ШТАММ МИКРОМИЦЕТА ASPERGILLUS CARBONARIUS (BAINER)THOM - ПРОДУЦЕНТ МЕЛАНИНА Российский патент 1996 года по МПК C12P13/00 C12N1/14 C12N1/14 C12R1/66 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и, в частности, к получению новых штаммов микромицетов активных продуцентов меланина, являющихся эффективным биостимулятором роста растений и веществом, повышающим резистентность животных при облучении.

Известен гриб Aspergillus nidulans, образующий чернокоричневый пигмент [1] Недостатком известного штамма является относительно невысокое содержание внутриклеточного меланина, до 13% от сухого веса.

Известен гриб Aspergillus niger, черный пигмент которого изучался физико-химическими методами и был известен под названием аспергиллина [2] Недостатком известного гриба является также невысокое содержание, до 10% от сухого веса внутриклеточного меланина и отсутствие биосинтеза внеклеточного водорастворимого меланина.

Данная культура гриба принята за прототип.

Целью изобретения является получение штамма, продуцирующего меланин.

Для достижения этой цели предлагается новый штамм A.carbonarius, который позволяет получать меланин как внутриклеточный, так и внеклеточный, что значительно повышает эффективность этого штамма, как биостимулятора роста растений.

Штамм выделен из имаго большой вощинной моли (Galle- ria mellonella L.) с последующим монорассевом на агаризованную среду Чапека с дрожжами 0,5% и отбором колоний с выраженной черной пигментацией агара на 7-10 сутки. Штамму присвоен N 4х. Штамм хранится в коллекции НИИ биологии при Иркутском госуниверситете под тем же номером.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими особенностями.

На агаризованной среде Чапека с дрожжами (0,5%) растет довольно быстро, образует воздушный белый или серый мицелий. Конидиальные головки угольно-черные. Конидиеносцы бесцветные, внизу серые, серо-коричневые у вершины, 3-6 мм в высоту, иногда и выше, до 25 мк в диаметре с гладкими толстыми стенками до 4 мк толщины с шаровидной головкой до 90 мк в диаметре. Стеригмы в два ряда: стеригмы первого ряда черные в массе, иногда с перегородками 20-45 мк в маленьких головках и до 130 мк в больших, 3-6 мк шириной. Стеригмы второго ряда, 8-14•3-6 мк не такие вариабильные. Конидии сначала гладкие, при созревании шероховатые 5-11 мк в диаметре.

На средах, богатых органическим азотом, после 10-14- дневного культивирования продуцируется черный пигмент меланин, окрашивая среду до угольно-черного цвета.

Источники углерода. Максимальный выход биомассы зафиксирован на среде Чапека, где источник С глюкоза, меньше на среде с сахарозой, лактозой, сорбитом, дульцитом, инозитом, мальтозой. Плохо растет на среде с ксилозой и маннитом.

Источники азота. Использует пептон, гликоколь, азотнокислый калий, азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, сернокислый аммоний, мочевину, плохо усваивает хлористый аммоний. Хорошо растет на отварах свеклы, моркови, картофеля, гороха, ячменя, овса, пшеницы, пшена, слабый рост на отваре риса.

На отварах ячменя, овса, пшена, пшеницы и среде Чапека с пептоном, гликоколем, дрожжами в культуральную среду продуцируется меланин, окрашивая ее в черный цвет.

Гриб растет в широком интервале температур от 9 до 35^oС и рН среды от 3 до 8, оптимальные значения рН среды 5-6, температура 22-27^oС. Штамм нетоксичен для теплокровных, не имеет маркерных признаков. Штамм хранится на агаризованных средах Чапека с дрожжами (0,5%), 7%-ном неохмеленном пивном сусле в холодильнике.

Пересев через 6 мес.

При получении спорового препарата для выделения меланина используют металлические круглые кюветы (d 400 мм), где в стационарных условиях на жидкой или твердой питательной среде выращивается культура гриба при 22-27^oС в течение 10-14 сут. Полученная биомасса (споры с мицелием на твердой среде и споры, мицелий, культуральная жидкость на жидкой среде) служат основой для выделения меланина методом щелочной экстракции при повышенной температуре и давлении с последующим осаждением кислотой, последовательной многократной промывкой ацетоном, спиртом, дистиллированной водой.

Пример 1. В металлические круглые кюветы (d 400 мм) заливается жидкая питательная среда Чапека с дрожжами (0,5%), из расчета 3 л на кювету с рН 5-6, стерилизуется при 0,5 атм 30 мин два раза и затем засевается конидиями гриба A. carbonarius. Время культивирования 14 сут при 26^oС. Сухая биомасса после 14-дневного культивирования составляет 15 г/л. В жидкой идет постепенное накопление внеклеточного меланина, достигая своего пика на 14-17 сут. Выход внеклеточного меланина составляет 0,76 г/л среды, внутриклеточного 1,11 г/л при титре конидий 68 млрд/г.

Пример 2. Металлические круглые кюветы (d 400 мм) заполняются твердой питательной средой распаренной пшеницей. Среды стерилизуются при 1,5 атм в течение 35 мин, затем засеваются конидиями гриба A.carbonarius. Время культивирования 14 сут при 26^oС. Титр конидий в препарате составляет 4ф,62 млрд/г. Общий выход меланина с препарата (состав которого конидии и мицелий гриба, остатки среды пшеница) составляет 10 г/кг.

Пример 3. Исследовали действие 14-дневной культуральной жидкости (КЖ) A. carbonarius 4х, содержащей меланин, на прорастание семян гороха. КЖ получают, как описано в примере 1. Испытывают неразбавленную и разбавленную КЖ исходную 1: 1, 1:10, 1:100, 1:1000, которой в чашках Петри небольшим объемом (5-7 мм) заливают семена.

В контрольном варианте семена смачивали водой и жидкой средой Чапека.

Во всех вариантах использовали по 10 неколиброванных семян. На пятые сутки учитывали длину корешка и стебля.

Результаты учета представлены в табл. 1 и демонстрируют рост-стимулирующие свойства выделенного штаммом продукта.

Пример 4. Исследовали действие 14-дневной культуральной жидкости (КЖ) A. carbonarius 4х при производственном опыте в теплице совхоза "Тепличный" г. Ангарска. В этом случае культуральной жидкостью разбавленной в 100 раз, обрабатывались семена огурца сорта "Зозуля", процент прорастаемости семян составил в опытном варианте с КЖ 12,7% в контрольном варианте семена замачмвались в воде.

Затем этой КЖ в разведении 1:100 обрабатывали вегетирующие растения два раза, перед высадкой рассады в грунт и перед первым сбором огурцов. Данные учета урожая с опытного и контрольного участков приведены в табл.2. ТТТ1

Используется в микробиологической промышленности, получение биостимулятора роста меланина и касается нового штамма для получения меланина. Сущность изобретения: штамм микромицета Aspergillus carbonarius (Bainer) Fham выделен из имаго большой вощинной моли. Штамм хранится в коллекции НИИ биологии при Иркутском госуниверситете под N 4х, депонирован в ВКПМ под N В-721. При культивировании штамма на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, продуцирует 0,76 г/л среды внеклеточного меланина, 1,11 г/л внутриклеточного при титре конидий 68 млрд/г. 2 табл.

Штамм микромицета Aspergillus carbonarius (Bainer) Thom ВКПМ В-721 - продуцент меланина.