Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны Советский патент 1993 года по МПК C07K3/02 C07K15/08 A61K37/64 

можности выделения ингибиторов более широкого спектра действия.

Поставленная цель достигается предложенным способом, состоящим в том, что проводят гомогенизацию морской анемо- ны Stoichactis nelianthus, экстракцию, обработкуэкстракта раствором трихлоруксусной кислоты до ее конечной концентрации 5-10%, афиинную хроматог- рафию на трипсин-сефарозе в бикарбонат- ном или трис-HCi буфере 0,01-0,05 М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2-0,5М и ионов Са+2 10-30 т.М, элюируют ингибитор раствором хлористого калия в концентрации 0,5-1 М с рН 1,7-2, В качестве одновалентной соли могут быть использованы различные растворимые одновалентные соли, которые служат лишь для создания в раств орах ибнном силы, ра вной 0,2-0,5. 8 частности, такими солями могут быть дешевые, доступные и стабильные реагенты. Наиболее часто применяемые в аффинной хроматографи .-г, СГ,- ШОз, KB г, NH4N03, NH4CI. NaCI. NaBr. NaF, NaNOa.

Отличием предлагаемого способа явля- ется использование в качестве исходного сырья для получения ингибиторов протеаз морской анемоны Stoichactis nslianthus. обработка экстракта раствором трихлоруксусной кислоты в конечной концентрации 5-10%, осуществление аффинной хроматог- рафии на трипсин-сефарозе в бикарбонат- ном или трис-НСГ буфере 0,01-0,05М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2-0,5М и ионов 10-30 тМ, элюирование ингибитора раствором калия в концентрации 0.5-1М с рН 1,7-2.

Использование в качестве исходного сырья морской анемоны Stoichactis melianthus обеспечивает получение инги- битеров протеаз широкого спектра действия, способных ингибировать три основных типа протеаз: сериновые (трипсин), цистеи- новые (бромелаин) и аспартильные (пепсин)..Предлагаемая строгая последовательность стадии очистки: обработка трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 5-10%, аффинная хромчтография на трипсин-сефарозе в би- карбонатном или трис-HCI буфере 0,01- 0.05М в присутствии одновалентной соли в концентрации 0.2-0,5М и ионов 10730 .тМ, элюирование ингибитора раствором хлористого калия в концентрации 0,5-Ш с рН 1,7-2, обеспечивают повышение выхода ингибиторов до 150-200% и получение высокой степени очистки, более 90% активного ингибитора от веса препарата. Проведение элюирования ингибитора рас- твор ом КСГс ,7 пр йвЬ д т;1г сГнйжё нйю

0

0 5 0

5 5

0 5 0 5

активности ингибитора из-за его нестабиль-- ности в сильно кислой среде, а использовав ние раствора с приводит к уменьшению выхода.

Эта последовательность стадий обеспечивает разрушение комплексов ингибиторов с протеазами на начальном этапе, что дает выход, превышающий 100%, и благо-,, приятствует эффективному взаимодействию ингибиторов с трипсином при проведении аффинной хроматографии на трипсин-сефарозе. При аффинной хроматографии осуществляют удаление всех других белков, включая токсины,, содержащихся в экстракте морской анемоны, и получение ингибиторов в виде одного- пика. В некоторых случаях эта смесь инги-- « биторов может быть непосредственно использована. ИспЫ ьзаван й е на стадии системы равновесной элюции, которая сочетает в себе бикарбонатный буфер или трис-HCI от 0,01 до 0,05 М в присутствии,.-,; одновалентной соли и ионов Са от 10 до 30 тМ при рН 8, с последующей заменой элю- ирующего буфера на кислый раствор с рН 1,7-2, содержащий хлористый калий в концентрации 0,5-1 М, позволяет получить выход свыше 100%, содержание активных ингибиторов в препарате 50-70% (коммер- . ческий уровень).

Смесь ингибиторов может быть эффективно разделена при однократной гель- фильтрации на сефадексе G-50. При этом получают каждый ингибитор в отдельности и используют, если того требует применение, препарат более высокой ингибирую- щей способности. Использование 5-10 % уксусной кислоты в качестве элюэнтдпри хроматографии на сефадексе G-50 влияет на стабильность, эффективное разделение трех ингибиторов и позволяет - проводить прямую лиофилизацию ингибиторов. Выход на этой стадии составляет 90-100%. Основной ингибиторный пик имеет мол.мае. 9000- 10.000, содержит 93% активного ингибитора от веса препарата, (коммерческий уровень),

Предложенный способ иллюстрируется следующими примерами,

Пример 1. Цельные тела морской анемоны Stoichactis helianthus разрезают на маленькие кусочки, гомогенизируют в собственной жидкости, при этом происходит экстракция ингибитора, центрифугируют. Супернатанты можно хранить до их последующего использования либо замороженными при -20° С, либо в лиофилизозан- ном виде.

Полученный экстракт обрабатывают трихлору ксусной кислотой ) до ее конечной концентрации э смеси, равной 5%. Осадки, полученные после центрифугирования, промывают ТХУ. Обьединенные супер- натанты диализуют s течение 24 ч против буфера, использующегося при аффинной хромэтографии, причем в начале диализа замену буфера производят через каждый час. Эта обработка позволяет получить выход по ингибирующей активности от 100 до 150% по отношению к начальному экстрак-

ту.

Аффинную хроматографию на трипсин- сефарозе, содержащей 5-3 мг трипсина на 1 мл геля сефэрозы, осуществляют в бикар- бонатном или трис-Н CI буфере 0,01М з при- сутствии одновалентной соли 0.2М и ионов Сз+2 10 тМ при рН 7,3-8. После элюирова- ния первой белковой фракции проводят за- .мену элюирующего буфера на кислый растзор, с рН 1,7, содержащий хлористый калий в концентрации 0.5М. Это дает выход 150% по отношению к начальному этапу. Фракции, содержащие ингибиторную активность, диализуют против 5% уксусной кислоты, а затем лисфилизуют. Лиофилизо- ванный препарат, содержащий 50% активного ингибитора, растворяют в 5%-нсм растворе уксусной кислоты и подвергают гельхроматографии на сефадексе G-50, уравновешенном уксусной кислотой 5%. Гельхромзтография позволяет осуществить разделение трех изоингибиторов различного молекулярного аеса. Основной ингиби- тбрный пик с молекулярной массой 9000 получается с выходом 90% от общей инги- бирующей зктиэности и уровнем активности 93%. Его аминокислотный состав указан в табл. 1.

П р и м е р 2. Выделение и очистка ингибитора из морской анемоны проведены

с такой же последовательностью стадии, как и в примере 1, с той лишь разницей, что в качестве одновалентной соли использовали растворО.ЗБМ КС). Выход ингибитора 150%. После проведения гельхроматогрзфии на сефадексе G-50 препарат с м.м. 9000 содержит 93% активного ингибитора от веса препарата. Остальные примеры проведены с такой же последовательностью стадии, что описаны в примере 1.

Результаты примеров приведены в табл.2.

Ингибиторы протеаз, полученные этим способом, имеют функциональные свойства, не описанные ранее в специализированной литературе, т.е. каждый ингибитор в отдельности может ингибироззть широкий спектр протеолитических ферментов. Из трех очищенных ингибиторов, фракция с мол. массой 9000 и изоэлектричесхой точкой 8,4, является основной из-за своей высокой ингибирующей активности против трех ранее упомянутых протеолитичесхмх ферментов. Тщательное исследование этого ингибитора показывает следующие его свойства: очень высокая ингибирующая активность по отношению к трипсину и плаз- мину (+++), высокая ингибирующая активность по отношению к химотрипсину, папаину и бромелаину (++), ингибирующая активность средней силы по отношению к пепсину, химозину и кислой протеазе из Mucor miehei (+}. слабое ингибирование зла- стазы гранулоцитоа ().

Таким образом, предложенный способ по сравнению с прототипом позволяет получить ингибиторы протеаз с широкой специфичностью с повышением выхода до 150% и содержанием активного вещества около 90%.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ очистки ингибиторов протеаз из морской анемоны, предусматривающий го- -могениззцию тела животного, экстракцию ингибиторов, хроматографию и гель-хрома- тографию на сефадексе С-50, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода ингибиторов и обеспечения возможности выделения ингибиторов более широкого спектра действия, используют морскую анемону

mpafraarpZfii-. и

r-- -vryrrv

вида Stoichactis helianthus, полученный экстракт обрабатывают раствором трихлорук- сусной кислоты до ее конечной концентрации 5-10%, осуществляют аффинную хромзтографию на трипсинсефаро- зе в 0,01-0,05 М бикарбонатном или трис-HCl буфере з присутствии одновалентной соли в концентрации 0,2-0,5 М и ионов Сат2 в концентрации 10-30 мМ и элюируют ингибитор раствором хлористого калия в концентрации 00.5-1 М с рН 1,7-2.

Аминокислотный состав ингибитора протеаз (м.м 9 кД)

Влияние условия обработки и проведения аффинной хроматографии экстракта на результаты очистки

Таблица 1

Таблица2