Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение может быть использовано для получения полинуклеотидов и зондов, которые могут найти применение в спорах при установлении отцовства или в судебной медицине, или с целью предотвращения, диагностики и лечения генетических расстройств или предрасположен ностей.

Описаны различные ДНК-последовательности, которые могут быть использованы в качестве зондов для полиморфизма человеческого и животного гономов.

Настоящее изобретение основано на обнаружении того, что могут быть получены полинуклеотиды и полинуклеотидные зонды, каждый из которых является специфиче- ским для одного единственного информативного генетического участка.

До настоящего времени было известно весьма ограниченное число ГиПёрвариа- бельных областей в человеческой ДНК, к ним относятся минисателлиты: 5 ген инсулина, 3-ген с-На- ZasL, ген коллагена типа II и между генами глобина и 1, а также

участок D 14 S 1, определенный безымянным клоном ДНК, полученным из теломер- ной области длинного плеча хромосомы 14. Это минисателлиты существенно отличаются друг от друга своей вариабельностью, которая заключена в одном случае только в 6 различных аллелях, обнаруженных в ги- первариабельной области коллагена, а в других их число превышает 80, как, например, в случае области D 14 S 1. Общее число гипервариабельных областей в человеческом геноме пока не известно, но вероятнее всего, оно большое. В действительности, человеческий геном может содержа т ь по крайней мере 1500 гипервариабельных. областей.

Установлено, что можно клонировать ДНК-фрагмент, идентифицированный при помощи гибридизации фрагментов геномной ДНК с полинуклеотидным зондом, способным дифференцировать ДНК при помощи сравнения с более чем одной полиморфной минисателлитной областью ИЛУ

Ё

VI

00

00

о VI о

со

гипервариабельным участком, например, с использованием зондов 33,6 и 33,15, которые были предложены и описаны в ветше- упом я ну то и зая (ev и получить из. него полинуклеотид или зонд, способный к гиб- ридизации с ДНК-фрагментом, который содержит минисателлит, кото рый являётс я специфичным относительно определенной области или участка на геноме; вышеупомянутая область или участок и представляет собой информативный генетический участок. В настоящем изобретенйи:исдользован информативный генетический частЬк как участок, в котором можно выявить по крайней мере 3 различных аллеля в любой пробе из 100 случайно выбранных индиви; дов. Этот факт заключается в том что участок (область) имеет аллельную вариацию не менее 3. Существенным здесь является то, что проба из 100,500 или 1000 индивидов действительно, подбирается случайно, так как обычно вполне во-Зможно идёйтифйци- ровать 100, 500 или 1000 индивидов , кото- рые имеют менее 3 аллелей -в данной информативной генетической области при помощи просеивания достаточно большого количества членов общей популяции;

Уем выше этот полиморфизм в данной информативной генетической области, тем более эффективным и информативным бу- дет специфический зонд для этой области при идентификации индивида с целью установления отцовства или судебной эксперти- ,зы.

Относительно применений к человеку настоящего изобретения выражение информативный генетический участок, как оно здесь используется, может быть опрёделено как область, в которой можно разлйчить по крайней мере 3 аллеля в ДНК| экстрагированной .из любых 20 линий кле- ток из списка, приведённого ниже. Эти ли- нии- клеток сданы на хранение в Американское собрание типов культур (АТСС): .,.,.,.,.-.,: s/ , -::..

.

-... . :..-,

003)

НОМЕР КУЛЬТУРЫ В ATGC- CCL2 CCL 30 GCL54 :-- CCL 65 v CCL 66 CCL 72 -- CCL 75 ; : CCL 76 :1 - CCL 85 CCL 83 CCL 87 .- CCL95

5 10 3 15 0 5

0

5 : 0 5

, 1

6

5

Detroit 55,1.:

RPMI6666.:

RPMI7666 .

CCRF-CEM

CCRF-SB

HT-1080

HG-261

CHP3(M.W.)

LL47 (MaDo)

HEL299

M-24

HFUf ; ч

Wi-ТбоЗ

MRC-5 IMR-90 LS 174T TL86(LeSa) LL 97A (AIMy) HLF-a CCD-13Lu CCD-8LU CCD-11lu CCD-14Br CCD-16Lu CCD-18Lu CCD-19Lu

CQL 1 ГО rv

:,. VCCL Tt

CCL 114 /,::

cct ffg 7

CCL 120 CCL 121 CCL 122 . CCL 132 CCL 135 CCL 137 CCL 151

5 CCL 153 CCL 154 CCL. 171 CCL 186 CCL 188 CCL 190 CCL 191 CCL 199 CCL200 CCL 201 CCL 202 CCL 203 - CCL 204 . CCL 205 ; CCL210

Приведенные выше линии клеток можно получить из АТСС, 12301 Паклаун Драйв, Роквилл , Мерилэнд 20852-1776, США, а их список имеется в каталоге АТСС линий клеток и гибридов. Все вышеупомянутые линии клеток сданы на хранение в АТСС по 1985 г.

Таким образом, настоящее изобретение использует минисателлит, который является специфическим относительно определённой области или участка в геноме, имеет аллельную вариацию, равную не менее 3. Изобретение включает клонирование фрагмента ДНК, идентифицированного при помощи гибридизации фрагментов геном- ной ДНК с полинуклеотидным зондом, который способен дифференцировать ДНК по более чем одной полиморфной минисател- литнрй о бласти или гипервариабельному участку; и получение, из него полинуклео- тида,. способного к гибридизации с фраг- ментом , который содержит минирате ллит, специфический относи- тельно определенной области или участка в геноме; и, имеет аллельную вариацию, равную не менее 3 (100). ;,.,,......

Прлинуклеотидный зонд содержит на- ряду с меченQи.компонентой или компонентой-маркёром полинуклеотид, содержащий по крайней мере три тандемных поетбра (при пб крайней, мере 70% гомологии) по- следовательностей, которые гомологйчйьт 1 минисателлитной области генома в такой

степени, которая позволяет осуществить гибридизацию зонда с соответствующим фрагментом ДНК, полученным при помощи расщепления пробы ДНКэндонуклеазой рестрикции.

Каждый повтор содержит ядро, которое имеет по крайней мере 70% гомологичность с минисателлитной ДНК из различных ге- номных участков, ядро имеет длину от 6 до 16 нуклеотидов, общее число нуклеотйдов внутри повторяющего блока, которые не участвуют в формировании ядра, не превышает 15.

В предпочтительном варианте вышеупомянутый ДНК-фрагмент содержит мини- сателлит из минисателлитной области или гипервариабельного участка, который может быть обнаружен при помощи полинук- леотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности, комплементарной последовательности: .

(A) AGGG CT GG A GG . .(1) (в которой Т является Т или U, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности, комплементарной последовательности:

AGAGGTGGGCAGGTGG (2) (в которой Т является Т или U).

Рассматривается также нуклеотидная последовательность с ДНК-фрагментом, полученным в результате расщепления ге- номной ДНК эндонуклеазрй рестрикции, причем вышеупомянутый фрагмент ДН К содержит минисателлит из вышеупомянутой минисателлитной области или гипервариабельного участка.

отличающийся тем, что:

1) вышеупомянутая область или участок имеют аллельную вариацию (как она была определена выше), равную по крайней мере 3(100), и

2) вышеупомянутая область или участок могут быть обнаружены при помощи пол- инуклеотидного зонда, содержащего по крайней мере три тандемных повтора последовательности (включая также комплементарные последовательности):

(A)AGGGG CTGGAGG(1) (где Т обозначает Т или U, а (А) может как присутствовать, так и отсутствовать) или последовательности (включая комплементарные последовательности):

AGAGGTGGGCAGGTGG (2), где Т - Т или U. ---В изобретении используются следующие термины.

Гипервариабельность.

Область человеческой, животной или растительной ДНК называется гипервариабельной, если она может находиться в многочисленных формах, например, в том, что касается длины или порядка. Минисателлит.

Область человеческой, животной или растительной ДНК, которая составлена из тандемных повторов короткой ДНК-последовательности. Все повторяющиеся блоки не обязательно должны обладать совершенной идентичностью. Полиморфизм.

Если ген или любой фрагмент ДНК обладает изменчивостью от одного индивида к другому или между данными спаренными

хромосомами индивидов, то говорят, что он полиморфный.

Тандемная последовательность. Это полинуклеотидная последовательность, которая точно или с некоторыми изменениями повторена в ряд. В общем случае, последовательность называется состоящей из тандемных повторов, если такой повтор содержится по крайней мере три раза.

% гомологичности,

При сравнении двух повторяющихся или тандемных повторяющихся последовательностей А и В гомологичность в процентах выражается числом пар оснований в А,

которое меньше числа вставок, замещений или удалений пар оснований в В, которое необходимо было бы осуществить для того, чтобы получить А, выраженное в процентах. Таким образом, гомологичность в процентах между двумя последовательностями ATGC и AGC равна 75%.

Согласованное ядро (последовательность).

Последовательность, которая может

быть идентифицирована как ближайшая пара среди нескольких повторяющихся последовательностей; в общей случае среди повторяющихся блоков двух или более различных минисателлитов.

Полинуклеотиды, относящиеся к настоящему изобретению, могут быть идентифицированы при помощи полинуклеотидного зонда, содержащего любую одну последовательность, выбранную из следующих последовательностей: .

AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGGGCCAGG

GAGPGGC 3

GTGGAYAGG 4

TGGGAGGTGGRYAGTGTCTG 5

GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGACTCA 6 GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGGTGTTGG

AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGAGTAC8

TGTGTGTAATGGGTATAGGCAGGGCCCCGGC

AAGGGGGTCTGGYX 9

(в которых Y является С, Т или U, X является G или С, R является А или G, а Т является Т или U) или-их тандемных повторов или Ш- следовательностей, комплементарных к

ним. .

В общем случае, полинуклеотиды и зоны специфичны, относительно определенного участка при очень строгих условиях гибридизации. В этом отношении выражение специфичный относительно определенного участка используется в связи с полинуклеотидом или зондом с тем, чтобы показать, что гюлинуклеотид или зонд можно использовать при условиях гибридизации, которые гарантируют, что полинуклеотид или зонд гибридйзируется только с одним единственным специфичным участком. .;,.,,:

Однако, необходимо иметь в виду, что зонды, специфичные относительно определенного участка, если их иело льзуют п рй менее строгих условия гибридизаций, способны дифференцировать ДНК при помощи сравнения с более чем одной полиморфной минисателлитной областью или гипервари- абельным участком и, таким образом, их можно использовать для идентификации других информативных генетических участков,.. -: ;- ;

;.-Повторы, которые не являются точными, именуются в соответствующих местах как несовершенные повторы. Такие повторы, тем не менее, могут быть узнаны как точные повторы. В общем случае, это будет означать, имеется в среднем по крайней мере 70% гомологичность между всеми повторяющимися блоками. В предпочтительном варианте существует по крайней мере 80%, в более предпочтительном варианте по крайней мере 85%, особенно предпочтительном - 90 %:гомологичность м ёжду всеми повторяющимися1 блока ми. Необходимо иметь в виду, однако, что неуклеотидная последовательность или повторяющийся блок не обязательно повторяется целиком, если это необходимо. .

Число повторяющихся блоков в предпочтительном варианте должно быть не менее 5, в еще более предпочтительном варианте не менее 10. В общем случае, изменяется в области от 10 до 40, но, в прйнципе, может быть произвольном чй сл ом, даже в области 1-10000.

В предпочтительном варианте полинуклеотиды и полй нУклёЬтидныё зонды содержат любую последовательность, выбранную из формул с 3 по 9, приведенных выше.

Изобретение позволяет идентифицировать информативную генетическую область в человеческом гёнЬ мё и прй этом позволяет

получить зонды, специфические относи тельно определённых областей, причем

каждый .зонд, специфичны, относительно

определённой информативной, геномной

области. Была осуществлена, в частности, идентификация шести различных .информа- тив нШ генетических участков, причем эти участки обладаю т очень высокой гетерози- ТотнОстью в испытываемой популяции (не

мейее ЭО) и бнй1 находятся среди наиболее полиморфных из изолированных до сих пор. Заявитель получил специфический относительно определенной области зонд для каждой области, эти зонды были обозначены рЯдХ,Я1у13 1.,ЯМ$8,ЯМ$31,ЯМ532 и Я MS 43 (они соответствуют определенным выше зондам).. ,-..,.,....... .--..

Степё йь индивидуальности генотипов, Определенных при.помощи,специфичности

Ьтн ОЙ и тел ьно области зондов, может быть

о Ценёйа из гёт еррзиготности (Н) в каждой области. Средняя аллельная частота q в не: котором участке задается при помощи (1-Н). а вероятность того, что два случайно вы5 бранных индивида включают один и тот же генотип, равна q (2-q). Эта вероятность не- обОСйованного связывания двух индивидов изменяется от 0,02 для Я MS 8 до 0,0002 для ЯМЗ 31, причем эта оценка является консер0 вативной в том смысле, что неоднородность по q снижает эти вероятности. Вероятность необрснованного связывания для всех шести мийисателлитных зондов равна приблизительно 10 , что сравнимо с

5 вероятностью того, что два случайно выбранных фингепринта ДНК, обнаруженных при помощи одного зонда, специфичного относительно нескольких областей, идентичны (см. патент Великобритании №

0 2166445). Напротив, вероятность того, что две области идентичны для данного гипер- варйабельного участка, задается формулой 1/4(1 + q) . Вероятность идентичности для всех шести зондов равна 0,0004 по.

5 сравнению, с примерно 10-7 для фингепринта ДНК с использованием одного зонда, специфичного относительно, нескольких областей.;. ....;,. Эти структуры обеспечивают.высокую

0 степень индивидуальной специфичности,

и хотя она не столь высока по сравнению с

той/которую можно получить при исполь

зб вании зондов относительно нескольких

областей или при использовании последо5. вателйной гибридизации с зондами, специфичными относительно о.пределе.нной области (см, выше). Оба типа зондов, объединенные зонды или отдельные зонды, специфичные относительно определенной

; , 1 N - Ч - - -:. - , .-... ...

области, могут оказаться особенно эффективными при изучении клеточных химер.

В приводимых ниже примерах используемые зонды 33,6 и 33,15 описаны в патентной публикации Великобритании №2166445. Они содержат повторяющуюся последовательность:

(A)AGGGCTGGAGGn

AGAGGTGGGCAGGTGG соответственно.

П р и м е р 1. ДНК выделяют из белых кровяных клеток и из трансформированной вирусом Энстейна-Барра линии клеток лим- фобластов. Осуществляют переваривание рестриктазами. Фрагменты двунитевой ДНК зондов изолируют при помощи электрофореза на бумаге ДЕ81, а затем снабжают 32Р-меткой при помощи любой олигонуклеотидной затравки. Однонитевой минисателлитный зонд 33,15 получают в соответствии с описанием, данным Джеффри- сом и др. (1985), Nature, 314, стр. 67-73.

Клонирующий гипервариабельный фрагмент.

600 мкг ДНК линии клеток лимфобла- стов, обработаной ферментом Sau ЗА, фракционируют при помощи электрофореза в 0,5%-ном агарозном геле и фракции соответствующих размеров собирают с исполь- зованием электроэлюирования на мембрану для диализа. После двух циклов препаративного гелевого электрофореза фрагмент g подвергают 1000-кратной очистке (выход 150 нг ДНК) 20 нгэтой очищенной фракции подвергают лигированию с 60 нг ДНК Ah 47.1, выделенной после расщепления ферментом Bam HI, упаковывают в лабораторных условиях и помещают на пластинки с культурой E.coli Wh 95/803, sup Е, sup F, Lsd Rk, hsd Mk+, ton A, trpR, met Д лизогенные для P2 с тем, чтобы отобрать рекомбинанты. Полученную в результате библиотеку рекомбинатного фага 1500 просеивают при помощи гибридизации на пластинке с минисателлитным зондом 33,15. Четыре положительные пластинки снова распределяют по пластинкам и отбирают на культуре E.coli ЕД8910(803, sup Е, sup F, rec В21, res C22, RSdS) и ДНК рекомбинантного фага выделяют. Sau ЗА-вставку рекомбинантного фага дЗ субклонируют по сайту Ват HI в плазмиду pU C13 и культивируют в res А-производной культуре E.coli J M83, J M83, Д (res A-srlP)306:Tn10.

Анализ ДНК-последовательности.

ДНК- рАд 3 обрабатывают ультразвуком, отбирают по размеру и клонируют в сайт Sma 1 ДНК М13 тр 19. Чтобы определить ДНК-последовательности области из тандемных повторов в рАд 3, анализируют последовательность у 12 случайных клонов при помощи процедуры анализа концов

ДНК. 8 из этих клонов получают из миниса- теллитной области тандемных повторов в рАд 3 и используют для определения согласованной повторяющейся последовательности. Клоны М13, содержащие области с 5 и З -концами, обнаруживают при помощи гибридизации с Р-мечеными зондами А и В (см. черт.1, описанный ниже) и анализируют последовательность с тем, чтобы определить последовательность боковых областей,

а также начальные и концевые пункты мини- сателлита.

Результаты.

Изоляция специфичного минисателли- та..

Индивид III 9 из родословной Гуджара- ти, описанный Джеффрисом и др. (1986) Am. J. Hum. Genet. 39. стр. 11-24) подвергают анализу на (СНПГП) сохранение наследственных признаков гемоглобина плода и ее

фингепринт ДНК, обнаруженный после обработки Sau ЗА при помощи минисателлит- ного зонда 33,15, содержит полиморфный фрагмент в 8,2 т.п.о. (тысяч пар оснований) (фрагмент черт.1а), который имеет тенденцию образовывать сочетания с СНПГП у других членов этого рода. Этот ДНК-фрагмент подвергают очистке от других ми ниса- теллитных фрагментов с использованием двух циклов препаративного гелевого электрофореза. ДНК из индивида III 9 переваривают ферментом Sau ЗА, а фрагменты длиной 6-9т.п.о. собирают при помощи препаративного электрофореза. Эти фрагменты снова подвергают электрофрезу.

Отдельные порции ДНК III 9 обрабатывают ферментом Sau ЗА, каждую фракцию подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном геле и проводят дотгибридизацию с минисателлитным зондом 33,15. Фрагмент

g (8,2 т.п.о.), который гибридизуется с СНППГ, подвергают примерно 1000-кратной очистке во фракцию 3.

Фрагмент g, обнаруженный в продукте обработки ферментом Sau ЗА и подвергнутый очистке приблизительно в lt)00 раз, клонируют в A L 47.1 и затем переносят на Р2-лизогенную гее + культуру E.coli с тем. чтобы отобрать рекомбинатный фаг. Полученную в результате библиотеку просеивают при помощи гибридизации с зондом 33,15. При этом получают четыре положительных бляшки. Их снова помещают на пластины (0-8 pfu (бляшку) {С гее В, гее С культурой E.coli} с тем, чтобы получить

бляшки нормального размера (1 мм в диаметре). Далее два клона Ад 1 и Яд 3 анализируют и обнаруживают, что они содержат Sau ЗА-вставки размерами 7,7 и 7,8 т.п.о. соответственно. Оба эти клона получают из полосы q, но они короче полосы g на 0,5 и 0,4, т.п.о. соответственно. Так как не было какой-либо неоднородности в размерах Sau ЗА-вставки как в клоне Яд 1,таки клоне Ад 3, выращенных на res В, res С культуре E.coli (эти данные здесь не приведены), отсюда следует, что часть вставки была утеряна в каждом клоне в процессе их первоначального переноса на гее + культуру E.coli.

Выходы ДНК Яд 1 и Яд 3 были очень низкими (1 % от выхода рекомбинатной ДНКЯ1 47.1), что указывает на необычные свойства роста таких минисателлитных клонов. Поэтому Sau ЗА-вставкусубклонируют в PU C13 и переносят в гее А-производную культуры E.coli J M83. Полученный в результате субклон, р Я g 3 содержит Sau ЗА-вставку в 7,1 т.п.о., что на 6,7 т.п.о. короче, по сравнению с вставкой в дЗ.

Организация минисателлитного фрагмента д, .

Структуру минисателлитного фрагмента в рЯдЗ определяют при помощи рестрикции и анализа ДНК-последовательности.

Карта для Sau ЗА-вставки в р Я g 3 построена при помощи эндонуклеазы сечения I (A), Dde I (I), Hae III (H), Mb II (М), Pst I (Р) и Sau ЗА (S). Сайты сечения для Hint I или RS al отсутствуют. Вставка в 7,14 т.п.о. содержит 171 тендемный повтор последовательности в 37 п.о. (пар оснований) плюс 747 п.о. боковых для ДНК.

ДНК- последовательность гипервариа- бельного фрагмента g содержит область с 5 и,3 конец и минисателлит вместе с повторяющимися последовательностями трех случайных областей (а-с) из этого миниса- теллита, начало обращенного Alu-фрагмен- та, несколько простых областей последовательности в 5 -области, согласованную последовательность (соп) минисателлитного повторяющегося блока в 37 п.о. второй повторяющийся блок в области с содержит сайт рестрикции Hae III, и эта область образует внутренний сайт Hae III в минисателлите.

Клон р Я g 3 содержит минисателлит в 6,3 т.п.о., лишенный сайтов рестрикции, за исключением единственного внутреннего сайта Hae III. Этот минисателлит составлен из 171 повтора блока в 37 п.о ., который содержит последовательность G Т G G G С А G G . Эта последовательность в точности соответствует наиболее инвариантной части последовательности ядра в 11-16 п.о., которая ранее была идентифицирована как сочетающаяся с несколькими различными человеческими минисателлйтами. Повторяющиеся блоки не являются полностью одно- родными. Анализ последовательности нескольких случайно выбранных областей внутри этого минисателлита выявляет ограниченное количестбо измёнений повторяющейся последовательности. Большинство вариантов, включающих делецию в 4 п.о., который продуцирует под множество повторяющихся блоков в 33 п.о., распространены по более чем одному повторяющемуся блоку. Один вариант (трансверсия А - С в области С) создает единственный внутренний сайт Hae III и он является единственным, обнаруженным в одном повторяющемся блоке. Начальные и концевые повторяющиеся блоки минисателлита больше отличают- ся последовательностями, чем внутренние повторы.

Минисателлит в р Я g 3 содержит боковую не повторяющуюся ДНК с нормальной

плотностью сайтов рестрикции. Начало 5 - области состоит из головной части обращенного Alu-элемента. Оставшиеся 5- и 3- области, определенные с использованием зондов гибридизации а и Ь, являются уникальной последовательностью ДНК и гибридизация осуществляется только на этом участке ДНК (эти данные не приведены). 5 - область содержит значительное количество ДНК с простой последовательностью (полипурин и (АСС)п).

Минисателлитный фрагмент g обнаруживает единственный полиморфный участок.

Для того, чтобы определить, можно ли

использовать полный клонированный мини- сателлитный фрагмент в качестве зонда гиб- ридизации для специфического обнаружения соответствующего участка в человеческой ДНК Sau ЗА-вставку из р Я g 3

подвергают гибридизации в присутствии конкурентной ДНК человека, обработанной ферментом Hinf I.

При помощи рЯд 3 обнаружено Менде- лево наследование полиморфных ДНК- фрагментов. 8 мкг человеческой ДНК обрабатывают ферментом Hint I, подвергают электрофорезу в 0,8%-ном агарозном геле, гибридизуют с Sau ЗА-вставкой из р Яд 3 в 1 х SSC при температуре 65°С в присутствии 6%-ного раствора полиэтиленгликоля

и 50 мкг/мл конкурентной ДНК плаценты

человека после гидродинамического фрагментирования с использованием щелочи, и

промывают в 0,2 х SSC при температуре

65°С. При помощи р A g 3 обнаруживают единственный участок, который является гетерозиготным во всех указанных индивидах. Наследование аллелей является менделевым.

При весьма строгих условиях (0,2 х SSC, 65°С) обнаруживают либо один, либо два прогибридизировавшихся фрагмента во всех проверенных индивидах. При помощи р A g 3 обнаруживают фрагмент g в 8,2 т.п.о. в ранее обследованных родственных ин- Д и видах III 8, что подтверждает клониро- вание полосы д. При менее строгих условиях (1 х SSC, 65°С) обнаруживают дополнительный, слабо гибридизующийся, полиморфный ДНК-фрагмент, ДНК-фрагменты, обнаруженные при помощи р Яд 3 при очень строгих условиях, классифицированы как аллели одной области. Этот участок не связан с полом и, как было установлено, не является существенным, но половые связи в двух больших родословных были исследованы не полностью (исследовали 61 потомка, Z 0,18 при в 0,43; эти данные не приведены). Он ведет себя как аутосомная область и расположен на 7 хромосоме.

Полиморфное изменение в минисател- литном участке.

Продукты обработки ферментом Hinf I ДНК из 79 случайно выбранных британцев кавказского происхождения отбирают при помощи вставки из р A g 3, сначала отдельно, а затем в группах по 14 человек (1 мкг ДНК от индивида), подвергают электрофорезу в 0,7%-ном агарозном геле длиной 35 см с тем, чтобы получить максимум аллель- ного разрешения. Длину минисателлита в самом коротком типичном аллеле определяют при помощи геномной карты этого фрагмента в томозигйте, используя боковые зонды а и b одной копии.

Количество повторов на аллель очень приблизительное и зависит от пропорции в минисателлите повторяющихся блоков в 37-38 п.о. За исключением короткого типичного аллеля, оставшиеся аллели попадают в выборку либо однажды (42 аллеля), либо дважды (12 аллелей), либо три раза (12 аллелей), либо четыре раза (5 аллелей). Такое распределение не очень сильно отличается от ожидаемого, если все эти аллели встречаются редко (g 0,0081, 2 (4 ф.р.) 4,0) и оно, следователь но, согласуется с простой моделью одного типичного короткого аллеля (д 0,165), причем в этой популяции одинаково редко присутствуют Т03 аллеля (д 0,0081 на аллель).

По крайней мере 77 различных аллелей могут быть разрешены вэтойпопуляцион- ной пробе, причем количества повторов изменяются в области от 14 до примерно 525

на аллель. Гомозиготы в этой популяцион- ной пробе все гомозиготны с самым коротким аллелем. Приведенные оценки для числа аллелей и средней частоты для редких аллелей ограничиваются разрешением гелевого электрофореза и реальные числа для аллелей различной длины в этой пробе могут быть больше.

Распределение длин аллелей не совсем произвольно, а содержит триWacca аллелей с коротких (14-16 повторов), средних (41-68 повторов) и длинных (107-424 повтора). Бимодальное распределение длин аллелей было ранее отмеченО для кавказцев в гипервариабельной области, расположенной от 5 до гена человеческого инсулина (Nature, 1982, 295, стр. 31-35), хотя такая бимодальность не очевидна для негрев.

Изоляция фрагмента g подтверждает, что большие и высокополиморфные ДНК- фрагменты в фингепринте ДНК могут быть клонированы с тем, чтобы получить специфичные относительно Определенной области зонды, пригодные для изучения отдельных гипервариабельных областей.

Несмотря на то, что фрагмент g можно кло- нировать в бактериофаг А, полученные в результате клоны проявляют необычные свойства роста на гес+ культуре E.coli. Это может приводить к изъятию минисателлитных клонов из известных амплифицирован- ных человеческих библиотек в фаге. Клонированный минисателлит не стабилен как относительно внешних, так и внутренних возмущений при субклонировании в pU

С13 в гее А культуре E.coli. Рекомбинантный рАд 3 теряет примерно 30 повторяющихся блоков по сравнению с фрагментом р А д 3. следовательно, не полностью отражает организацию фрагмента д.

Клонированный ДНК-фрагмент имеет ожидавшуюся структуру для минисателлита, что подтверждает тот факт, что фрагмент g не был получен из ДНК с более длинным сателлитом. Несмотря на присутствие как

последовательности ядра в каждом повторяющемся блоке, так и части Alu - последовательности в 5 -области, клонированный фрагмент g в присутствии конкуретной человеческой ДНК действует как специфичный

относительно определенной области зонд. Неудача при использовании рАд 3 с целью эффективного обнаружения других, содержащих ядро, минисателлитов, объясняется

присутствием дополнительной неядерной ДНК в каждом повторяющемся блоке.

Клонированный минисателлит проявляет полиморфизм по длине, что вероятно объ- ясняется аллельной вариацией как в количестве повторяющихся блоков, так и в отношении повторяющихся типов с длиной 37 и 33 п.о. в каждом аллеле. В каждой случайной популяционной пробе из 158 хромосом можно обнаружить один распростра- ненный и по крайней мере 76 редких аллелей. Этот участок является гораздо более полиморфным, чем большая часть, или даже все клонированные человеческие ги- первариабельные области, которые охарактеризованы до настоящего времени, включая селекцию относительно коротких клонированных минисателлитов.

Гетерозиготность в этом участке составляет не менее 96,8%, причем большая часть гомозигот рождается из короткого распространенного аллеля, Новые аллели на этом участке возникают либо в результате изменения количества повторов, либо за счет сдвига рамки в процессе репликации ДНК, либо за счет неравного обмена. Предположив наличие случайного дрейфа мутации, вычисляют параметр 4 NeV ( в), где Ne - эффективный размер популяции, а V - скорость мутации на одну гамету, исходя из количества различных аллелей, отмеченных в популяционной пробе. Заявитель рассчитывает, что он содержится в диапазоне 60-90 для этого участка, в зависимости оттого, включал или не включал распространенный короткий аллель. Так как Ne для человека равен примерно 10 , скорость мутации V в аллели новой длины в этом участке равна приблизительно 0,002 на одну гамету. Это значение для V занижено, так как количество обнаруженных аллелей лимитируется разрешением ге- лев ого электрофореза и так как не существует бесконечного числа потенциальных разрешаемых аллелей. Средняя длина ДНК минисателлита на этом участке составляет 5 т.п.о. и, следовательно, скорость мутации (рекомбинации) на 1 т.п.о. минисателлита составляет 4 х 10 по сравнению с на 1 т.п.о., установленную для других, содержащих более короткое ядро, минисателлитов и средней скоростью мейотической рекомбинации 10 на 1 т.п.о. для человеческой ДНК (Nature, 1985, 314, стр.67-73), Таким образом, скорость образования новых аллелей в этом участке мини- сателлита гораздо более высокая. По-видимому, скорость мутации для коротких аллелей является относительно небольшой, что может служить объяснением того,

как самый короткий аллель мог дрейфовать, чтобы обеспечить значительную частоту в популяции, не подвергаясь разрушению в результате неравных обменов в течение этого процесса.

Способ фингепринта ДНК представляет собой эффективное средство для индивидуальной идентификации и для установления семейного родства, например, в спорах об

0 отцовстве и иммиграции, Точность этого способа определяется низкой средней вероятностью того, что некоторая полоса имеется у двух случайно выбранных индивидов. Для британцев кавказского происхождения

5 величина X была оценена как 0,2 для Hine l-фрагментов фингепринта ДНК, с длиной более 4 т.п.о. В тех случаях, когда полоса встречается у нескольких индивидов (то есть, когда полоса одного индивида соче0 тается у второго индивида с полосой той же подвижности и авторадиограммой интенсивности), то не ясно, представляют ли сочетающиеся полосы идентичные аллели одного и того же минисателлитного участ5 ка.

Используя зонды 33,6 и 33,15 фингепринта ДНК, можно заметить расщепление до 34 диспергированных аутосомных участков у больших групп людей, состоящих из

0 братьев и сестер. Для большей части проанализированных участков только один из двух аллелей был отмечен во всей совокупности разрешенных фрагментов фингепринта ДНК значительных размеров ( 4

5 т.п.о.), что наводит на мысль, что существуют большие различия по размерам между минисателлитными аллелями, причем много аллелей расположено в плохо разрешаемой ( 4 т.п.о.) области фингепринта ДНК. Это

0 также можно заметить для клонированного минисателлита; Hinf l-аллели на этом участке варьируются по длине от 1,7 до 20,4 т.п.о., а распределение частот аллелей показывает, что оба аллеля из этого участка могут

5 быть разрешены в фингепринте ДНК только для 40% индивидов в то время, как ни один из аллелей не обнаружен у 14% человек.

При помощи минисателлитных зондов 33,6 и 33,15 обнаружены примерно 60 ги0 первариабельных участков.

В приводимом ниже примере 2. используют следующие материалы и приемы.

а) Клонирование селекции больших минисателлитов.

5Собирали 5 мг ДНК крови от каждого из 40 случайно выбранных индивидов, гид- ролизуют ферментом Sau ЗА, а фрагменты в 5-15 т.п.о. изолируют при помощи пре- паративного электрофореза в 0,6%-ном агарозном геле с последующим электроэлюированием на мембрану для диализа. Очищенную фракцию подвергают электрофорезу во втором препаратйвнрм геле, с тем, чтобы удалить все сЛеды загрязняющих небольших Sau ЗА-фрагмёнтов. 50/нг фракции в 5-15 т.п.о. лигируютс ТООнгД.47.1 -ДНК, полученной после расще пления ферментов Bam HI (Gene, 1980, 20, стр.249-259), упаковывают в лабораторных условиях, создают библиотеку и отбирают с использованием человеческих минисателлитных зондов 33,6 и 33,15. Положительные бляшки изолируют в соответствии е описанием, приведенным в примере 1, с тем, чтобы получить МС-се- рии рекомбинантного фага.

b) Изоляция минисателлитных зондов гибридизации.

ДНК рекомбинатного фага переваривают ферментом Sau ЗА и большой фрагмент для вставки отделяют от малых фрагментов векторов при помощи электрофореза в агаре с низкой температурой гелеобразования. Гелевый срез, содержащий вставку, растворяют в 3 объемах воды при температуре 65°С, а порции, содержащие 10 нг ДНК вставки, снабжают меткой с использованием 32Р при помощи олигонуклеотидной затравки.

c) Гибридизации по Саузерну.

Пробы геномной ДНК обрабатывают ре- стриктазами и подвергают электрофорезу. ДНК переносят на фильтры, фиксируют при помощи ультрафиолетового облучения и проводят предварительную гибридизацию при 65°С в течение 5 мин в 0,5 М фосфате натрия, 7% ДСН (додецил сульфата натрия), 1 ММ ЭДТА (рН 7,2). Затем фильтры гибри- дизуют в течение ночи с 0,5 мг/мл Р-мече- ной ДНК зонда (удельная активность примерно 109 имп/мин/мкг ДНК) в присутствии 25 мкг/мл разрезанной однонитевой конкурентной ДНК плаценты человека. После гибридизации фильтры промывают при температуре 65°С в 40 мм раствора фосфата натрия, 1% ДСН (рН 7,2), затем промывают при температуре 65°С в 0,1 х SSC (15 мм NaCI, 1,5 мм тринатрий цитрата, рН 7,0), 0,1% ДСН, Фильтры оставляют на авторадиографию в течение от 3 часов до 1 недели при температуре - 80°С в присутствии интенсифицирующего экрана.

d) Определение тандемной повторяющейся последовательности МС-рекомби- нантов..-.--

Каждую МС-рекомбинантную ДНК подвергают обработке ультраз в уком, отбирают фрагменты размером 0,3-0,6 т.п.о. и клонируют в сайт Sma 1 М 13 mp 19. Рекомбинан- тный фаг отбирают при помощи гибридизации бляшек с Р-меченой МСвставкой ДНК. 10 строго.положительных од- нонитевых ДНК фага из данных рекомби- нантов сравнивают парами при помощи С-теста. Большая часть ДНК разбивается на

две группы в соответствии с С-тестом и поэтому весьма правдоподобно, что они получены из длинной тандемно повторяющейся области Я MS-вставки, Два М13-рекомби- нанта каждой из двух комплементарных

групп анализируют на состав последовательности при помощи метода концевого лечения леотидных цепей (Сангер, Никлен и Кулсон (1977), Proc. Natl. Acad) с тем, чтобы определить повторяющуюся после довательность каждого МС-рекомбинанта на обеих нитях. :

П р и м е р 2. а) Выделение гипервариа- бельных зондов ДНК . Sau ЗА-фрагменты после селекции по

размеру в области 6-15 т.п.о. из ДНК, собранной у 40 случайно выбранных индивидов, клонируют в векторе с замещённым сайтом Bam HIAL47.1. Так как человеческие минисателлиты могут обладать существенной аллельной вариацией по длине, применение объединенных человеческих ДНК с целью клонирования больших Sau ЗА-фраг- ментов, должно увеличить количество клонируемых гипервариабельных участков .

которые содержат большие Sau ЗА-аллели. Из библиотеки, состоящей из 2000 рёком- бинантов, изолируют 5 фагов при помощи гибридизации с человеческим минис ател- литным зондом 33,15, а дополнительные 5

фагов обнаруживают при помощи зонда 33,6 с тем, чтобы получить МС-серии реком- бинантов.

Для того, чтобы определить, может ли каждый Я MS-рекомбинант действовать как

специфический относительно определен- ной области зонд для гипервариабельного минисателлита, Sau ЗА-вставку каждого ре- комбинанта подвергают гибридизации в присутствии человеческой конкурирующей

ДНК, гидролизованной рестриктазой Hinf 1 оттрех случайно выбранных индивидов, при гидролизе рестриктазой Alu 1 для Я MS 32, минисателлитные тандемные повторяющиеся блоки которого содержат сайт Hinf 1.8

из 10 рекомбинантов гибридизуют с одним или двумя большими вариабельными ДНК- фрагментами в каждой из испытуемых человеческих ДНК. Четыре рекомбинанта, обнаруженных при помощи зонда 33,6 (Я MS

8, 40, 41 и 47) гибридизуются в ту же структуру вариабельных ДНК-фрагментов и, следовательно, они получены из того же гипервариабельного участка. 2 мкг пробы ДНК от трех, не связанных между собой

19

20

Использование: спор об отцовстве, судебная медицина, диагностика и лечение генетических расстройств, а также предрас- положенностей. Сущность изобретения: способ заключается в том, что осуществляют гибридизационный анализ геномной ДНК путем скрининга библиотеки ДНК в фаге путем гибридизации с последовательностью 33,6 или 33,15 и отбор позитивных клонов с последующим выделением всей или части выставки. 1 з.п. ф-лы.

индивидов переваривают ферментом Hint 1, подвергали электрофорезу в 0,8%-ном агарозном геле, гибридизуют по Саузерну с 32Р-мечеными Sau ЗА-вставками из р Яд 3 (пример 1),ЯМ58 и Я MS 40, как это описано в пункте материалы и методы. Фильтры промывают в 0,1 х SSC при температуре 65°С, а затем получают авторадиограмму в присутствии интенсифицирующего экрана в течение 1 дня или 1 недели. Я MS 8 и Я MS 40 обнаруживают один и тот же-гипервариа- бельный участок и дополнительные вариа- бельные ДНК-фрагменты.

Оставшиеся рекомбинанты Я MS 1, 31, 32 и 43 получают из других участков, которые не включают ранее охарактеризованный р Я g 3-участок (см. пример 1). Хотя ни один из этих Я MS-рекомбинантов не дает фингепринтов ДНК сложных вариабельных фрагментов, большинствоЯ MS-зондов еженедельно подвергают кроссгибридизации в дополнительные полиморфные ДНК-фрагменты, если авторадиограмму снимают более длительное время.

ДваЯМЗ-рекомбинанта, обнаруженные при помощи зонда 33,15, Я MS 3 и Я MS 30, не имеют специфичного участка в человеческой ДНК, гидролизованной Hinf 1 или Sau ЗА как в присутствии человеческой конкурирующей ДНК, так и без нее.

Таким образом, несмотря на известные ранее трудности при клонировании больших и нестабильных человеческих миниса- теллитов, заявитель смог показать; что по крайней мере некоторые из самых больших и наиболее вариабельных ДНК-фрагментов, обнаруженных в фингепринте ДНК, поддаются клонированию в бактериофаге Я при условии, что эти вставки стабилизированы при помощи переноса фага в культуру-хозяина гее ВС E.coli.

b) Определение блоков повторяющейся последовательности клонированных мини- сателлитов.

Случайные сегменты ДНК-вставки из каждого Я MS-рекомбинанта анализируют на состав последовательности с тем, чтобы определить, каждый ли клонированный ги- первариабельный участок состоит из тан- демно повторяющегося минисателлита. Показано, что все Я MS-клоны состоят главным образом изтандемных повторяющихся блоков, длина которых изменяется в области от 9 п.о. для Я MS 1 до 45 п.о. для Я MS 43.

Случайные сегменты каждого клонированного минисателлита анализируют для того, чтобы определить согласованный повторяющийся блок. Переменные позиции в каждом типе согласованности указаны следующими символами: R, г А или G; Y , Y С или Т; N, n любое основание. Минисател- лит в MS 8 состоит из двух перемежающихся между собой повторяющихся блоков длиной

29 и 30 пар оснований.

Ни в одном минисателлите нет повторяющихся блоков, полностью однородных. Минисателлит Я MS 3 состоит из перемешанных множеств в двух очень похожих, но

различных повторяющихся блоков длиной

29 и 30 п.о. Концы минисателлитов в Я MS

рекомбинантах до сих пор не определены.

Таким образом изолированы пять новых

гипервариабельных участков, каждый из которых состоит главным образом из тандем- но повторяющегося минисателлита. Повторяющиеся тандемом блоки из рЯд 3, Я MS 1, Я MS 31 и Я MS 32 содержат последовательность ядра. Однако, копии

последовательности ядра являются несовершенными и простые сравнения повторяющихся блоков этих минисателлитов очевидно не дают возможности определить новую последовательность ядра, которая

. чаще всего связана с этими большими и сильно вариабельными участками. Напротив, представляется весьма правдоподобным, что с большими минисателлитами может быть связан широкий спектр производных ядра, Минисатёллиты Я MS 8 и Я MS 43 содержат в высшей степени нестандартные версии последовательности ядра. При помощи простых сравнений Я MS 8, Я MS 43 и 33,6 нельзя четко представить новую специфичную последовательность, которая связана главным образом с этими тремя участками.

с) Менделево наследование и вариабельность участков1.

Пять новых минисателлитов Я MS 1, 8, 31,32 и 43 содержат (каждый) единственный большой и вариабельный участок. Менделево наследование всех участков подтверждают при помощи анализа сегрегации в

больших горизонтальных родословных с использованием СЕРН-программы, Пробы ДНК по 1 мкг из СЕРН-семейства 1423 обрабатывают ферментом Alu 1, гибридизуют по Саузерну с Р-меченой Sau ЗА-вставкой

из ЯМ531.

Степень аллельной вариабельности для каждого зонда оценивают при помощи анализа частоты сочетания аллелей между случайно выбранными англичанами. Пробы по

1 мкг ДНК гидролизуют ферментом Hinf 1, гибридизуют по Саузерну с Я MS 43. Все индивиды являются гетерозиготными, что указывает на то, что степень гетерозиготно- сти в этом гипервариабельном участке достаточно высока (Н 0,86, р 0,95). Более точная оценка гётёрозиготностй может быть сделана при помощи сравнения аллелей в каждом индивиде с аллелями у шести ближайших соседей на авторадиогрэммё с тем, чтобы оценить степень сочетания аллелей между отдельными индивидами. У всех обследованных индивидов S 0,11, откуда средняя частота аллеля Q может быть оценена как g 1 - (1-8) 0,056, а гетерозигот- ность как (1-д) 94%. Она представляет собой минимальную оценку гетёрозиготно- сти в условиях ограниченного разрешения гелевого электрофореза.

Все участки оказались высоковариа- бельными с гётерозиготностью, изменяющейся в области от 90% для Я MS 8 до 99% для Я MS 31 (см. таблицу 1). Степень вариации длины аллелей в дальнейшем анализируют при помощи сравнения спектра аллелей, обнаруженных в объединенных из 15 и 150 индивидов. Пробы ДНК от одного индивида (а), из объединенной пробы 15 индивидов (Ь) и из объединенной пробы 150 человек (с) гидролизуют ферментами Alu 1 (дляЯМЗ 32)или Hinf 1 (для всех оставшихся зондов), проводят гибридизацию по Саузер- ну с гипервариабельными зондами. Все индивиды были случайно выбранными жителями Северной Европы. Индивиды а включают в объединенные Ь, а всех индивидов объединения Ь включают в объединение с. Можно заметить, что Я MS 43 обнаруживает вторую вариабельную область/представленную короткими Hinf 1-ал- лелями, отмеченными символом 0; в дальнейшем эту область более детально не изучали.

Для слабо вариабельного участка Я MS 8 имеется два преобладающих аллеля длиной 5,3 и 7,2 т.п.о. плюс 7 аллелей с меньшей частотой, обнаруженных в группе из 15 человек. Тот факт, что эти два преобладающих аллеля не являются результатом ошибки

Большинство аллелей. изЯ MS 31 распредел- но довольно равномерно на относительно узкой области размером от 5,5 до 9,3 т,п.о., в то время, как аллели из Я MS 1 варьируют по размеру от 2 до..20. т.п.о. В некоторых случаях имеется очевидная неравномерность распределения аллелей по длине, в частности, в Я MS 43 .проявляются два преобладающих класса размеров аллелей 5-6 т.п.о. и 8-14 т.п.о., а в р Яд 3 проявляются три класса размеров 1,6-1,7, 2,8-3,6 и 5-15 т.п.о. Обнаруженные участки являются в высшей степени вариабельными, а в действительности, он и являются самыми вариабельными среди большей части полиморфных участков, выделенных До сих пор из ДНК человека. .. .....

П р им е р 3. Чувствительность миниса- теллитных зондов.,

Авторадиографический сигнал гибридизации по Саузерну, полученный после гибридизации в течение ночи, достё тбчно насыщен при концентрации ДНК зонда 0,1 нг/мл, причем также сигналы могут быть легко получены от 60 кг и даже меньшего количества человеческой геномной ДНК. Аналогично, в зависимости от генотипа испытываемых индивидов, с использованием этих зондов можно обнаружить-2% и меньше ДНК одного .индивида. ,.: .-..

Проведен анализ чувствител ь ност и спе: цифичных относительно определённой области зондов и их применения с целью проведения судебной экспертизы в двой- 35 ном преступлениИ Изнасило ваниеУубийст во. Подозреваемый ( был .обвинен...в. убийстве Y, но судебное расследование вр всей очевидностью показало, ,е жерт.тч вы X и Y были убиты одним и тем же челове.-, ком. Выделяли и анализировали ДНК из следующих судебных образцов: а - волосы жертвы X, взятые через два Дня после убийства, Ь - смесь спермы и влагалищной жидкости, извлеченная из лобковых волос

10

15

20

25

30

40

при взятии пробы у этих 15 индивидов, под- 45 жертвы X: с -свежэя кровь пЪдозреваемотверждается таким же преобладанием их в группе из 150 индивидов. Аналогично, Я MS 43 (гетёрозиготность 94%) обнаруживает. 7 основных аллелей, которые согласуются в группах из 15 и 150 индивидов. Напротив, наиболее вариабельные участки Я MS 1, 31 и 32, и р Я g 3, гетерозиготность которых изменяется .в области 97-99%, не обнаруживают аллелей с значительной частотой, популяции, которые сочетаются с равной интенсивностью у обоих групп индивидов. Разброс длин аллелей у кавказцев также изменяется между такими гипервариабельными участками (см. таблицу 1).

roL, d -кровь из сердца, взята ЈГ через день после убийства у жертвы Y е - влагалищный мазок у жертвы У, содержащий сперму, кровь и влагалищную жид кость Т..- .пятно

50 на юбке жертвы Y, содержащё 0 сперму и кровь. Пробы а и Ь хранили в сухом виде при температуре 4°С в течение:3 лет, пробы d и е хранили при температуре 40°С в течение 2 месяцев, а пробу f хранили в

55 сухом виде п;Јй температуре 4°С в течение 2 месяцев. ДНК извлекали, гидролизовали Hinf 1 и подвергали гибридизации по Саузерну с меченой 32Р- Я MS 1-вставкой. ДНК анализировали в каждой пробе, за исключеБольшинство аллелей. изЯ MS 31 распредел- но довольно равномерно на относительно узкой области размером от 5,5 до 9,3 т,п.о., в то время, как аллели из Я MS 1 варьируют по размеру от 2 до..20. т.п.о. В некоторых случаях имеется очевидная неравномерность распределения аллелей по длине, в частности, в Я MS 43 .проявляются два преобладающих класса размеров аллелей 5-6 т.п.о. и 8-14 т.п.о., а в р Яд 3 проявляются три класса размеров 1,6-1,7, 2,8-3,6 и 5-15 т.п.о. Обнаруженные участки являются в высшей степени вариабельными, а в действительности, он и являются самыми вариабельными среди большей части полиморфных участков, выделенных До сих пор из ДНК человека. .. .....

П р им е р 3. Чувствительность миниса- теллитных зондов.,

Авторадиографический сигнал гибридизации по Саузерну, полученный после гибридизации в течение ночи, достё тбчно насыщен при концентрации ДНК зонда 0,1 нг/мл, причем также сигналы могут быть легко получены от 60 кг и даже меньшего количества человеческой геномной ДНК. Аналогично, в зависимости от генотипа испытываемых индивидов, с использованием этих зондов можно обнаружить-2% и меньше ДНК одного .индивида. ,.: .-..

Проведен анализ чувствител ь ност и спе: цифичных относительно определённой области зондов и их применения с целью проведения судебной экспертизы в двой- 5 ном преступлениИ Изнасило ваниеУубийст во. Подозреваемый ( был .обвинен...в. убийстве Y, но судебное расследование вр всей очевидностью показало, ,е жерт.тч вы X и Y были убиты одним и тем же челове.-, ком. Выделяли и анализировали ДНК из следующих судебных образцов: а - волосы жертвы X, взятые через два Дня после убийства, Ь - смесь спермы и влагалищной жидкости, извлеченная из лобковых волос

0

5

0

5

0

0

roL, d -кровь из сердца, взята ЈГ через день после убийства у жертвы Y е - влагалищный мазок у жертвы У, содержащий сперму, кровь и влагалищную жид кость Т..- .пятно

на юбке жертвы Y, содержащё 0 сперму и кровь. Пробы а и Ь хранили в сухом виде при температуре 4°С в течение:3 лет, пробы d и е хранили при температуре 40°С в течение 2 месяцев, а пробу f хранили в

сухом виде п;Јй температуре 4°С в течение 2 месяцев. ДНК извлекали, гидролизовали Hinf 1 и подвергали гибридизации по Саузерну с меченой 32Р- Я MS 1-вставкой. ДНК анализировали в каждой пробе, за исключением проб е и Г. Авторадиограмму получали в течение одной недели в присутствии интенсифицирующего экрана. Пятна спермы Ь, е и Г содержат два гибридйзиру- ющихся фрагмента ДНК, которые не могут принадлежать жертве. Кроме того, проба Ь содержала аллели жертвы, полученные из влагалищной ДНК. Аллели спермы Ь, е и Г неразличимы, что наводит на на мысль, что жертвы X и Y были на самом деле изнасилованы одним и тем же мужчиной. Аллели подозреваемого L не сочетались с аллелями пятен спермы.

Эти результаты подтверждали при по10

У троих отец/мать/ребенок все фрагменты потомства можно проследить. Каждый потомок содержит 3,4+0,5 ДНК-фрагментов, которые носят специфичное отцовское происхождение и равное количество специфичных для матери ДНК-фрагментов (испытано 10 троек отец/мать/ребенок).

Ф о р м у ла изобретения 1. Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях, предусматривающий гибридизаци- онный анализ геномной ДНК, который включает бкрининг библиотеки ДНК в фаге

мощи гибридизации сЯМЗ 31 и при помощи 15 путем гибридизации с пробой, и отбор позианализа фигнепринтов ДНК более значительных количеств судебных материалов. В свете этих данных, обвинения; выдвинутые против подозреваемого, были сняты прокурором.

П р и м е р 4.

Объединённые минисателлитные зонды. ... ..

Чувствительность минисателлитов в процессах гибридизации по Саузерну позволяет объединить зонды с тем, чтобы их использовать с целью обнаружения вариа- бельных фрагментов из нескольких участков одновременно, как это было сделано для объединения из 5 зондов (р A g 3, Я MS 1, Я MS 8, A MS 31 и Я MS 43). Теоретически количество фрагментов ДНК, которое можно обнаружить при помощи 5 зондов, 5 .. .. 5) (1+ Hi), где Hi .- гетерозиготность 1-го

зонда. Для этих 5 зондов в среднем может быть обнаружено 9,78 фрагментов на один индивид. На практике может быть разрешено 8,4 + 1,2 (ст. отклонение) полос 2 т.п.о. (испытано 40 случайно выбранных индивидов). Такая потеря разрешаемых полос частично объясняется исключением малых (1,6 т.п.о.) и относительно-распространен- . ных р Я g 3 аллелей {пример 1, средняя потеря на одного индивида 0,33 полосы), но в основном это результат совместной миграции при электрофорезе различных ми- нисателлитных аллелей.

Структуры пятен дот-гибридизации с несколькими участками дают высокую индивидуальную специфичность только с 18% (ср. отклонение + 11 %) ДНК-фрагментов, которые сочетаются у пар, случайно выбранных жителей Северной Европы (испытано 40 пар.). ...,. , .,. . .-:-,....-;,,..

20

25

30

35

40

50

55

тивных клонов с последующим выделением всей или части вставки, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности полинуклеотида, в качестве пробы используют последовательность 33,6 или 33,15, содержащую по меньшей мере 3 тандемных повтора, включая комплементарные последовательности: (А) AGGGCTGGAGG, где Т представляет собой Т или U, А может присутствовать или отсутствовать, или AGA GGTGGGCAGGTGG, где Т представляет собой Т или U, причем она в среднем имеет по меньшей мере 70% гомологии между всеми тандемно повторяющимися последовательностями и выявляют полинуклеотид, способный гибридизиро- ваться с ДНК-фрагментом, содержащим ми- нисателлит, специфический к конкретному участку или локусу генома, при этом указанный участок имеет аллельную вариацию по меньшей мере 3 (100).

(3) AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGG GCCAGGGAGPGGC

(4) GTGGAYAGG

(5) TGGQAGGTGGRYAGTGTCTG

(6) GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGA СТСА

(7) GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGG TGTTGG

(8) AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGA GTAC

(9) TGTGTGTAATGGGTATAGGCAGGGC CCCGGGAAGGGGGTCTGGYX (где Y обозначает С, Т или U, X обозначает G или С, R обозначает А или G и Т обозначает Т или U), или ее тандемную дупликацию (дупликации) или последовательность, комплементарную ей.

0

У троих отец/мать/ребенок все фрагменты потомства можно проследить. Каждый потомок содержит 3,4+0,5 ДНК-фрагментов, которые носят специфичное отцовское происхождение и равное количество специфичных для матери ДНК-фрагментов (испытано 10 троек отец/мать/ребенок).

Ф о р м у ла изобретения 1. Способ получения полинуклеотида для использования в генетических исследованиях, предусматривающий гибридизаци- онный анализ геномной ДНК, который включает бкрининг библиотеки ДНК в фаге

путем гибридизации с пробой, и отбор пози

0

5

0

5

0

0

5

тивных клонов с последующим выделением всей или части вставки, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности полинуклеотида, в качестве пробы используют последовательность 33,6 или 33,15, содержащую по меньшей мере 3 тандемных повтора, включая комплементарные последовательности: (А) AGGGCTGGAGG, где Т представляет собой Т или U, А может присутствовать или отсутствовать, или AGA GGTGGGCAGGTGG, где Т представляет собой Т или U, причем она в среднем имеет по меньшей мере 70% гомологии между всеми тандемно повторяющимися последовательностями и выявляют полинуклеотид, способный гибридизиро- ваться с ДНК-фрагментом, содержащим ми- нисателлит, специфический к конкретному участку или локусу генома, при этом указанный участок имеет аллельную вариацию по меньшей мере 3 (100).

(3) AGGAATAGAAAGGCGGGYGGTGTGG GCCAGGGAGPGGC

(4) GTGGAYAGG

(5) TGGQAGGTGGRYAGTGTCTG

(6) GAATGGAGCAGGYGRCCAGGGGTGA СТСА

(7) GGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAGG TGTTGG

(8) AGGCTGGGGAGATGGTGGAGGAAGA GTAC

(9) TGTGTGTAATGGGTATAGGCAGGGC CCCGGGAAGGGGGTCTGGYX (где Y обозначает С, Т или U, X обозначает G или С, R обозначает А или G и Т обозначает Т или U), или ее тандемную дупликацию (дупликации) или последовательность, комплементарную ей.