Ферментный электрод, амперометрически реагирующий на присутствие субстрата соответствующего фермента в анализируемом образце Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/00 

СО

с

Использование: биохимия, клиническая биохимия, техническая микробиология. Сущность изобретения: ферментный электрод, состоящий из фермента (оксидазы, обычно глюкозооксидазы), иммобилизованного на поверхности палладизированного или платинизированного угольного или гра- фитивого слоя, обладает способностью ам- перометрически реагировать на присутствие субстрата данного фермента в жидком образце, контактирующем с электродом. Электрод демонстрирует линейность в широком диапазоне концентраций, хорошую скорость ответа и высокую операционную стабильность также, как и стабильность при хранении. 3 з.п. ф-лы, 19 ил.

Изобретение относится к ферментным электродам, состоящим из фермента, обез- дВиженного на электропроводной подложке, и реагирующим амперометрически на каталитическую активность фермента в присутствии соответствующего ему субстрата. В особенности, но не исключительно, настоящее изобретение относится к электродам, которые могут использоваться для детектирования уровней глюкозы как in vitro, так и in vivo и которые содержат электропроводную подложку, на которой иммобилизована оксидоредуктаза, например, глюкозооксидаза, причем электрод амперометрически реагирует на каталитическую активность иммобилизованного фермента, когда он введен в глюкозосо- держащий образец.

Цель - повышение эксплуатационных характеристик электрода.

В соответствии с настоящим изобретением в ферментном электроде используется новая угольная подложка, позволяющая закреплять фермент, например глюкозоокси- дазу, на электроде более эффективно, что делает конструкцию амперометрического датчика намного более быстродействующей и стабильной. В этом усовершенствовании ферментном электроде нет необходимости использовать посреднический реагент (хотя, при желании, его можно ввести) и как было установлено, он работает в присутствии очень малых уровней растворенного кислорода. Он дает большие выходные сигналы, например, плотности тока, равные сотням микроампер на квадратный санти00

о

:Ю

iCO

метр (кажущейся площади электрода) в растворе глюкозы 10 мМ. Это, очевидно, намного больше, чем в любом другом ранее известном амперометрическом ферментном биодатчике, и может эффективно исполь- зеваться для изготовления микропробных биодатчиков с площадью электрода менее 1 мм , дающих ток от 0 до 100 наноампер. Электрод можно изготовить, используя очень малые количества иммобилизованно- го фермента. Он реагирует на глюкозу значительно быстрее, чем известный глюкозный датчик, как правило в течение 1-2 с при отсутствии защитной мембраны и в течение 10-30 с с мембраной. Он обладает очень хорошей стабильностью при хранении во влажном состоянии даже при комнатной температуре; электроды дают хороший выходной сигнал даже спустя несколько месяцев. Они имеют расширенный рабочий диапазон, нуждаются в значительно более низком рабочем потенциале, чем нормальный рабочий потенциал (325 мВ по сравнению с более распространенным потенциалом 650 мВ) и имеют очень низкий фон при рабочем потенциале.

Основой настоящего изобретения является ферментный электрод или биодатчик, содержащий фермент, иммобилизованный на поверхности электропроводной под- ложки, состоящей или включающей пористый слой угольных или графитных частиц, связанных смолой. Эти частицы тщательно перемешаны с тонко измельченным металлом платиновой группы, либо осаждены или адсорбированы на поверхности отдельных частиц перед связыванием их с образованием указанного слоя, в результате получается пористый слой подложки, в который указанный фермент адсорбируется или иммобили- зуется и который образует существенно гетерогенный слой угольных или графитовых частиц, связанных смолой, с диспергированным практически равномерно по всему слою металлом платиновой группы. Таким образом, специфическое отличие электрода в соответствии с настоящим изобретением заключается в том, что электрод представляет собой практичеки гетерогенный слой угольных или графитовых частиц, связанных смолой, в котором по существу равномерно по всему слою диспергирован металл платиновой группы. Слой угольного порошка со смолой в качестве связующего рекомендуется изготовлять из частиц уголь- ного порошка, связанных смолой, на которые перед формовкой подложки осаждают или адсорбируют коллоидальные платину или палладий. В качестве связующих смол при формовке электродной подложки, используемой в настоящем изобретении, из платинированных угольных частиц рекомендуется использовать фторуглеродистые смолы, особенно политетрафторэтилен.

Рассмотрим конструкцию ферментного электрода в соответствии с настоящим изобретением более подробно. Как указывалось, предпочтительный вариант электрода содержит слой угольного порошка, связанного смолой, в котором на поверхности частиц порошка перед связыванием их адсорбирован металл платиновой группы, например,платина или палладий.

В качестве угольного порошка может использоваться любой угольный или графитовый порошок, который легко допускает последующую иммобилизацию фермента, а для этого необходимо использовать угольные порошки, имеющие большую плотность функциональных групп, например карбоксильные, аминные или серосодержащие группы, на поверхности, в отличие от более стекловидных углей, которые плохо связывают ферменты. Размер частиц может лежать в пределах от 3 до 50 нм, обычно от 5 до 30 нм.

Платина (или палладий) может быть нанесен на угольные частицы любым известным способом, например осаждением парообразной фазы, электрохимическим осаждением или простой адсорбцией из коллоидной суспензии (что предпочтительнее), чтобы нагрузка металлом платиновой группы составила от 1 до 20 мас.% угля, желательно от 5 до 15 мас.% Однако эти пределы указаны скорее из практических соображений, чем изтеоретических. При количестве металла платиновой группы менее 1% выходной сигнал падает до уровня, который на практике слишком низок и не поддается измерению, если не пользоваться очень чувствительным прибором. При количестве более 20 мас.% нагрузка металлом платиновой группы становится неэкономичной при малом увеличении эффекта - уменьшении времени срабатывания, повышении чувствительности и т.д.

В действительности же при очень больших нагрузках металлом чувствительность начинает падать. В предпочтительной технологии угольный порошок платинируют или палладируют окислительным осаждением соединения платины или палладия, таким как платинохлористоводородная кислота, или, что еще желательней, комплексом платины или палладия с окисляемым лигандом в присутствии угольного порошка, с целью осаждения платины или палладия коллоидных размеров непосредственно на поверхность угольных частиц.

После платинирования или палладиро- вания платинированный или палладирован-- ный угольный порошок формуют с применением соответствующей водоотталкивающей связующей смолы, желательно фторуглеродной смолы, такой как политетрафторэтилен, для получения либо полностью самонесущей пористой формованной структуры, содержащей в основном указанные связанные смолой платинированные или палладированные частицы угольного порошка, либо, в более распространенном варианте, пористый формованный поверхностный слой таких связанных смолой частиц, закрепленный на электропроводной подложке, например, металлической, угольной или графитовой. Особенно рекомендуемым материалом подложки для формированного связанного смолой платинированного угольного слоя является угольная бумага или угольная ткань с открытыми порами. Чтобы сохранить максимальную пористость, количество смолы, используемой в качестве свя- зуйэщего агента, должно быть минимально необходимым для обеспечения механической целостности и стабильности слоя элек- трбда, который обычно имеет толщину не более примерно 0,1-0,5 мм, хотя возможно и больше. С точки зрения требований структурной целостности, механической прочности и пористости количества связующей смолы некритичны и могут лежать в пределах начиная с таких малых количеств, как 5 или 10 мае.% от количества платинируемого или палладируемого порошка угля, и до- сти,гая 80 мас.%, но обычно ее количество лежит в пределах от 30 до 70 мас.%. Могут использоваться различные смолы, включая смолы, являющиеся электропроводными или полупроводниковыми, но рекомендуется применять синтетические фторуглерод- ные смолы, особенно политетрафторэтилен. Ввиду небольшой, но важной потребности в кислороде для окислительного процесса необходимо, чтобы связующее было проницаемым для кислорода. Для этого связующее должно обладать минимальной растворимостью по отношению к кислороду при атмосферном давлении в количестве не менее 2 х см3 02 (измеренного при стандартных температуре и давлении) на 1 см полимера.

Рекомендуемые подложки ферментных электродов, используемые в соответствии с настоящим изобретением, фактически представляют собой имеющиеся на рынке материалы, продаваемые под торговой маркой Prototech компанией Прототек, Нью- тон-Хайлендс, шт. Массачусетс, и до настоящего времени используемые в качестве электодов электрокаталитической газовой диффузии в топливных баках. В общих чертах, коллоидная платина с размером частиц в диапазоне от 15 до 25 А (1,5-2,5 нм)

абсорбируется на поверхности угольндго порошка (размеры частиц от 50 до 300 А - 5-30 нм) путем образования коллоидного раствора платины in situ в присутствии угольного порошка, который играет роль за0 родышеобразующего агента для коллоидного раствора. Платинированные частицы угля затем формуют в электропроводную поддерживающую структуру, например лист угольной бумаги, при помощи синтетиче5 ской связующей смолы, желательно фторированного углеводородного полимера, и особенно политетрафторэтилена (ПФТЭ),

В другом варианте платинированные частицы угля впитываются в предваритель0 но изготовленную пористую угольную ткань и связываются в ней при помощи фторуглеродной смолы, желательно политетрафторэтилена. Следует, однако, иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничивается

5 применением материалов Прототек, но охватывает и другие аналогичные материалы подложки, содержащие связанный смолой и сформованный платинированный или пал- ладированный угольный порошок.

0 Иммобилизация фермейта на поверхности, связанной смолой, платинированной или палладированной угольной подложки, может быть осуществлена множеством хорошо отработанных приемов, например, ко5 валентным связыванием с карбодиимидом или карбонилдимидазолом в качестве реагента, ковалентным связыванием с 1,6-ди- нитро-3,4-дифторбензолом (ДНДФБ) или образованием перекрестных связей с глю0 таралдегидом.

Типичными примерами протоколов иммобилизации фермента, глюкозооксидазы, могут служить следующие.

А. Обработка карбодиимидом

слабое перемешивание при помощи механического вибратора. Если электроды плавают по поверхности раствора, значит они недостаточно смочены и следует повторить обработку, начиная с операции 2.

С. Обработка динитродифторбензолом

Для процесса иммобилизации могут использоваться и аппараты других типов, включая бифункциональные агенты с переменной длиной цепи, например, диимида- ты, такие как диметилмалонимидат или диметилсуберимидат.

В другом варианте было установлено, что простая адсорбция фермента на подложке из платинированного или палладиро- ванного угольного порошка с полимерным связующим, т.е. без поперечных связей, эффективна для некоторых ферментов и в особенности для глюкозооксидазы.

Обычно, хотя и необязательно, поверхностный слой обездвиженного фермента будет физически защищен нанесением соответствующей пористой, например поликарбонатной, пленки или мембраны, которая естественно, должна быть проницаемой для ферментного субстрата (клюкозы), который должен быть определен. Некоторый недостаток таких мембран состоит в том, что

0 они увеличивают время реакции датчика, но даже такая мембрана не дает датчикам времени реакции, которые сравнимы, а во многих случаях и значительно меньше времени реакции обычных ферментных электродов.

5 Настоящее изобретение относится в особенности к электродам из глюкозооксидазы, т.е. к таким электродам, в которых иммобилизованным ферментом является глюкозооксидаза, но очевидно, что могут ис0 пользоваться и другие оксидоредуктазы, хотя и не всегда с эквивалентным эффектом. Это необязательно объясняется собственной неэффективностью фермента, а возможно влияние и других факторов.

5 Например, при определении щавелевой кислоты при помощи оксалатоксидазы сама щавелевая кислота претерпевает электромеханическое окисление на электроде основания, тем самым в значительной степени

0 маскируя любое воздействие со стороны фермента. Однако к Другим подходящим ок- сидоредуктазам относятся лактатоксидаза, галактозооксидаза, холестеролоксидаза и другие перекисьобразующие ферменты, а

5 также комбинации иммобилизованных ферментов, включая комбинации неоксидазы и оксидазы, первая из которых воздействует на окисляемый продукте созданием поддающегося измерению тока, пропорциональ0 ного концентрации образца.

Одна такая комбинация представляет собой комбинацию бетагалактозидазы и глюкозооксидазы (для количественного определения лактозы) или комбинацию бета5 глюканового деполимеризующего фермента, бета-глюкозидазу и глюкозооксидазу (для определения бетаглюканов).

К другим типам использования датчиков относится использование ферментных или

0 неферментных реагентов или процессов, взаимодействующих с первичным субстратом, который нас интересует, в предшествующей реакции, с получающийся продукт включает вещество, которое играет роль

5 субстрата для ферментного электрода в соответствии с настоящим изобретением. В области иммунохимических реакций имеется множество примеров таких предшествующих операций и специалисты в данной области знают способы использования та«их реакций при построении датчиков, включая иммунодатчики, в которых используются ферментные электроды в соответствии с настоящим изобретением.

Однако главное использование электродов в соответствии с настоящим изобретением - это биодатчики для определения и (или) количественного измерения окисляемого субстрата, особенно глюкозы, в пробе, особенно в клинической пробе, например, крови, сыворотки, плазмы, мочи, пота, слез и слюны.

К другим возможным неклиническим применениям относятся:

a) контроль ферментации, .

b) управление производственными процессами,

c) контроль окружающей среды, например, слежение за стоками и загрязнениями жидкостями и газами,

d) контроль пищевых продуктов,

e) ветеринараные применения, особенно применения, аналогичные приведенным выше клиническим применениям.

Биодатчики и другие датчики, имеющие ферментный электродный материал в соответствии с настоящим изобретением, могут включать и другие конструктивные элементы, электрические провода, неэлектропроводные (изоляционные) основы или зонды и т.п., такие элементы в конструкции являются распространенными и не нуждаются в подробном описании. Достаточно лишь отметить, что в тех случаях, что обычно и бывает, когда материал электрода представляет собой тонкий бумажный лист или пластину, биодатчик обычно включает изоляционный поддерживающий элемент или зонд, на котором установлен материал электрода, при помощи которого материал электрода может быть введен в пробу. В таких случаях фактические размеры куска материала электрода могут быть очень небольшими - не более нескольких квадратных миллиметров и даже меньше. Электрический контакт с материалом электрода может быть с оздан по-разному, например путем установки материала электрода с поверхностным контактом с электропроводным контактом или клеммой, например из платинового, серебряного или другого подходящего проводника. Когда материал электрода имеет толщину и прочность, достаточные для того, чтобы он был полностью самонесущим, можно обойтись без изолирующих опор или носителей для материала электрода, и электрические провода соединяются непосредственно к поверхности материала электрода.

Кроме угольной бумаги могут использоваться и другие поддерживающие элементы, такие как электрически полупроводящая поверхность, например, поверхность из полевого транзистора, или .электрически непроводящая поверхность. В последнем

случае электрический контакт может быть создан непосредственно с металлом платиновой группы угольного или графитового слоя с полимерным связующим.

Приготовление материалов фермент0 ных электродов в соответствии с настоящим изобретением и их свойства иллюстрируются в следующих примерах.

Пример 1 (для сравнения). Ферментный электрод изготавливают в соответст5 вии с известным уровнем техники путем электрического осаждения тонкого слоя (менее 1 мкм) платины на поверхности электропроводного основания, представляющего собой пористую угольную бумагу с полимер0 ным связующим, содержащую электопро- водные угольные черные гранулы (Vulcan ХС-72), имеющие номинальные размеры частиц, равные 50 нм и вплавленные на лист выпускаемой на рынок графитизированной

5 угольной бумаги с использованием в качестве связующего 10 мас.% политетрафторэтилена.

На поверхности различных проб платинированной угольной бумаги иммобилизу0 ют глюкозооксидазу из Aspergillus niger путем обработки карбодиимидом, описанной выше, и путем создания поперечных связей с глютаральдегидом обработкой платинированной поверхности электрода водным

5 раствором глюкозооксидазы, высушиванием и последующим созданием поперечных связей осажденного фермента посредством выдерживания глютаральдегида при 25°С. Для последующих испытаний материал

0 электрода нарезают на диски диаметром 2 мм.

Пример 2. Глюкозный электрод. Глюкозооксидазу из Aspergillus niger иммобилизуют на платинированной уголь5 ной бумаге, подаваемой под торговым знаком Prototech компанией Прототек, шт. Массачусетс, США. и содержащей частицы платинированного угольного порошка (Vulcan ХС-72, размер частиц платины от 1,5

0 до 2.5 нм, размер частиц угля 30 нм, нагрузка платиной готового продукта составляет 0,24 мг см при помощи вышеописанных обработок, а именно:обработкой карбодиимидом, обработкой карбонилдиимидазолом

5 и обработкой динитродифторбензолом.

В отдельных экспериментах глюкозооксидазу иммобилизуют на материале Прототек созданием поперечных связей с глютарельдегидом и простой абсорбцией, т.е. без создания поперечных связей, с выдерживанием материала Прототек в свежеприготовленном растворе глюкозооксидазе (5 мг ) в ацетатном буфере с рН 5,6 в течение 90 мин при комнатной температуре, В другом варианте удобно осуществлять адсорбцию фермента при помощи процесса электрофореза, для чего материал основы электрода выдерживают при положительном потенциале в растворе фермента в течение 60 мин.

Пример 3. Используя вышеописанную обработку карбодиимидом, иммобилизуют следующие ферменты на платинированной угольной бумаге из Прототека, а именно на угольной бумаге с политетрафторэтиленом в качестве связующего, полученной из предварительно платинированного угольного порошка:

лактатоксидаза

галактиозоксидаза

глюкозооксидаза/бета-галактоксидаза.

Чтобы дополнительно проиллюстрировать преимущества настоящего изобретения и свойства материалов ферментных электродов в соответствии с настоящим изобретением по сравнению с известными электродами, материалы ферментных электродов, приготовленные как в вышеприведенных примерах, испытывают на амперометрическую реакцию в ячейке, содержащей модифицированную систему кислородных электродов Р анк (фирма Рэнк бразерс, Боттишем, Кембридж), изображенную на прилагаемых чертежах. В этой системе мембрану заменяют ферментным электродом на угольной бумаге (диаметром 5 мм) в соответствии с настоящим изобретением, который удерживается на платиновом капельном электроде. Противоположный электрод (платиновая фольга) помещают че- рез крышку ячейки. Эталон - электрод серебро-хлористое серебро. В некоторых испытаниях (с защитной мембраной и неперемешиваемыми растворами) используют двухэлектродную конфигурацию, противоположный электрод сравнения представляет собой окружающее кольцо из хлорида серебра. Обычно испытуемые растворы в буфере с рН 7 перемешивают магнитным полем, а рабочий электрод держат при потенциале 600 мВ относительно опорного потенциала при помощи потенциометра. При использовании двухэлектродной конфигурации используют потенциал 325 мВ. После истечения времени, достаточного для того, чтобы фоновый ток упал до низкого уровня, шприцем вводят раствор субстрата. Токовый ответ регистрируют самописцем.

На фиг. 1 изображен ответ электрода из глюкозооксидазы в соответствии с настоящим изобретением в сравнении с глюкозо- оксидазой, обездвиженной на угольных электродах других типов; на фиг. 2 - первая кривая стабильности электрода из глюкозооксидазы; на фиг. 3 - вторая кривая ответа электрода из глюкозооксидазы при разных концентрациях глюкозы; на фиг. 4 - кривая ответа электрода из глюкозооксидазы в условиях изменяющегося давления кислорода

0 среды; на фиг. 5 - график влияния на характеристики электрода из глюкозооксидазы времени его хранения при комнатной температуре; на фиг. 6 - сравнительный график влияния на характеристики электрода извест5 ного уровня техники его хранения при комнатной температуре; на фиг. 7 - сравнение между ответом электрода из глюкозооксидазы, иммобилизованной глютаральдегидом в соответствии с настоящим изобретением, и

0 ответом электрода из глюкозооксидазы, иммобилизованной глютаральдегидом в соответствии с известным уровнем техники; на фиг. 8 - то же. но для иммобилизации используют карбодиимид; на фиг. 9 - сравнение меж5 ду ответом электрода из лактатоксидазы, иммобилизованной карбодиимидом в соответствии с настоящим изобретением, и ответом электрода из лактатоксидазы, иммобилизованной карбодиимидом в соот0 ветствии с известным уровнем техники, на фиг. 10 и 11 - соответственно кривые ответа электродов из галактозоксидазы и лактатоксидазы в соответствии с настоящим изобре- тением; на фиг. 12 - кривая ответа

5 комбинированного электрода из глюкозооксидазы и бета-галактозидазы в соответствии с настоящим изобретением; на фиг. 13 - кривая ответа электрода из глюкозооксидазы в соответствии с настоящим изобретением, в

0 котором используется в качестве связующего для платинированного угольного порошка поливинилацетат вместо политетрафторэтилена; на фиг, 14 - кривая ответа электрода из глюкозооксидазы в соответствии с насто5 ящим изобретением, в котором глюкозоокси- даза обездвижена на электроде из угольной бумаги, содержащем поверхностный слой палладированного угольного порошка, связующим (политетрафторэтиленом); на фиг. 15 0 модифицированная электрохимическая ячейка фирмы Рэнк, используемая для определения рабочих характеристик электродов в соответствии с настоящим изобретением; на фиг. 16 - двухэлектродная конфигурация, ис5 пользуемая для некоторых измерений; на фиг. 17 - чувствительность двух электродов к повышению концентрации глюкозы; на фиг. 18 и 19 - выход тока для каждого электрода. Обратимся прежде всего к фиг. 15. Многие представленные здесь данные получают

при использовании электрохимической ячейки, изображенной на фиг. 15. Она представляет собой ячейку из двух отделений, имеющую основание 1 и кольцевой кожух 2, образующий водную камеру 3, по которой может циркулировать вода для задания температуры ячейки. Эти два отделения соеди- няются захватывающим резьбовым кольцом 4. В основании 1 центрально расположен платиновый контакт 5, на котором расположен испытываемый диск 6 из бумажного материала электрода, содержащего иммобилизованный фермент, и который удерживается на платиновом контакте при помощи резиновых кольцевых уплотнителей 7 и 8, тогда два отделения ячейки соединены друг с другом.

Вверх ячейки, которая, естественно, содержит раствор ферментного субстрата, вставлен стопор 9, поддерживаемый регулируемой втулкой 10, в которой установлен платиновый контрэлектрод 11 и электрод сравнения 12 из серебра и хлорида серебра. Испытания с рабочим электродом проводят под потенциалом 600 мВ, при которых выходной ток измеряют с электрода, имеющего кажущуюся площадь поверхности 0,14 см , открытую для раствора субстрата. Результаты выражены на рисунке в виде плотности тока, т.е. выходного тока, протекающего через единичную площадь электрода (а), открытую для подложки.

Как показано на фиг. 16, платиновый контакт 13 окружен контр-электродом сравнения 14, отделенным от него изоляционной втулкой 15. Пористая поликарбонатная мембрана, установленная на кольце, используется для удержания испытуемого диска 16 бумажного электродного материала, содержащего иммобилизованный фермент на платиновом контакте. Открытая камера 17 для проб позволяет помещать пробы каплями на мембрану. Электродная ячейка поляризуется потенциалом 325 мВ, а ток контролируется при помощи потенциометра 18. Использование двухэлектродной конфигурации с потенциалом 325 мВ имеет преимущества перед обычной трехэлект- родной ячейкой с потенциалом 600 мВ - ею удобно пользоваться и она имеет более низкий фоновый ток. Однако выбор той или иной системы не влияет существенно на рабочие характеристики - стабильность при хранении, стабильность при эксплуатации, линейность характеристики или зависимости от кислорода электродов в соответствии с настоящим изобретением.

Ниже подробно рассматривается полученные результаты.

Линейность и зависимость ответов от времени.

На фиг. 1 представлены типичные примеры ответа электрода на последователь- ные добавления глюкозы, дающие конечные концентрации в диапазоне от 0 до 35 мМ, с использованием трехэлектродной ячейки в условиях перемешивания. Все три электрода А, В и С имеют глюкозооксидазу, иммоби0 лизованную на них вышеописанным способом А. Электрод А содержит активированную платинированную угольную подложку в соответствии с настоящим изобретением, а именно - прессованный

5 лист платинированного угольного порошка, связанного полимером (политетрафторэтиленом), подаваемый под торговым знаком Prototech; электрод В содержит электропроводную подложку, вырезанную из части гра0 фитового стержня; электрод С содержит электропроводную подложку, вырезанную из выпускаемой промышленностью неплатинированной угольной бумаги. Как показано, электроды В и С дают слабые и

5 сравнительно вялые ответы, напоминающие результаты, даваемые датчиками с по средниками, широко описанными в литературе. Электрод А дает более надежные и устойчивые ответы со временем отве0 та около 1 с. (Шип в сигнале, наблюдаемый в верхней части первоначального ответа, частично представляет собой несущественный артефакт в результате способа инжекции. зависящие от глюкозы плато яв5 ляется интересующим сигналом). Все три электрода дают практически линейную характеристику относительно концентрации глюкозы (фиг. 2 результаты показанные только для А и С). Он охватывает диапазон,

0 необходимый для прямого анализа глюкозы в крови (от 0 до 30 мМ). Аналогичные результаты, получаемые с электродами типа А с использованием процедуры иммобилизации В, описанной выше, указывают, что этот

5 метод дает даже еще большую линейность на большем диапазоне.

Как показано на фиг, 2, ответ электрода А остается практически неизменным спустя 23 дня, но ответ других электродов со вре0 менем ухудшается (как показано для электрода С). Этот тип поведения наблюдается также для других методов иммобилизации, описанных выше, которые все могут использоваться для изготовления чувствительных

5 и стабильных электродов с углеродным материалом, используемым для А, но дают плохие электроды с многочисленными другими неактивными углеродными материалами. Время ответа электрода А также остается неизменным спустя 23 дня. в то время как

другие электроды показывают увеличение времени ответа при начальных временах от- ветм примерно от 23 до 30 с, которые увеличиваются спустя 8 дней до 2-3 мин. Активные электроды (такие, как электроды А) обычно дают некоторое уменьшение ответа в течение первого дня, но затем ответ достигает плато относительно времени. Электроды типа А, которые хранят во влажном состоянии (рН 5,6) при 4°С и проверяют с интервалами в течение 6 месяцев, показывают малые изменения (после первых нескольких суток) и хотя после этого периода наблюдается некоторое ухудшение, ответ спустя 12 месяцев все еще составляет 70% первоначальной величины.

На фиг. 1 и 2 представлен выходной ток электрода в МкА при рабочем напряжении 600 мВ при использовании трехэлект- родной конфигурации, изображенной на фиг. 15.

Увеличенный срок службы и стабильность электродов в соответствии с настоящим изобретением дополнительно иллюстрируется на фиг.5, на которой пока- зан ответ электрода из глюкозооксидазы, иммобилизованной карбодиимидом, на глюкозу концентрацией 5 мМ после содержания в ацетатном буфере с рН 5,6 при комнатной температуре в течение 180 суток. Сравнительные результаты для электрода известного уровня техники (пример 1) показаны на фиг. 6. Измерения, приведенные на фиг. 5, производят при 600 мВ при помощи трехэлектродной системы, а приведенные на фиг, 6-при325 мВ при помощи двухэлек- тродной конфигурации.

Другие сравнения между кривыми ответом для электродов известного уровня техники (пример 1) и электродами в соответствии с настоящим изобретением с использованием различных ферментов и различных методов иммобилизации представлены на фиг. с 7 по 9 - все измерения выполняют при 325 мВ.

Кривые ответа для лактата, галактозы и лактозы (комбинация глюкозооксидазы и бета-галактозидазы) приведены на фиг. 10- 12. Эти изменения выполняют при 600 мВ.

Повторное использование электрода: возможность многократных измерений.

При постоянной нагрузке электроды в соответствии с настоящим изобретением показывают большой срок службы, что иллюстрируется следующей последовательно- стью испытаний,

Сначала в закрытую ячейку устанавливают электрод из глюкозооксидазы (пример 2) и дают ему возможность реагировать ам- перометрически на перемешиваемый раствор глюкозы (первоначальныйток 100 мкА).

Он работает непрерывно в течение 18 часов, в течение которых сигнал постепенно снизился ниже 10 мкА. Общее количество электричества, которое было получено, соответствовало примерно 75 процентам теоретически ожидаемого (на основании того, что одна молекула глюкозы дает 2 электрона). Этот эксперимент сразу же повторяют с тем же электродом с обновленным раствором глюкозы, после чего первоначальный ток восстанавливается.

В последующем эксперименте выдача тока при использовании того же электрода продолжается еще в течение 5-7 суток, но подача глюкозы осуществляется циркуляцией из большого резервуара для поддержания концентрации 5 мМ, Выходной сигнал медленно падает в течение 100 ч, но затем стабилизируется на 45 мкМ и эта величина сохраняется еще 40 ч. Возможно, что некоторое количество слабо связанного фермента десорбируется с электрода в течение этого времени либо оказывает влияние какой-либо другой фактор.

После описанных длительных испытаний ответ электрода в диапазоне концентраций глюкозы испытывают так, как указывалось выше. Хотя амплитуда сигнала меньше, чем при свежеприготовленном растворе, электрод дает очень хорошую ступенчатую функцию в дйпазоне концентраций глюкозы от 0 до 30 мМ, что подтверждает, что на него не повлиял какой-либо отрицательный эффект в результате длительного использования под нагрузкой. Этот вывод был сделан при трех последующих испыта- ниях спустя 1 неделю после хранения (4°С), спустя 8 недель хранения и после нового прогона под нагрузкой, как и прежде в течение еще 4-7 суток, ответы в диапазоне концентраций глюкозы остаются неизменными.

Эти испытания указывают на то, что электрод может работать в течение общего времени не менее 250 ч (более 15000 мин), что потенциально дает материалу электрода исключительно большой срок службы.

Удобство для непрерывного контроля.

На уровень конечного.ответа, регистрируемый при вышеуказанных испытаниях возможности многократного использования (45 мкА в глюкозе концентрацией 5 мМ), не оказывает влияние воздействие аэрированными растворами, и он остается неизменным после нескольких недель последующего хранения. Стабильность выходного тока электрода в течение 12 ч проверяют в испытании при использовании стерилизованного раствора глюкозы в условиях, направленных на то, чтобы исключить потери глюкозы в результате бактериального загрязнения. Сигнал остается постоянным в течение всего времени, что указывает, что прекратились влияния первоначального кондиционирования электрода в перемешиваемом и циркулирующем растворе в течение нескольких дней. Такие электроды, соответствующим образом кондиционированные, найдут применение там, где требуется непрерывный контроль глюкозы.

Воспроизводимость партий.

При условии, что поддерживаются необ-- ходимые чистые условия приготовления, все электроды, изготовленные в соответствии с настоящим изобретением, работают так, как описано, давая хорошие ответы на глюкозу. Пары электродов одинакового размера, приготовленные одной и той же процедурой, дают близко согласующиеся результаты (токовые ответы в пределах нескольких процентов при испытании в идентичных условиях).

Кроме того, все приготовленные таким образом электроды имели большие сроки службы и долговечность, как говорилось выше, в отличие от глюкозных электродов в соответствии с известным уровнем техники. Таким образом, электроды в соответствии с настоящим изобретением можно надежно хранить и использовать в течение многих недель, в то время как электроды известного уровня техники часто имеют разброс внутри партии.

Зависимость ответа от концентрации кислорода.

Для проверки влияния растворенного кислорода испытуемую ячейку видоизменяют- включают в нее кислородный электрод дополнительно к глюкозному электроду. Растворенный кислород выдувают из системы. В этих условиях электрод типа А дает быстрый ответ на введение глюкозы, указывая на существование механизма, в значительной степени независимо от концентрации кислорода в окружающей среде. Такой результат, который приписывается особым характеристикам структуры поверхности электрода в сочетании с хорошей иммобилизацией фермента, не наблюдался ранее.

В другом эксперименте {фиг. 4) выходной сигнал электрода типа А (приготовленного вышеописанным методом А) с потенциалом 600 мВ контролируют во время непрерывного продувания аргоном.

Одновременно осуществляют измерения давления кислородом в пробе. Результаты, представленные на фиг. 4, показывают практически постоянный токовый сигнал (верхний график), который практически не зависит от давления кислорода в пробе (нижний график). В другом испытании сигнал практически не испытывает влияния в течение 10 мин, в то время как давление кислорода быстро падает. На другом электроде (приготовленном методом В)отмечается уменьшение тока ниже 5% в течение времени более 3 мин, в течение которого содержание кислорода снижается до 90%. Увеличение токового ответа наблюдается также и тогда, когда кислород вновь вводят

0 в систему, хотя такое увеличение происходит сравнительно медленно. При длительной продувке аргоном электроды реагируют только на узкий диапазон концентраций глюкозы, возможно, что для срабатывания

5 той части функции фермента, которая отвечает за окисление субстрата, требуется присутствие следов кислорода. Кроме того, нельзя исключить возможность того, что кислород, адсорбированный на электроде

0 (при малой концентрации не выявляемый кислородным электродом), играет какую-то роль в этом поведении. Загрузка ферментом. Независимые измерения скорости сни5 жения количества глюкозы и максимальных плотностей тока показывают, что количество фермента, активно иммобилизованного на электроде (типа А), эквивалентно примерно 7 мг активного фермента на квадратный

0 сантиметр поверхности электрода. При процедурах иммобилизации установлено, что даже в тех случаях, когда раствор фермента разбавляют в 10 раз, все же можно было приготовить очень активные электроды.

5Зависимость ответа от температуры. - Электроды типа А испытаны в диапазоне концентраций от 0 до 30 мМ глюкозы при температуре от 10 до 37°С. Температурный коэффициент составляет от 2 до 3% на градус

0 (что соответствует энергии активации Аррени- уса, равной приблизительно 24 кДж . Зависимость от рН.

Наблюдается небольшая зависимость ответа от рН. Однако в пределах рН от 7 до

5 8 ответ практически не зависит от рН за исключением случаев очень больших уровней глюкозы (более 25 мМ).

Ответ электрода, покрытого защитной мембраной.

0Установлено, что поликарбонатная мембрана вносит мало изменений в форму и величину ответа электрода перемешиваемой системы. Время ответа в неперемешиваемой системе составляет около 20 с.

5Использование электрода для анализа проб цельной крови.

Электрод с поликарбонатной мембраной успешно используется для прямых измерений глюкозы в крови, Помехи со стороны аскорбата при 0.2 ммоль/л составляют около 2,5% всего сигнала при уровне глюкозы 5 ммоль/л.

Применение электрода в различных конфигурациях аналитического биодатчика.

Успешное применение ферментного электрода в соответствии с настоящим изобретением в ячейке типа Рэнк в которой используется электрод Кларка, описанный выше, демонстрируется результатами, рассматриваемыми выше. Продемонстрирова- но, что электрод дает очень хорошие результаты при использовании его в других режимах датчика, например, в качестве зонда.

Например, изготовлен зонд диаметром 2 мм широко распространноготипа, используемого во многих обычных электродах. В этом зонде электрод установлен на проволоке и запечатан в стеклянной трубке. Его можно поместить (с прикрепленными элек- тродом сравнения и контрэлектродом) в пе- ремешиваемые пробные растворы, содержащиеся в химическом стакане или каком-либо другом сосуде, чтобы произвести надежные измерения концентрации глюкозы без необходимости удаления атмосферного кислорода. Из измерений при помощи этого зонда и зондом меньших размеров аналогичной конструкции установлено, что токовый ответ электродов в растворе с фиксированной концентрацией глюкозы приблизительно пропорционален кажущейся площади или весу электрода.

Изготовлены также зонды, в которых электрод сделан миниатюрным (площадью приблизительно от 0,25 до 0,50 мм , весом от 30 до 60 мкг). Проволочная основа покрыта пластмассовой оболочкой, и зонд с оболочкой поместили в катетерную иглу (диаметром 1,5 мм). Игла может быть встав- лена через резиновое уплотнение в сосуд (который может входить, например, в состав ферментера или аналогичного устройства или в резервуар для отходов) и использована в качестве зонда-датчика для измерения концентрации глюкозы раствора, содержащегося в сосуде. В этой конфигурации чувствительный электрод защищен окружающей иглой в момент ввода, но может также быть вытолкнут наружу из иглы, если необходимо, по- еле стадии ввода.

Хотя вышеописанные миниатюрные зонды дают сигналы, которые как правило лежат в пределах от 1 до 10 мкА, соответствующие приборы позволяют производить измерения в диапазоне от 1 до 100 нА. Поскольку токи сигнала в этом диапазоне поддерживаются ферментными электродами (в соответствии с настоящим изобретением) очень малого размера (площадь приблизительно 0,005 мм и весом 1 мкг), такие электроды могут быть расположены в тонких игольчатых микрозондах, подобных таким, которые могут найти применение в катетер- ных зондах для измерений in vivo.

Чтобы продемонстрировать применимость других полимеров в качестве связующих в ферментных электродах в соответствии с настоящим изобретением и других металлов платиновой группы, созданы электроды из глюкозооксидазы с использованием пол- ивинилацетата в качестве связующего и палладия в качестве металла платиновой группы,

В первом случае изготовлен электрод из глюкозооксидазы путем иммобилизации глюкозооксидазы методом А, описанным ранее, на поверхности электрода из платинированной угольной бумаги, имеющего практически конструкцию, описанную ранее (пример 2), но с использованием 50 весовых процентов поливинилацетата в качестве связующего вместо политетрафторэтилена.

При испытаниях с использованием той же системы электродов Рэнк при 325 мВ получен практически линейный ответ, как показано на фиг. 13.

Во втором случае изготовлен электрод из глюкозооксидазы путем иммобилизации глюкозоохсидазы методом А, описанным выше, на поверхности электрода на палла- дированной угольной бумаге, изготовленного путем осаждения коллоидального палладия на поверхности угольного порошка (номинальный размер частиц 30 нм: Vulcan XC-72.) с последующим связыванием палладированного угольного порошка в виде тонкого слоя (0,1 мм) на поверхности электропроводной угольной бумаги с использованием в качестве связующего 50 весовых процентов от веса палладированного угольного порошка политетрафторэтилена.

Диск диаметром 2 мм, вырезанный из обработанной палладированной угольной бумаги, укреплен на платиновом контакте двухэлектродной ячейки, описанной на фиг, 16 и испытан на ответ на глюкозу при 325 мВ. Результаты представлены на фиг. 14, они снова показывают практически линейный ответ - характеристику зависимости плотности тока от концентрации глюкозы.

Ввиду очевидной эквивалентности платины, палладия, рутения и родия и других металлов платиновой группы в электродах газовой диффузии, следует ожидать, что и другие металлы платиновой группы, например, рутений и родий, эффективны в качестве альтернатив платине и палладию в

ферментных электродах в соответствии с настоящим изобретением.

Пример 4 (сравнительный). Электрод согласно изобретению получают практически в соответствии с описанием в примере 2 за исключением того, что глюко- зооксидазу наносят (иммобилизуют) на матрице простой абсорбцией из 5%-го водного раствора глюкозооксидазы без последующей сшивки. В качестве субстрата исполь- зуют коммерчески доступную смолу йа платинизированной углеродистой бумаге (Prototech), содержащей частицы тонко измельченного преплатинированного порошка углерода (номинальный размер 30 нм, Vulcan XC-72, 10 вес.% адсорбированной коллоидной Pt, связанного 50% по весу политетрафторэтиленом, с полным содержанием Pt 5 вес.% на поверхности подложки электропроводящей углеродистой бумаги Тогау). Квадратный сантиметр материала Prototech погружают в этанол на ч (это необходимо для обеспечения смачивания и пропитки раствором глюкозооксидазы), трижды промывают фосфатным буфером, сушат промокая, и погружают в раствор водного фосфатного буфера, содержащий 5 вес.% глюкозооксидазы, на 90 мин. Затем пропитанный материал электрода промывают свежим раствором фосфатного буфера.

Электрод Матсушита получают согласно известному способу.

Графитовый порошок (ВДН) и порошок оксида рутения (Aldrich) вначале смешивают вручную в соотношении 95% графита, 5% Ru 02 с последующим трехчасовым перемешиванием ролика во вращающейся трубке. 200 мг смешанного порошка помещают затем в 13 мм (диаметр) пресс-форму в КВг пресс, откачивают в течение 3 мин и прессу- ют в течение 3 мин под давлением 11т.

Затем спрессованный диск пропитывают раствором глюкозооксидазы описанным ранее способом, опуская начальная обработку электрода этанолом, в которой нет необходимости при использовании гидрофобного связующего.

Тестовая процедура.

Характеристики обоих твердофазных глюкозооксидазных электродов сравнива- ют на двухэлектродной ячейке, изображенной на фиг. 16, используя пористую (0,05 мкм) поликарбонатную (Nuclepore) мембрану для содержания диска ферментного электрода в контакте с рабочим электродом. Измерение проводят, используя потенциометр Thomson Ministat при 340 мВольт, против сравнительного счетчика электрода хлористого серебра. В обоих случаях тест проводят, используя диски диаметром 1,5

мм, вырезанные из материала электрода, пропитанного глюкозооксидазой, полученного описанным выше способом.

Результаты.

Чувствительности двух электродов к повышению концентрации глюкозы представлены на фиг. 17. Для обоих электродов отношение сигнал/шум составляет 3 нА, обеспечивая при 25 мкМ глюкозы отношение сигнал/шум 5:1 для электрода согласно изобретению по сравнению с отношением 3:1 для известного электрода. На фиг. 17 показаны также существенно более высокие уровни ответа при концентрациях глюкозы вплоть до 50 мкМ и линейность вплоть до50мкМ.

Стабильность.

На фиг. 18 и 19 представлен выход тока для каждого электрода в течение 24 ч после пропитки глюкозооксидазой и спустя 10 и 79 дней (материал электродов хранили влажным в фосфатном буфере при комнатной температуре).

Оба электрода демонстрируют одинаковые отклонения при хранении.

Однако что более существенно, электрод Матсушита демонстрирует линейность ответа только при концентрациях глюкоок- сидазы в интервале 0-5 ммол/л. Электрод согласно изобретению демонстрирует практически линейный ответ в интервале 0-25 ммол/л. но с гораздо более высокими уровнями ответа, и линейностью, которые не ме- няются со временем, чем отличается электрод Матсушита.

Время ответа.

Электрод согласно изобретению демонстрирует почти мгновенный ответ на добавление глюкозы, причем пик появляется примерно через 30 с. Для сравнения электрод Матсушита демонстрирует лишь весьма вялый ответ, причем пик ответа появляется только спустя примерно 2,5 мин.

Формула изобретения

индивидуальных частиц углерода или графита перед формированием электропроводящей подложки, а для формирования электропроводящей подложки используют полимерное связующее.5

3, Электрод поп, 1, отличающийся тем, что в качестве полимерного связующеtVpeMvS, КН-(

Фиг. f

го используют фторуглеродистый полимер или поливинилацетат.

Стабильность глюнозно(о эАехтрода, хранящегося 6о влажном 6г/де лри комнатной /яемяера- тире - а/лбелг но 5мм глюмозы

BOO

о ID 40 60 во т ко MO /so fso гао

Срок хранения, дней Фиг.5

1 23456780 Ю Время, дни Фиг.6

I

ю fz 4 fe

/(внценщоация глмхозы, мм0л&/л Фиг.8

16 20 24 23 Л Jff 40 глмхоы/, ммям/л ФигЛ

30

J--i--i--

ю fz 4 fe м гя

озы, мм0л&/л

SOO

700

600

в

| 400

1М I

|ая7

100

5 Ю fS 20JO Концентрация глшозь/, ммоль/л Фи г. 14

40