Штамм микроскопического гриба BeaUVeRIa ваSSIаNа для получения энтомопатогенного препарата Советский патент 1993 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству биопрепаратов для защиты растений от вредных насекомых.

Известен штамм гриба Beauveria basslana CL 67-13 п, С267-ВП, используемый против тепличной белркрылки.

Недостатками известного штамма является невысокая вирулентность, что требует большого расхода препарата, а так же отсутствие пониженных аллергенных свойств.

Известен штамм Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. 80 № 4 для получения препарата против тепличной белокрылки.

Недостатком известного штамма является его сравнительно невысокая вирулентность и отсутствие пониженных аллергенных свойств.

Данный штамм принят за прототип.

Целью изобретения является получение штамма с повышенной вирулентностью и обладающего пониженными аллергенными свойствами.

Штамм гриба Beauveria bassiana 70 И отобран из серии вирулентных изолятов, активных в отношении вредных насекомых с примерно равными биологическими особенностями и пониженной аллергенностью в отношении теплокровных животных человека (табл. 1).

Экспериментальные исследования по выявлению сенсибилизирующей активности энтомопатогенных грибов проводили согласно Методических указаний по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и болезней на основе неспорообразующих микроорганизмов.

Сенсибилизацию морских свинок проводили троекратно подкожно в дозэх 107, 10 . 103 и 10 спор/животное на каждый исследуемый штамм. Тестирование осуществляли на 7-е сутки после последнего воздействия внутрикожным введением специфического антигена. Антиген получен в Казанском НИЙЭМ. Для выделения аллерч ю ел ю

00

ы

геноактивных компонентов из гриба В. bassiana в качестве экстрагирующей жидкости использовался 0,85% раствор NaCI pH 7,0 ± 0,2. Время экстракции биомассы гриба - 24 ч при t +4°. Полученный антиген представляет собой высокомолекулярный белковый комплекс, содержание белка 1,8 мг/мл, антиген атоксичен, активен в имму- нохнмических реакциях, при постановке внутрикожных проб на сенсибилизирован- ных животных в дозах 600 и 300 PNU и 0,1 мл дает положительные кожно-аллергиче- ские реакции. Антигены, полученные из различных штаммов В. bassiana обладают внутривидовым (штаммовым) перекрестом. Препарат активен в реакциях замедленного типа (ГЗТ), Оценка сенсибилизирующей активности проводилась на 3 местных штаммах (табл. 2, 3, 4).,

Данные КАП показывают, что при вве- дении дозы 107, 105 спор/животное сенсибилизация наступает при воздействии всех штаммов Beauveria bassiana, при поступлении дозы 10 и 10 спор/животное, признаки сенсибилизации развиваются у отдельных животных. Штаммы В. bassiana 80 Мг 4, В. bassiana 70 И, В. bassiana CL 67-13 п,

Остальные штаммы в указанных дозах проявляют высокую сенсибилизирующую активность. Это позволило рассчитать сред- неаллергенную дозу DVso, вызывающую сенсибилизирующий эффект у 50% животных (табл. 2).

Изучение сравнительной силы аллер- генности различных штаммов В. bassiana показало, что при тестировании морских свинок специфическим антигеном по показателям внутрикожных проб и среднеаллер

геннои дозе, рассчитанной по методу

Кербера в модификации Ашмарина И,П., Воробьева А.А., 1968, штаммы В. bassiana 80 N 4, В. bassiana CI 67-13 п, В. bassiana 70 И обладают пониженной аллергенной активностью.

Штамм депонирован в коллекции ВНИИ- защиты растений.

Штамм характеризуется следующими морфолого-физиологическими свойствами.

Колонии округлые, слегка приподнятые над субстратом, на 7-й день культивирования достигает 5-7 мм в диаметре, на 14-й день 7-11 мм.

Мицелий белый, мучнистый, легко берется, консистенции муки. Конидиеносцы короткие, зачастую ветвящиеся, средних размеров, располагаются в виде многочисленных скоплений вдоль гиф. Конидиеносцы с конидиями не создают округлых темных головок, а располагаются по всей

5

0 5

0

5

0

5

0

5

толще грибницы. Толщина мицелия 1,8-2,8 мк, Конидии яйцевидные или несколько округлые, 2,3-3,0 мк.

На гусеницах Galleria mellonella L мицелий белый, обильный, вначале войлочно- мучнистый, с возрастом порошащий.

На имаго Gomphocerus slbirlcus L вначале рост белого гриба между сегментами, впоследствии по всему покрову порошащий.

На имаго Trialeurodes vaporariorum Westw, белый, обильный, с возрастом мучнистый.

Гриб хорошо растет на отварах свеклы, моркови, а также на твердых питательных средах: пшено, овес, ячмень. Наиболее интенсивный рост на среде Чапека с добавлением 0,5% дрожжей, слабее - на сусло-агаре.

Физиологические признаки. Источник углерода. Используют глюкозу, сахарозу, лактозу, маннит, дульцит, мальтозу, сорбит, инозит и галактозу. Слабо ксилозу.

Источник азота. Используют пептон, мочевину, гликоль, азотно-кислый калий, азотно-кислый натрий, азотно-кислый аммоний, серно-кислый аммоний. Слабо использует хлористый аммоний. Штамм растет при 12-30°С, оптимальная температура роста 24-25°С, рН среды 5,2-5,8.

Пример 1. Обработку тепличной белокрылки в теплицах осуществляют водной суспензией препарата. Подготовка рабочего раствора водной суспензии препарата. Подготовка рабочего раствора водной суспензии препарата складывается из нескольких этапов.

Определение титра получаемого препарата.

Определение (взвешивание) необходимой навески препарата для обработки.

Навеску препарата помещают в двойной слой марли, отмывают конидии, смешивают с нужным количеством воды и после тщательного перемешивания используют для заправки опрыскивателя.

Опытный образец грибного препарата на основе В. bassiana готовят на жидкой питательной среде Чапека с добавлением 0,5% дрожжей в виде отвара, рН среды 5,2- 5,8. Время культивирования 14 дней при 24-26°С. Титр препарата составляет 198,3 млрд/г выход биомассы (масса сухой грибной пленки) 4,8 г на 1 л среды. Растения (огурцы), заселенные белокрылкой, обрабатывают суспензией с содержанием конидий 4« 107 в 1 мл. Техническая эффективность препарата на 7 сутки составила 74,1%.

Пример 2. Опытным образцом препарата на основе В. bassiana 70 И проиэведенным по тому же способу, что и в примере 1, обрабатывают садки с выходящими на коконирование личинками лиственичной муки (Charttophila lariclcola Karl.).

В каждый из трех садков помещали по 100 особей личинок лиственичной муки. Садки плотно закрывали проволочной сеткой и закапывали в лесную подстилку под

0

крону лиственницы. Спустя месяц садки разбирали и учитывали процент погибших личинок и коконов. В садках, обработанных подстилкой (расход препарата 5 кг/га при титре 2 млрд/г), было найдено 220 особей насекомых (личинок, коконов), из которых 150 особей погибло с явными признаками мускардиноза, что составляет в среднем 68,1 % от общего числа найденных особей.

Использование: микробиологическая промышленность, производство препаратов для защиты растений от вредных насекомых. Сущность изобретения: штамм гриба Beauveria basslana выделен из вирулентных изоляторов. Депонирован в коллекции ВИЗРа под N° 70И. Для получения препарата штамм культивируют на жидкой питательной среде Чапека с добавлением 0,5% дрожжей в виде отвара в течение 14 дней при 24-25°С. Получают биомассу гриба в виде пленки. Выход 4,8 г на 1 л культу- ральной жидкости (по сухому весу), титр 198,3 млрд/г. Для обработки растений используют суспензию с титром 4 107 спор/мл. 4 табл.

Формула изобретения Штамм микроскопического гриба Beauverla basslana ВИЗР № 70 И для получения энтомопатогенного препарата

Биологические особенности штаммов энтомопатогенного гриба Beauveria basslana, выделенных из патологического материала

Инокулирование Galleria mellonella III-IV возраста суспензий конидий 100 млн/мл. Данные окончательного учета смертности насекомых на 30-е сутки.

Дозы, вызывающие сенсибилизирующий эффект у 50% животных при подкожном введении

энтомопатогенных грибов.

Таблица 1

Та б л и ца 2

Внутрикожные аллергические пробы у морских свинок после подкожной сенсибилизации энтомопатогенными грибами

Показатели специфических аллергических реакций у экспериментальных . животных, сенсибилизированных различными штаммами

Таблица 3

Таблица 1