СПОСОБ ГЕНОМНОЙ ДАКТИЛОСКОПИИ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики и может найти применение в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве для определения происхождения тех или иных образцов ДНК, диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, подтверждения родственных связей между отдельными индивидуумами, идентификации личности, характеристики пород животных или сортов растений.

Известен способ определения родства с помощью приемов молекулярной генетики, получивший название геномной дактилоскопии (1). Способ основан на том, что ДНК любого индивидуума содержит специфические для него высокоинформативные локусы (последовательности). Эти локусы выявляют (детектируют), применяя зонды: олиго- или полинуклеотиды, имеющие последовательности нуклеотидов, комплементарные выявляемому локусу исследуемой ДНК, что обеспечивает индивидуально специфическую картину гибридизации (2).

Необходимые для определения соответствующие зонды (мультилокусные пробы), идентифицирующие распределение так называемых минисателлитов, были получены из миоглобинового гена человека, дикого типа ДНК фага М13, 3' гипервариабельной области альфа глобинового гена человека и из некоторых других участков генома человека и других организмов (3). Способ геномной дактилоскопии, основанный на использовании минисателлитных проб, позволяет получить высокодостоверные результаты при идентификации личности и определении родства. Однако его недостатком является трудоемкость отдельных этапов, низкая чувствительность используемых зондов, а также их малая доступность.

Известен способ геномной дактилоскопии, основанный на использовании в качестве гибридизационной пробы синтетических олигонуклеотидов, содержащих повторяющиеся мотивы из 2 4 оснований. Эти зонды способны детектировать в геноме человека и других организмов распределение простых тандемно повторяющихся гипервариабельных последовательностей (микросателлитов) (4) (прототип).

Анализ микросателлитов с помощью синтетических зондов имеет определенные преимущества перед полинуклеотидными минисателлитными пробами. Так, например, с помощью автоматизированного химического синтеза довольно быстро может быть получено до миллиграмма химически чистого вещества олигонуклеотида, тогда как для получения такого количества клонированных минисателлитных последовательностей необходимо осуществить продолжительную во времени процедуру выращивания рекомбинантных бактерий и очистки плазмидной или фаговой ДНК. Техника геномной дактилоскопии с использованием микросателлитов существенно проще, так как олигонуклеотиды могут быть использованы для гибридизации в высушенных агарозных гелях, что не требует переноса ДНК из агарозного геля на мембрану.

Однако этот способ имеет недостатки, поскольку применяемые в нем синтетические олигонуклеотиды дают слабый гибридизационный сигнал. Для получения достоверных экспериментальных результатов необходимо длительное время экспозиции мембран или гелей с рентгеновской пленкой или повышение количества образца для анализа, что не всегда выполнимо. Кроме того, олигонуклеотиды, используемые в гибридизации, имеют температуру плавления (T_пл), как правило, не превышающую 50^oC, что не позволяет проводить гибридизацию при высокой температуре. Определение при низкой температуре приводит к уменьшению специфичности способа.

Перечисленные недостатки известных способов вызывают необходимость поиска новых зондов с более высокой T_пл для реализации способа геномной дактилоскопии.

В принципе известны олигонуклеотиды, содержащие 5-метилдезоксицитидин (м⁵Ц) вместо дезоксицитимина (5), а также олигонуклеотиды, содержащие 2-аминодезоксиаденозин (ам²А) вместо дезоксиаденозина (6,7), которые имеют тоже высокую температуру плавления по сравнению с аналогичными немодифицированными олигонуклеотидами и применялись для гибридизации (5,7). Однако их использование для целей геномной дактилоскопии не описано и оставалось неясным, как использование таких зондов повлияет на специфичность и чувствительность данного способа.

Целью настоящего изобретения является создание нового способа геномной дактилоскопии, позволяющего увеличить чувствительность метода с сохранением высокой специфичности и разрешающей способности.

Техническим результатом, достигаемым при реализации настоящего изобретения, является повышение чувствительности способа геномной дактилоскопии. Практически важным следствием данного технического результата является снижение продолжительности определения, уменьшение количества анализируемой пробы ДНК, обеспечение возможности использования ³³P-метки в зондах вместо ³²P-метки, что повышает сохранность окружающей среды, повышает безопасность работы персонала, в то время как информативность способа при этом повышается.

Достигаемый технический результат выражается в следующих сравнениях. Время получения результата со стандартной пробой 96 ч. При использовании модифицированной пробы время снижается до 18 ч. Количество ДНК, требуемой для получения результата со стандартной пробой, 5-10 мкг. При использовании модифицированной пробы количество снижается до 0,5 мкг. Достигаемое уменьшение количества материала для анализа в 10 раз позволяет переход от забора проб крови из вены к забору проб из пальца, что увеличивает скорость и безопасность анализа и уменьшает его стоимость.

Это достигается предложенным способом геномной дактилоскопии, включающим детектирование полиморфных последовательностей в ДНК исследуемых индивидуумов с использованием в качестве зондов олиго- или полинуклеотидов, содержащих химически модифицированные азотистые основания, преимущественно олиго- или полинуклеотидов, с двумя или более типами химически модифицированных азотистых оснований, что приводит к повышению температуры плавления (T_пл) комплексов зондов с комплементарными последовательностями в геномах.

Примеры, приведенные ниже, иллюстрируют изобретение.

Пример 1. Получение модифицированных ДНК зондов.

Для реализации нового способа были получены олигонуклеотиды, комплементарные анализируемым локусам ДНК и содержащие нормальные (природные) азотистые основания. По известной методике (8), но с использованием вместо стандартных синтонов (защищенных нуклеотидов Ц и А) их химически модифицированных аналогов: м⁵Ц и ам²А были получены модифицированные олигонуклеотиды, содержащие либо один, либо два типа модифицированного аналога. При осуществлении метода геномной дактилоскопии наибольшую эффективность продемонстрировал модифицированный олигомер (ЦАЦ)₅: Ц^*А^*Ц^*Ц^*А^*Ц^*Ц^* А^*Ц^*Ц^*А^*Ц^*Ц^*А^*Ц^*, где Ц^* 5-метилдезоксицитидин, А^* 2-аминодезоксиаденозин. Дальнейшие испытания были проведены только с ним. Температуры плавления (T_пл) применяемых зондов рассчитывались по формуле: Т_пл 16.6 lg[M] + 0.41(%ГЦ) + 81.5 B/Д, где M концентрация ионов Na⁺, В 675, Д длина пробы,ГЦ процентное содержание Г+Ц (9). Для немодифицированного олигонуклеотда (ЦАЦ)₅ ΔT_пл различие в T_пл между модифицированными и немодифицированными пробами, вычислялось по формуле: DT_пл 0,14•У, где У ам²А или м⁵С в пробе (наши данные).

Пример 2. Геномная дактилоскопия образцов ДНК с использованием модифицированных и немодифицированных олигонуклеотидов.

Модифицированные и немодифицированные (ЦАЦ)₅ олигонуклеотиды применяли в сравнительных блот-гибридизационных экспериментах при тестировании одних и тех же ДНК человека. Два нитроцеллюлозных фильтра, содержащих одинаковые наборы рестриктированной с помощью фермента BspRI ДНК пяти неродственных индивидуумов, были гибридизованы в идентичных условиях с модифицированными и немодифицированными (САС)₅ зондами.

Использовали три различных температуры для отмывки фильтров. При температуре отмывки 25^oC очень высокое количество радиоактивности связывается с фильтром в случае модифицированных олигонуклеотидов, в то время, как стандартная (САС)₅ проба давала слабый сигнал на рентгеновской пленке. Аналогичная картина наблюдалась после увеличения температуры отмывки до 47^oC. При увеличении температуры отмывки до 60^oC величина интенсивности сигнала в варианте гибридизации с немодифицированной пробой фактически снижалась до нуля, в то же время модифицированная проба выявляла четкий набор гибридизующихся с ней фрагментов ДНК. Следует отметить, что для получения радиоавтографа было достаточно 18-часовой экспозиции фильтра с рентгеновской пленкой.

Аналогичные результаты были получены при использовании высушенных агарозных гелей без переноса ДНК на мембрану. Модифицированные олигонуклеотиды дают более интенсивный сигнал, чем стандартная (САС)₅ проба. В этом случае время получения радиоавтографа значительно сокращается из-за отсутствия потери ДНК, имеющей место при блотинге на мембрану.

Пример 3. Определение количества ДНК, необходимое для геномной дактилоскопии при использовании модифицированного (САС)₅ олигонуклеотида.

Чувствительность модифицированного зонда при геномной дактилоскопии определяли путем нанесения на дорожки геля разных количеств (5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,3, 0,1 и 0,05 мкг) рестриктированной ДНК. Описанные раннее в литературе зонды эффективно работают с 5 до 10 мкг ДНК в геле и времени экспозиции гелей или фильтров с рентгеновской пленкой в течение 1 4 дней (табл. 1).

При гибридизации с модифицированными олигонуклеотидами (новый способ) получают информативный и качественный радиоавтограф при экспозиции с рентгеновской пленкой в течение 18 ч и при 0,5 ДНК, наносимой на дорожку геля. При более длительных экспозициях детектируется 0,3 мкг ДНК.

Пример 4. Геномная дактилоскопия с использованием ³³P-модифицированного (САС)₅зонда.

Был проведен сравнительный анализ гибридизации в геле модифицированного олигонуклеотида, меченного с помощью ³²P или ³³P gАTP. Для этого были использованы высушенные гели, содержащие одни и те же рестриктированные образцы ДНК разных индивидуумов. Полученные результаты показали, что количество ³³P (САС)₅, связываемое фрагментами ДНК в геле, достаточно, чтобы получить высококачественный радиоавтограф после 18 ч экспозиции рентгеновской пленки без применения усиливающих сигналов. Замещение изотопа ³²P на ³³P позволяет достигнуть лучшего разрешения полос гибридизации в геле и существенно уменьшить радиационное облучение в процессе экспериментальной работы.

Источники информации
1. Jeffreys A.J. Wilson V. Thein S.L. Nature, 1985, 314: 67 73.

2. Ryskov A. P. Jincharadze A.G. Prosnyak M.I. et al. FEBS Lett. 1988, 233: 388 392.

3. Jeffreys A.J. Biochem. Soc. Trans. 1987, 15: 309 317.

4. Tautz D. Nucl. Acids Res. 1989, 17: 6463 6471.

5. Hoheisel J.D. Craig A.G. Lehrach H. J. Biol. Chem, 1990, 265: 16656 16660.

6. Chollett A. Kawachima E. Nucl. Acids Res. 1988, 16: 305 317.

7. Lamm G.M. Blencome B.L. Spront B.S. et al. Nucl. Acids Res. 1991, 19: 3193 3198.

8. Sinho N.D. Biernat J. McManus J. Koster H. Nucl. Acids Res. 1984, 12: 4539.

9. Davis L.C. Dibner M.D. Battey J.E. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publisher, 1986, N 4, p. 77.

10. Hundrieser J. Nurnberg P. Czeizel A.E. et al. Hum. Genet. 1992, 90: 27 33.

11. Nurnberg P. Roewer L. Neitzel H. et al. Hum. Genet. 1989, 84: 75 78.

12. Zischler H. Hinkkanen A. Studer R. Electrophoresis, 1991, 12: 141 - 146.

13. Pena S.D.J. Macedo A.M. Gontijo N.F. et al. Electrophoresis, 1991, 12: 146 152.

Использование: молекулярная биология, генетика. Сущность изобретения: для осуществления геномной дактилоскопии используют олиго- или полинуклеотиды, содержащие химически модифицированные азотистые основания, в частности 5-метилдезоксицитидин и 2-аминодезоксиаденозин. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ геномной дактилоскопии, включающий рестрикцию ДНК, гибридизацию рестриктированной ДНК с меченым олиго- или полинуклеотидом и оценку полученного результата путем сравнения с контрольным образцом, отличающийся тем, что олиго- или полинуклеотид содержит не менее двух химически модифицированных оснований. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что олиго- или полинуклеотид содержит 5-метилдезоксицитидин и 2-аминодезоксиаденозин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что олигонуклеотид представляет собой (м⁵ Ц ам² А м⁵ Ц)₅, где м⁵Ц - 5-метилдезоксицитидин, ам²А 2-аминодезоксиаденозин.