опылением пыльцесмесью, состоящей из равных частей

0 гамма-облученной в дозе 1000 Гр при мощности дозы 0,2 Гр/с пыльцой табака душистого и нормальной пыльцы петунии гибридной, поскольку за пределами ;этого соотношения наблюдается резкое сниже5 ние эффективности опылений пыльцесмеся- ми с целью получения диплоидных апомиктов.

Стоимость полученных заявляемым способом семян понижается более чем в 50 раз по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

Способ получения диплоидных апомик- тов табака душистого, включающий сбор пыльцы, облучение ее гамма-радиацией в дозе 1000 Гр и опыление пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу и необлученную пыльцу таксОномически близких растений, отличающийся тем, что. с целью прямого получения диплоидных семян, опыление проводят пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу табака душистого и необлученную пыльцу петунии гибридной в соотношении 1:1.

Использование: биотехнология, цветоводство, мутагенез. Сущность изобретения: диплоидные апомикты табака душистого получают прямым путем при опылении материнских растений пыльцесмесью, содержащей облученную пыльцу табака душистого и i необлученную пыльцу петунии гибридной в соотношении 1:1.1 табл. СО С