Проточная фотометрическая кювета Советский патент 1993 года по МПК G01N21/09 

Изобретение относится к оптическому приборостроению, а именно к технике измерения оптико-спектральных свойств растворов и гелей.

Цель изобретения - повышение точности измерений и расширение класса исследуемых веществ.

На фиг. 1 и 2 представлена проточная фотометрическая кювета в разрезе и вид сверху; а на фиг. 3 - фрагмент кюветы с куполообразным улавливателем пузырьков воздуха в разрезе.

.;..:. Проточная фотометрическая кювета состоит из последовательно соединенных друг с другом измерительных прямоугольных отсеков 1-5, оптические толщины которых дискретно убывают от одного конца .кюветы к другому. Измерительные прямоугольные отсеки 1 -5 являются составными частями граненого с внешней и внутренней

сторон полого полукольца с гранями 6 - 15, выполненного монолитно с сглаживающими переходами между отсеками, причем полукольцо сужается от входного отверстия 16 к выходному отверстию 17, расположенному соответственно во внешних гранях 6 и 15. Грани 6,8,10,12,15 на внешней стороне полукольца и грани 7. 9, 11, 13. 14 на внутренней стороне полукольца служат плоско- параллельными оптическими окнами проточной кюветы, ее измерительных прямоугольных отсеков 1 - 5, в которых происходит ориентация молекул и микрочастиц анизометрической формы при протекании раствора или гельобразного вещества через кювету. Входное 16 и выходное 17 отверстия обеспечивают подачу жидкости и ее отток из проточной кюветы. Устройство содержит куполообразный улавливатель 18. Измерительные прямоугольные отсеки 1 и 5

соединены расположенным над кюветой патрубком 19, предназначенным для отсоса пузырьков воздуха, попадающих в рабочую полость отсеков 1 - 5. Для улавливания этих пузырьков воздуха (на фиг. 2 показанных малыми кружками со стрелками) внутри кюветы над входным отверстием 16 установлен сообщающийся с патрубком 19 куполообразный улавливатель 18 (фиг. 3) здесь пузырьки воздуха также показаны эллипсами со стрелками в направлении их движения. Кювета зажата в держатель 20, выполненный таким образом, чтобы полое полукольцо могло фиксированно вращаться относительно своей оси. В держателе имеются фиксирующие отверстия и фиксатор 21. Внешний радиус R полого граненого полукольца связан с числом граней п и шириной S измерительного светового пучка со- м . ..: ;. я: отношением R 5:------.

2sin(90Vn)

Устройство работает следующим образом, .. ; ; - ; ,

Исследуемое жидкое или полужидкое вещество подается под давлением через входное отверстие 16 с патрубком внутрь кюветы, где формируется ламинарный гидродинамический поток при оптимально выбранной скорости его течения (на фиг. 1,2 и 3 ламинарный гидродинамический поток обозначен прямыми стрелками, турбулентность и завихрения - кривыми стрелками). Благодаря различной оптической толщине измерительных прямоугольных отсеков 1 - 5, оптическая плотность протекающего через них раствора или геля различна. Различна также степень ориентации молекул и микрочастиц этого раствора или геля. Вращением держателя 20 вокруг оси полукольца выбирают такое его фиксированное положение относительно светового луча (на фиг. 1, 2 световой луч показан большой стрелкой через всю кювету), которое обеспечивает высокую точность производимых поляризационных оптико-спектральных измерений (на фиг. 1, 2 показана фиксация кюветы, когда световой луч измерительного прибора проходит через измерительный прямоугольный отсек 3 с гранями 10, 11, являющимися плоскопараллельными олти- ; ческими окнами кюветы). Пузырьки воздуха, неизбежно попадающие в рабочую полость кюветы с потоком жидкости, стремятся подняться, попадают под купол улавливателя 18 И через патрубок 19 уносятся к выходному отверстию 17 благодаря отсасывающему действию сужающейся к выходному отверстию 17 струи раствора, которое обусловлено эффектом сифонирования.

Для проведения измерений оптико- спектральных параметров полужидкого геля кювета заполняется через входное отверстие 1 б реагентами с исследуемым веществом, необходимыми для получения геля, который формируется непосредственно в кювете в статических условиях. После формирования геля через входное отверстие 16 под давлением подается воздух или инертная жидкость, которая продвигает гель к узкому концу кюветы, таким образом обеспечивая ориентацию содержащихся в нем молекул или микрочастиц. Кювета фиксируется относительно светового луча таким образом, чтобы обеспечить высокую точность проводимых измерений. При этом фиксатор 21 попадает в необходимую фиксирующую отверстие-лунку,

Благодаря выпол нению п роточной фотометрической кюветы монолитной в виде сужающегося к одному концу граненого с внутренней и внешней сторон полого полукольца таким образом, что грани служат оптическими окнами а измерительных прямоугольных отсеках/обеспечиваются неразрывность потока раствора или гельобразного вещества. Это позволяет создать в рабочей полости кюветы в достаточной степени хороший ламинарный гидродинамический поток жидкости и неразрывность геля; что необходимо для максимальной ориентации

молекул или микрочастиц, находящихся в них, для создания однородности потока исследуемой жидкости или геля, что обеспечивеет повышение точности проводимых измерений, а также расширение класса исследуемых веществ.

Благодаря выполнению входного и выходного отверстий в гранях измерительных

отсеков с максимальной и минимальной оптическими толщинами соответственно, дополнительно соединенных расположенным над кюветой патрубком, причем внутри кюветы над входным отверстием установлен

сообщающийся с патрубком куполообразный улавливатель пузырьков воздуха обеспечивается непопадание этих пузырьков в рабочую полость каждого из измерительных прямоугольных отсеков проточной кюветы,

что повышает точность оптико-спектральных, а в особенности поляризационных измерений. Эти же отличительные признаки позволяют оставить неразрушенной структуру тиксотропного геля, что расширяет

класс исследуемых веществ.

Благодаря выполнению держателя кюветы с возможностью ее вращения вокруг своей оси, т. е. оси полукольца, внешний радиус которого R связан с числом граней п и шириной измерительного светового пучка

S соотношением R

----, обеспе- 2sin(9aVn) чивается перпендикулярность оптических окон измерительных прямоугольных отсеков кюветы, т. е. ее граней, световому лучу, что устраняет погрешности, вызванные отражением поляризованного светового луча на этих гранях. Кроме того, возможны измерения поляризационных характеристик полужидких гелей после нахождения вращением кюветы и фиксирования такого ее положения, которое обеспечивает удовлетворительность этих измерений. В особенности это касается твердых гелей, которые чаще претерпевают разрывы и искажения. Таким образом, это обеспечивает также расширение класса исследуемых веществ и позволяет выполнить кювету компактной, еоразмеримой с кюветными отделениями большинства оптико-спектральных приборов, так как перемещение ее относительно светового луча не ведет к продольным перемещениям ее в кюветном отделении прибора, как в случае кюветы-прототипа.

Пусть R-радиус окружности; описанной вокруг внешней стороны полого граненого с внешней и внутренней стороны полукольца проточной фотометрической кюветы, I - длина грани полукольца вдоль окружности; d - дуга окружности, описанная вокруг грани; а - угол между радиусами-векторами, приведенными из центра окружности к концам дуги; S - ширина светового пучка измерительного прибора. Исходя из описанных геометрических построений, радиус окружности можно выразить следующим образом

.4 - . -.-

:(1)

- 1Г

где п - число граней в полукольце на внешней (внутренней) стенке кюветы. Длина дуги равна

(2)

о, d

jrR 18QP

(3) 2arcsln7Tn:

L п

arcsln

и радиус окружности I

«- я

2 R Отсюда окончательно

-R- 2 sin (90°/n)

(6)

Формула (6) получена для идеального случая правильного полумногогранника с числом граней п, вписанного в окружность радиуса R, Однако заявляемая кювета вы- 5 полнена монолитной со сглаживающими переходами между измерительными прямоугольными отсеками, которые имеют конечную длину. Следовательно,

10/2sio(90Vn)

Размеры граней проточной кюветы (размеры оптических окон) изготавливаются таким образом, чтобы через них полностью, не зарезаясь. проходил световой пучок измерительного прибора, имеющий размеры S. Обычно I S. Таким образом,

-- R s. ;

2sin(90P/n)

Пример . Исследовали водно-ацетоновый раствор пигмента фотбсинтезирую- щих организмов-феофитинэ, который

представляет собой раствор коллоидных микрочастиц, ассоциатов палочкообразной формы. Для определения их размеров, а также экситонных параметров, необходимо измерить параметры их светорассеяния,

линейного дихроизма и поглощения. Для этих целей использовали серийные приборы Spectropol - 1, применяемый в качестве линейного дихрографа, и Unlearn SP-800, применяемый для регистрации спектров по:

глощения и светорассеяния. Концентрация пигмента в растворе составляла М, соотношение растворителей составляло величину 1:1. Проводили два типа измерений: в известной кювете; в данной кювете. Через эти кюветы исследуемый раствор непрерывно прокачивали с помощью перистальтического насоса. При этом иногда в каналах прокачки обнаруживались пузырьки воздуха. 8

случае использования известной кюветы эти пузырьки проходили через измерительные отсеки. В случае же данной кюветы пузырьки воздуха в прокачиваемом растворе улавливались куполообразным улавливателем и выводились из рабочей полости по расположенному над проточной кюветой патрубку, не препятствуя проведению измерений. Погрешность измерения линейного дихроизма с помощью кюветы-прототипа

составляла ±8-13 % в зависимости от количества попадаемых в измерительную рабочую полость пузырьков воздуха. Точность измерения линейного дихроизма раствора феофитина при использовании данной, кюветы выше: погрешность измерений в этом случае составляет ±5 - 7 %, т, е. обычную для данного класса приборов. Возрастание погрешности измерения линейно- гаДИхрЬизмапри использовании известной кюветы по сравнению с использованием данной кюветы почти в два раза обусловлено тем, что поляризационные оптические и спектральные характеристики очень чувствительны к попаданию пузырьков воздуха в измерительную рабочую полость проточной кюветы.

Так, при оптической толщине измерительных отсеков обеих проточных кювет, равной 0,2 см, амплитуда дихроичной полосы в длине волны 691 нм, измеренная из спектра линейного дихроизма, зарегистрированного на дихрографе 5рес1горо1 - 1, равна 1,2 при использовании для измерений данной кюветы и 1,08 10 при использовании известной кюветы, т. е. на 10 % заниженное значение. В результате этого S-образный сигнал линейного дихроизма для экситонного расщепления в микрокристаллах феофитина в случае применения кюветы-прототипа был не симметричен, что затрудняло расчет величин истинного рас- щепления в спектре, а также положения спектральных разрешённых компонентов экситонного дублета, их полуширин, и приводило к значительной погрешности определения этих параметров (величина истинного расщепления определяется с погрешностью ±15 нм, положения спектральных компонентов экситонного дублета ±4 нм, их полуширины ±3 нм). В случае же симметричного S-образногб сигнала линейного дихроизма для экситонного расщепления в микрокристаллах феофитина в случае применения данной кюветы (теоретически правильный сигнал является строго симметричным) позволяет определить величину истинного расщепления с погрешностью ±2 нм, положение спектральных компонентов экситонного дублета ±1,5 нм, их полуширины ±1 нм, Т, е. увеличение погрешности измерения амплитуды линейного дихроизма для экситонного расщепления в микро- кристаллах феофитина, взвешенных в водно-ацетоновом растворе, прокачиваемом через кюветы с целью их ориентации в ламинарном гидродинамическом потоке и индуцировэния, отличного от нуля линейного дихроизма, в два раза при использовании известной кюветы по сравнению с исполь зованием данной кюветы, вызывает появление погрешности в расчетах зкситонных параметров микрокристаллов в 3 - 7 раз.

Регистрация спектров поглощения этих растворов на спектрофотометре Unlearn SP0

5

800 приводит к погрешности измерения амплитуд полос поглощения с использованием известной кюветы ±7 - 9 %, с использованием данной кюветы ±3 - 4 %, т, е. обычную

для данного класса измерительных прибо- ров. :v;; / . : :;;:; г- .:

Регистрация параметров светорассеяния в случае использования данной кюветы дает погрешность измерений ±1 %, а

0 в случае использования известной кюветы .±15- 20 %, что приводит к соответственно большей погрешности определения размеров микрокристаллов феофитина.

Приме р 2. С использованием данной

5 кюветы и известной кюветы проводили исследования поляризационных характеристик различных веществ в лолиакриламидном геле. Полиакриламидный гель является полимером акриламида и метилен-бис-акрила0 мида. Будучи в одноосн о ориентирован ном состоянии, полиакриламидный гель дает возможность исследования линейного дихроизма и дисперсии оптического вращения различных ферментов, лептидов, полимлеп5 тидных гормонов, протеинов, ряда биологически активных препаратов и растворимых в нем лекарственных веществ, биологических и микробиологи ческих объектов. ; Полимеризацию ;водного раствора ак0 риламида с растворенным в нем гемоглобином осуществляли непосредственно в используемых кюветах, после чего подбирали оптимальную для проведения измерений оптическую тол щину измерительного пря5 моугольного отсека путем горизонтального перемещения известной кюветы в держателе перпендикулярно световому лучу прибора Spectropol -Ти путем вращения данной кюветы вокруг оси полукольца1, внешний ра0 диус которого связан с числом граней (в нашем случае равном 5, см. фиг. 1)собтно- S

шением R S. Данная кювета

2sin(9(F/s) была изготовлена таким образом, что ради- ус R был равен 4 см при ширине светового пучка S 1 см.

Ориентацию полиакриламидного теля с гемоглобином осуществляли продавливани- ем геля через измерительные прямоугольные отсеки кюветы сжатым воздухом, подаваемым через входное отверстие. В случае использования данной кюветы про- давливание и продвижение геля вдоль опти- ческих окон измерительных отсеков происходило равномерно, плавно, без разрывов и разломов гельобразной среды, с максимальной ориентацией включенных в нее молекул гемоглобина. При этом суммарное вращение плоскости поляризации, регистрируемое прибором Spectropo лине волны 410 нм равно 7 Ю 2 г

- 1 в

лине волны 4Ю нм равно 7 -Ю - градуса ля оптическрй толщины измерительного канала 0,5 см. Измеренный спектр суммар- ного вращения плоскости поляризации ори- 5 ентированного гемоглобина несет ценную информацию о максимумах полос электронных переходов в ультрафиолетовой части спектра так Называемой области полосы Соре, которые в обычных прглощательных 10 спектрах не проявлялись в явном виде. В случае использования для измерений суммарного вращения плоскости поляризации известной кюветы продаеливание и продвиение геля вдоль оптических окон измери- 15

ельных отсеков происходило неравномерно, с разрывами и разломами гелевой

мэссы, с ее деформацией, с образованием многочисленных трещин, вследствие чего измерения провести невозможно (погреш- 20 неметь достигает 200 % и более). Т. е. использование данной кюветы расширяет класс исследуемых веществ в данном случае позволяет корректно измерить суммарное вращение плоекрсти поляризации полиакриламид- 25 HWX гелей, содержащих гемоглобин. : Приме р 3. С использованием данной кюветы и известной кюветы проводили мэ- epe«}ie спектров суммарного вращения плоскости поляризации (линейный дихро- 30 изм . + дисперсия. оптического вращения) 2-х. % - полиакриламидных гелей, содержащих интрацитоплазматическме мембраны культуры фотЬсинтезирующих бактерий Chrbmatium mlnutissimum. Полимеризацию 35 геля осуществляли вне кюветы, прокачивая eto через проточную кювету при Помощи поршня. Состояние геля было полужидким, он был текучим. Протекая по проточной квдвёте, гель с внедренными в него мемб- 40. ранами культуры ориентировался одноосно. При этом наряду с оптическим вращением плоскости поляризации за счет оптической активности, наводилось вращение плоскости поляризации за счет линейного 45 дихроизма,

В случае применения известной кюветы погрешность измерения амплитуд спектра оставляла ±15 - 20 %, поскольку в измерительные отсеки кюветы попадали пу- 50 эырьки воздуха, а также вследствие неравномерности прохождения геля по раочей полости кюветы. В случае применения данной кюветы погрешность измерений оставила обычные для данного класса при- 55 боров Spectropol+5 - 7 %, так как пузырьки оздуха не попадали в рабочую полость и гельобразная среда проходила по проточноу измерительному тракту равномерно без

разрывов. Так в длине волны 375 нм амплитуда полосы спектра суммарного вращения плоскости поляризации в случае применения известной кюветы равна 2,2 102 градусов 0,4 градусов, а в случае применения предлагаемой кюветы 2,2 102 ± О,12 градусов;. :,. : ...

Скорость ламинарного гидродинамического потрка полужидкого геля с цитоплаз- матичеекйми мембранами в обоих случаях составляла 1 см/с. При увеличении скорости потока до 2,5 ем/с ламинарность сохранялась, ориентация геля и мембран в известной кювете и Данной кювете возрастала, амплитуды спектра суммарного вращения плоскости поляризации также увеличивались, но не пропорциональным образом: в данной кювете эффективность ориентации была выше, что обуславливало более высокое приращение амплитуд спектра и большую точность их измерения по сравнению с вариантом известной кюветы. При увеличении скорости потока до 4 см/с ламинар- ность потока полужидкого геля в данной кювете сохранялась, амплитуды спектра увеличивались еще больше, точность их измерения при этом была максимальна, погрешностьсоставляет предельные ±5 %. Ламинарность гидродинамического потока в кювете-прототипе нарушалась что проявлялось в падении амплитуд спектра ниже величий, регистрируемых при скорости потока 1 см/с. Погрешность измерений при этом возрастала до ±80 %, т. е. до значений, при которых невозможно проводить оптические поляризационные измерения. Таким образом, применение данной кюветы .позволяет повысить точность оптико-спектральных измерений и расширить класс измеряемых, веществ, а данном случае полиакриламйдного полужидкого геля, содержащего интрацитоплазматические мембраны культуры фртосинтезирующих бактерий, при скоростях гидродинамического потока 4 см /с.

П р и мер 4. С использованием данной кюветы и известной кюветы измеряли линейный дихроизм раствора ассоциированного рибофлавина в дистиллированной воде (для определения растворов степени соста- ривания препарата) По мере старения водных растворов рибофлавина увеличивается способность препарата к ассоциации, о чем свидетельствует появление и возрастание у этих растворов в условиях их протекания через проточные кюветы линейного дихроизма в длинах волн 352 и 420 нм. В тоже время растворы, полученные из термообработанного и обработанного С02лазером порошка препарата, гораздо более длительно сохраняют твою нативность, не агрегируя. Линейный дихроизм их при этом

равен или близок к нулю.

. - -. -.; -; .

Использование известной кюветы по- зволдет измерить амплитуды спектра линейного дихроизма состарившегося препарата с низкой точностью, так как ламинарность гидродинамического потока на Стыках-перехр- дах в измерительных отсеках отсутствует из-за извилистости отсеков, из-за несораз- меримости толщин переходов и толщин отсеков. Погрешность измерений в этом случае составляет ±60%, т.е.. измеренная величина амплитуды полосы линейного дих- роима явно не соответствует степени ассоциации рибофлавина, а следовательно информация о его степени состаривания не достоверна.

Использование данной кюветы позволяет измерить амплитуды полос в спектре линейного дихроизма с максимумами при длинах волн 353 и 420 нм достоверно с точностью ± 5 - 7 %, т. е. позволяет доетрвер- но судить о степени состаривания препарата рибофлавина в его водной лекарственной форме.

На основании того, что после термообработки порошков рибофлавина линейный дихроизм его водных растворов длительное время равен нулю, т. е. препарат длительное время не агрегируется в лекарственной форме и на основании того, что препарат при обычном его растворении в воде и вы- держивании в обычных условиях проявляет склонность к агрегированию, что проявляется в ориентации ассоциатов рибофлавина в гидродинамическом потоке в заявляемой проточной фотометрической кювете, был предложен в заводской и аптечной практике новый способ стерилизации данной яекарственной формы: вначале раздельная термостерилизация порошка рибофлавина в термостате или СОг-лазером, а затем растворение этого порошка в уже стерилизованной ранее воде для инъекций. Положительный эффект, достигаемый данным способом, состоит в увеличений количества основного действующего вещества в яекар- ственной форме и в повышении качества лекарственной формы в целом, поскольку доказано, что агрегация препарата происходит из-за его разрушения (до 7,5 % от общего его количества) при стерилизации лекарст- венной формы термообработкой рибофлавина в растворенном состоянии в воде.

Нативность препарата рибофлавина после стерилизации его новым методом доказана при помощи спектральных исследований

дисперсии оптического вращения, ядерного магнитного резонанса.

Таким образом, применение данной кюветы для измерения линейного дихроизма, ориентированных в гидродинамическом потоке анизометрических ассоциатор рибофлавина, поз оляет получить весьма чувствительный тест на агрегацию этого препарата в вод и их растворах. Применение этого теста для определения степени агрегации рибофлавина при различных методах его стерилизации (что необходимо для получения лекарственной формы, например, глазных витаминных капель) позволило предложить новый метод стерилизации препарата для получения высококачественной его лекарственной формы, Это стало возможным благодаря повышению точности измерений линейного дихроизма и расширению класса исследуемых веществ, в данном случае стало возможным измерение поляризационных характеристик коллоидных ассоциированных растворов рибофлавина. :. I.; : .. ..--- . : ;. : -

Измерение спектров поглощения растворов рибофлавина в воде с использованием спектрофотометра Unlearn SP-800, применяя известную кювету, позволяет определить амплитуды полос с погрешностью ±8 -13 % в зависимости от количества по- падаемых в рабочую полость кюветы пузырьков воздуха, а применяя данную кювету ±5 - 7 %. т. е. с обычной для данного класса приборов погрешностью.

Измерение светорассеивающих характеристик ассоциированных растворов рибофлавина с применением известной кюветы позволяет определить размеры агрегатов рибофлавина с погрешностью 15 - 20 %, так как велико влияние на результаты измерений попадаемых в измерительные каналы пузырьков воздуха, в то время как измерение этих характеристик с применением данной кюветы дает погрешность ±10-12%.

Таким образом, использование предлагаемой кюветы для оптико-спектральных измерений в ряде случаев более чем едва раза снижает погрешность измерений, расширяет класс исследуемых веществ. Кроме того, использование этой проточной фотометрической кюветы позволяет разрабатывать новейшие технологии приготовления лекарственных форм. Кювета проста в изготовлении, удобна в обращении, компактна.

Ф Ь рм у л а и з.о б рете н и я . Проточная фотометрическая кювета, содержащая последовательно соединенные

друг с другом прямоугольные отсеки с плоскопараллельными оптическими окнами, образующие канал для образца с входным и выходным отверстиями, причем расстояние между оптическими окнами последовательно убывает от входного отверстия к выходному, а кювета установлена в держателе с возможностью перемещения относительно оптической оси, о т-л и ч а ющ а я с я тем, что, с целью повышения точности измерений и расширения класса исследуемых веществ, прямоугольные отсеки кюветы

- А-Д

.- ;-- . : ;. . : .-- к

расположёны полукольцом на держателе, выполненном с возможностью поворота вокруг оси полукольца, кювета выполнена монолитной, входное и выходнде отверстия выполнены во внешних прямоугольных отсеках с максимальным и минимальным зазорами соответственно и дополнительно соединенным патрубком, причем внутри кюветы над входным отверстием

установлен куполообразный улавливатель пузырьков воздуха, служащий началом патрубка.