Способ приготовления электродов для количественного электрохимического определения 1,4-дигидроникотинамида аденин динуклеотида (NA DH) в растворе Советский патент 1993 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к способу получения электрода для использования с целью количественного определения 1,4- дигидроникотинамида аденин динуклеоти- да (ЫАДН) в растворе.

1МАДН и его окисленная копия ЫАД являются кофакторами во многих катализируемых ,ферментами окислительно-восстановительных реакциях. В некоторых из них ферментативный субстрат окисляется в присутствии кофактора (МАД в подходящей ок- сидазе или дегидрогеназе до получения в растворе ЫАДН, в других-ферментативный

субстрат восстанавливается в присутствии кофактора МАДН и получают раствор (ЧАД. Во многих случаях определение концентрации ЫАДН можно использовать как индикатор концентрации субстрата или как средство для отслеживания ферментативной реакции, в которую вовлечен (МАДН (или NA.

Известно, что концентрацию ЫАДН в растворе можно определить колориметрически, но колориметрические способы в общем невыгодны. Значительно более выгодными являются электрохимические

00

о о

00 VI

А

способы, но до сих пор попытки определить МАДН электрохимическим способом не достигали успеха. Известно, например, что концентрацию МАДН можно определить амперометрическим способом, при котором МАДН окисляют на электроде при фиксированном контролируемом потенциале, причём ток, проходящий при подходящих условиях, прОпорциднален концентрации МАДН. К сожалению; электрохимическое окисление МАДН требует высокого сверхпотенциала и МАДН обычно не окисляется непосредственно на поверхности электрода, например, во многих случаях поверхность электрода быстро выходит из строя из-за образования на ней пленки, которая оказывает влияние на величину и скорость электрохимической реакции (1),

Предпринималось множество попыток преодолеть эту проблему. Например, было предложено использовать модифицированные электроды, покрытые слоем проводящих органических солей. Кроме того, предлагалось использовать адсорбированный редокс медиатор, такой как мельдола синий, для того, чтобы более эффективно привязать реакцию окисления к электроду и/или снизить окислительный потенциал (2). В других случаях редокс медиаторы ис: пользовали в свободном растворе. Например, метокси феназин метосульфат использовали с модифицированным пиро- литическим графитовым электродом. Другие эксперименты проводили с платиновым, графитовым и стеклянным угольным электродом, однако способ быстрого и воспроизводимого определения МАДН не был разработан.

Цель изобретения - повышение операционной стабильности электрода.

В соответствии с настоящим изобретением обнаружили, что МАДН и МАДРН могут быть окислены с хорошим амперометрическим ответом и при пониженном перенапряжении при использовании электрода из активированного угля такого типа, который используется в технологии топливного элемента и который включает гетерогенный связанный смолой слой благородного металла, содержащий предпочтительно палла- дирированные или платинизированные (этот термин включает материалы, содержащие оксиды платины и/или палладия или образованные ими, а также материалы, включающие металлические платину или палладий или обработанные ими) частицы графита или угля, связанные натуральной или синтетической смолой, предпочтительно синтетическим гидрофобным связующим, таким как фтороуглеродная смола,

наиболее предпочтителен политетрафторэтилен.

Следовательно, по своим отличительным свойствам в соответствии с настоящим

изобретением предлагается способ получения электрода для количественного электрохимического определения МАДН и МАДРН, включающий модификацию электрода из углеродного материала при помощи

0 адсорбции материалов, которые уменьшают перенапряжение электроокислительной реакции. Используют связанный смолой слой частиц древесного угля или графитных частиц размером от 5 до 30 нм в качестве угле5 родного материала, а частицы платины или палладия, или окислов платины или палладия коллоидного размера от 1.5 до 2,5 нм используют в качестве материалов, которые снижают перенапряжение электроокисли0 тельной реакции.

Связанный смолой слой платинизиро- ванных или пэлладиизированных частиц угля или графита может быть самостоятельным, но часто у него имеется подложка,

5 предпочтительно электропроводная и предпочтительно слой электропроводной угольной бумаги, с которой связаны платинизированные или пэлладизированные частицы угля или графита, как поверхност0 ный слой, или пропитанная угольная волокнистая ткань. Несмотря на то, что предпочтительны платинизированные или палладизированные материалы, можно использовать и электроды из активированного

5 угля, содержащие другие благородные металлы, например золотосодержащие.

Термины платинизированный и пал- ладизированный включают также и оксиды.

0 Термин активированный уголь, активированный графит и т.п. относятся к высокопористому, с большой площадью поверхности угольному или графитовому материалу с площадью поверхности 50 м /г или бо5 лее.,, чаще больше 200 м2/г, например 20Q-600 м2/г или больше. Материалы с тако й б ольшой площадью поверхности получали, например, путем тепловой обработки угольных или графитных порошков в потоке

0 СОа.

Кроме уже перечисленных преимуществ, а именно стабильности, воспроизводимости и короткого времени ответа, еще одним преимуществом настоящих материа5 лов является то, что их можно использовать для отслеживания концентраций МАДН при сравнительно низких потенциалах, например 0-600 мВ, или даже при отрицательных потенциалах со стандартными Ag/Ag CI электродами, против 750 мВ. упоминавшихся выше для отслеживания концентрации МАДН с использованием стеклянных, угольных или графитовых электродов. Электроды настоящего изобретения характеризуются относительно низким обратным током и поэтому повышенной чувствительностью. Эти электроды также характеризуются слабой реакцией на потенциально входящие частицы, такие как мочевая кислота, часто присутствующие в биологических или клинических пробах.

Предпочтительными подложками для электродов по изобретению являются материалы, которые используются как электро- каталитичёские газовые диффузионные электроды в топливных элементах. В общем случае коллоидную платину с размером частиц 15-25 А (1,5-2,5 нм) адсорбируют на поверхность порошкового угля (размер частиц 50-300 А, 5-30 нм), например, путем образования платинового раствора на месте в присутствии порошкового угля, который действует как инициатор образования центров кристаллизации в растворе. Платини- зированные частицы угля затем наплавляют на электропроводную подложку, например электропроводную угольную бумагу, используя синтетическую связующую смолу, предпочтительно углеводородную смолу, и в частности политетрафторэтилен. В другом случае может быть использован оксид платины или палладия с таким .же размером частиц вместо коллоидной платины, и его адсорбируют на частицы угля или графита таким же образом. По другому способу США платинизированные частицы угля внедряют в предварительно приготовленную пористую угольную ткань и связывают с ней фто- ристоуглеродной смолой, предпочтительно политетрафторэтиленом. Настоящее изобретение не ограничивается использованием материалов Prototech, возможно использование других аналогичных материалов для подложек, включающих пористый связанный смолой слой платинизирован- ных, палладиизированных или содержащих другой благородный металл частиц графита или активированного угля.

Несмотря на то что предпочтительными связующими смолами, используемыми для связывания платиниэированных или палладиизированных частиц графита или угля, являются гидрофобные фтористо-углеродные смолы, в частности политетрафторэтилен, можно использовать другие подходящие натуральные или синтетические смолы, например полиэтилметакрилат, поливинилацетат, поливинилхлорид, поликарбонаты, поли(4- метилпентен-1)полиизопрен. полихлоропрен, поли(1,3-бутадиен). кремнийорганиче- ский каучук или желатин.

Соотношение связующего и содержащих благородный металл частиц угля или 5 графита по весу составляет 10-75% связующего и 90-25% активированного угля или графита, предпочтительно 20-50% связующего и, соответственно, 80-50% активированного угля или графита. Наполнение

0 благородным металлом, например платиной или палладием, или их соответствующими оксидами, или золотом частиц активированного угля или графита составляет 1-10% веса активированного угля или графита и связу5 ющего, предпочтительно 2-8%, еще предпочтительнее 4-6 %.

Вместо наплавления смеси смолы с пла- тинизированным или палладиизированным порошком активированного угля непосред0 ственно на поверхность подходящей подложки, например непосредственно на поверхность электропроводной угольной бумаги, смесь связующего и платинизиро- ванного или палладиизированного уголь5 ного порошка может быть суспендирована в подходящей инертной среде и нанесена на поверхность подложки с помощью трафаретной печати, в результате чего получают тонкую пленку связанных смолой платини0 зированных или палладиизированных угольных частиц на поверхности подложки. Кроме прямого количественного определения содержания МАДН в растворе, электроды и способ по настоящему изобр.е5 тению можно использовать для количественного определения количества ДН, вырабатываемого или расходуемого на месте, например при ферментативной реакции между ферментом и его кофактором. Такие

0 реакции включают, например, превращение пирувата в лактат через лакт,ат дегидрогена- зу

лактат- дегидрогеназа

5пируват + МАДН --- - .. лактат + МАДН,

причем контролировать эту реакцию можно по уменьшению концентрации МАДН, и 0 окисление глюкозы до глюконолактона по реакции

глюкоза

а- Д-глюкоза + ЫАДН

дегидрогеназа

--«-Д-глюконолактон + МАДН, которую можно контролировать по увеличению концентрации К|АДН по мере прохождения реакции. В этом случае фермент, такой как лактат дегидрогеназа или глюкоза дегидрогеназа, может быть включен в слой

или иммобилизован на слое платинизиро- ванного или палладиизированного угольного электрода по настоящему изобретению с помощью любой известной методики включения фермента,

Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение содержит электрод и способ, в которых сам ферментный электрод включает не только иммобилизованный фермент,, но также подходящий кофактор этого фермента, либо ЫАДН, либо ЫАДН как в данном случае, таким образом, ферментный электрод обладает способностью электрически реагировать на активность фермента, что определяется по изменению концентрации ЫАДН при контакте с образцом, например клинической или биологической .пробой, содержащей соответствующий субстрат для фермента, независимо от того, содержит ли образец необходимый кофактор, так как его поставляет сам электрод. МАД или ЫАДН кофактор может быть включен в электрод любым подходящим способом, таким как пропитка подходящим раствором НАД или НАДН с последующей сушкой.

Как известно в технике, поверхность электродного материал а может быть или не быть защищена пористой мембраной, такой как поликарбонатная пленка с размером пор 0,03 мкм. Можно использовать и другие подходящие материалы для мембраны.

На фиг. 1 представлен разрез модифицированного электрохимического элемента Rank Brothers, который использован для определения ответа МАДН активированного угольного электрода в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг, 2 показан ответ электрода на последовательное добавление NAflH в элемент при использовании плзтинизировзн- ного угольного бумажного электрода (РСР) по настоящему изобретению; на фиг. 3 - ответ электрода РСР на NAflH при различных равновесных потенциалах на Ag/Ag CI электроде; на фиг. 4 - ответ электрода на пировиноградную кислоту в присутствии лактата дегидрогеназы (LDH); на фиг. 5 - ответ электрода на ацетальдегид в присутствии алкогольдегидрогеназы (АДН); на фиг.

6 - ответ платинизированных угольных бу. мажных электродов на концентрацию

ЫАДН по настоящему изобретению; на фиг.

7 - ответ электрода на пировиноградную кислоту; на фиг, 8 - ответ электрода на МАДН, полученную на месте путем ферментативного окисления глюкозы дегидрогена- зы; на фиг, 9 показана аналогичная кривая для электрода, содержащего оксид платины; на фиг. 10 - кривая для палладиизмрованного активированного угольного электрода.

В следующих примерах испытывали различные платинизированные или палладиизированные угольные бумажные (РСР) электроды на их ответ на МАДН в модифицированных системах Рэнк кислородных электродов, как показано на фиг. 1, Модифицированная Рэнк система содержит эле0 мент из двух частейгосновного электрода (1) и кольцевого кожуха (2), включающий водяную камеру (3), через которую может циркулировать вода для регулирования температуры элемента, причем обе эти час5 ти соединены с помощью навинчивания хомута (4). По центру основного электрода (1) расположена платиновая контактная кнопка (5), на которую помещен испытываемый диск (6) из бумажного электродного матери0 ала и который удерживается на платиновом контакте с помощью резиновых 0-образных уплотнителей (7) и (8) во время соединения двух частей элемента,

В верхней части элемента, который со5 держит испытываемый содержащий МАДН раствор, установлен упор (9), фиксируемый регулируемым хомутом (10). В упор вмонтирован обратный платиновый электрод (11) и Ag/Ag С эталонный электрод (12). Испыта0 ния проводят при потенциале рабочего электрода относительно эталонного Ag/Ag CI электрода в диапазоне 100-600 мВ. Другие испытания проводят в двухэлектродном элементе, В двухэлектродном элементе

5 электродный материал удерживается на платиновой контактной кнопке на основании элемента с помощью поликарбонатной (размер пор 0,03 мкм) мембраны, на которую подают образец, содержащий ЫАДН.

0 Кольцевой эталонный Ag/Ag CI электрод расположен вокруг платинового контакта в основании элемента и отделен от него изолирующей втулкой. На элемент подают разное напряжение относительно эталонного

5 электрода и записывают выходной ток при разных напряжениях.

Изобретение иллюстрируется примерами, в которых электродный материал представляет собой платинизированную

0 угольную бумагу (РСР), разработанную как газовые диффузионные электроды. РСР электродный материал получают по методике, по которой сначала платинизируют частицы угольного порошка (Vulcan XC-72,

5 номинальный размер частиц 30 нм) с помощью окислительной деструкции комплекса сульфита платины в присутствии угольного порошка при использовании Нг02, в результате чего коллоидная платина с размером частиц 1,5-2,5 нм осаждается на

поверхность частиц угольного порошка. Затем платинизированный угольный порошок расплавляют и наплавляют на поверхность графитизированной электропроводной угольной бумаги, используя 50% от веса платинизированной угольной бумаги политетрафторэтилена в качестве связующего. Полученный платинизированный угольный бумажный электродный материал имеет толщину 0,1-0,5, мм, а платинизированный слой 0,24 мг. Для испытаний (примеры (-3) угольный бумажный электродный материал нарезают на диски диаметром 5 мм и укрепляют на платинизированном рабочем электроде, показанном на фиг. 1, В каждом случае площадь электрода из угольной бумаги, соприкасающаяся с образцом, составляет 0,16 см2. Получены следующие результаты.

Пример 1. Электрохимическое окисление ЫАДН на платинизированной угольной бумаге (РСР).

Используя стандартную потенциоста- тическую методику, образцы 20 мМ ЫАДН раствора в трис-HCI буфере с рН 9 добавили в элемент, содержащий 2 мл смеси 0,1 М фосфата с рН 7 и 1 М KCI буферного раствора. Платинизированный угольный бумажный электрод (РСР) поддерживают под разными потенциалами по отношению к эталонному Ag/Ag CI электроду. Обратный .электрод - платиновый. Получены участки пс чнногс тока (фиг. 2), пропорцио- нальныг онцентрации ЫАДН (таблица и фиг. fy

П р i м е о 2. Ответ ЫАДН - электродной системы нэ пирприноградную кислоту в присутствии лактат дегидрогеназы (LDH)

Испол ЗУИУ аналогичный глемент, со- деруащ1/.- «2 i- v. .ч АДН и 10 мМ пирови- ноградной кисло о. о --л расiвор фосфата в КС с рН : ри температуре 25°С. Рабочий, братный и эталонный электроды тэлие же, .гзк в примере 1. Рабочий электрод находит гго од напряжением 400 мВ и дает посто н.- ч З сигнал 170 мкА выше обратного тоги После добавления 120 единиц LDH (сео.ьае ;loiKa тип XV) ток уменьшается с первоначальной скоростью 92 мкА/мин (фиг. 4). Это показывает, что ферментативное превращение пирувата в лактам эффективно отслеживается с помощью ЫАДН, электрохимически соединенного с электродом.

Прим е р 3. Ответ ЫАДН-электродной системы на ацетальдегид в присутствии алкоголь дегидрогеназы (АДН) на РСР электроде

В элемент помещают 3 мМ ЫАДН и35 мМ ацетальдегида в 2 мл буферного раствора трис/HCI с рН 9 при температуре 25°С. Рабочий, обратный и эталонный электроды - как в примере 1. Рабочий электрод имеет потенциал 400 мВ и дает постоянный сигнал 40 мкА выше обратного. После добавления

5 2 единиц АДН (печень лошади) ток падает с начальной скоростью 130 мкА/мин (фиг. 5) показывая, что ферментативное превраще ние ацетальдегида в этанол эффективно отслеживается через посредство МАДН,

0 электрохимически связанного с электродом.

В следующих примерах использованы либо двухэлектродные, либо трехэлектрод- ные элементы, Трехэлектродные элементы

5 проиллюстрированы на фиг. 1.

Пример 4 (фиг. 6). Данные получены при использовании двухэлектродной ячейки, поляризованной при 200 мВ. Использу0 ют буферный раствор 16 ммоль/л NaH2P04, 53 ммоль/л N32HP04. 52 ммоль/л NaCI, 1,5 ммоль/л этилендиамин тетрауксусной кислоты с рН 7,4. После достижения в этом буфере стабильного обратного тока буфер

5 удаляют с мембраны и заменяют образцом ЫАДН в том же буфере. Фиксируют пиковый ток. На фиг. 6 показаны ответы платинизи- рованного угольного бумажного электрода Ьирмы, который включает связанные смо0 лой платинизированные частицы угля, нанесенные на электропроводную угольную бумажную подложку, причем связанный смолой платинизированный угольный слой содержит по массе 50% политетрафторэти5 лена, 45% угля тонкого помола (Vulcan XC72) и 5% коллоидной платины, предварительно адсорбированной на угольный порошок, Для минимизации обратного тока адсорбируют 5 мг/мл белкового раствора (глюкозо-

0 оксидаза) на электрод в течение ночи перед измерением ЫАДН, Следует указать на то, что глюкозооксидаза является подходящим белком.

П р i-, мер 5 (фиг. 7), Этот пример

5 иллюстрирует применимость настоящего изобретения для измерения использующих МАДН ферментов. Используют трехэлект- родную ячейку, снабженную магнитной мешалкой. Рабочий электрод представляет

0 собой платинизированную угольную бумагу, как в примере 4, но L-лактатдегидрогена- зу (ЕС 1.1.1,27 из коровьего сердцр) внедряют в электрод через карбодиимидное соединение.

5 Первоначально ячейка содержит 12,5 ммоль/л ЫАДН в буферном растворе 0,1 моль/л фосфата и 1 моль/л KCI с рН 7. Поляризующий потенциал составляет 350 мВ. Устройство можно использовать для отслеживания расхода МАДН, когда в

лемент добавляют аликвоты пировиног- адной кислоты, как показано на рисунке.

Пример 6 (фиг. 8). Пример 5 повторят, за исключением того, что иммобилизоанную лактатдегидрогеназу заменяют глюкозодегидрогеназой (ЕС 1.1.1,47 из Bacillus sp., поставляемую Slgma, 100-300 Ед/мг протеина), иммобилизованной на лектрод таким же способом. В то время как актатдегидрогеназу используют для опрееления количества пировиноградной кисоты путем отслеживания расхода ЫАДН пируват + МАДН ---з-лактат + ЫАД глюкозодегидрогеназу используют для определения количества глюкозы по выработке ЫАДН

/3- Д - глюкоза + НАД ----.-.---.,. - глюконолактон + МАДН. Элемент содержит 0,1 моль/л фосфата, 0,1 моль/л KCI, 2,4 ммоль/л ЫАД при рН 7. Пример 7 (фиг. 9). По методике примера 4 выход с содержащего оксид платины угольного электрода измеряют при 200 мВ (по отношению к эталонному Ад /Ад CI электроду) в двухэлектродном элементе при различных концентрациях ЫАДН. Получен практически линейный ответ, эквивалентный тому, что получают при платинизи- рованных угольных бумажных электродах. В этом случае электродный материал включает слой связанных смолой (политетрафорэтилен) угольных частиц, причем 5% по весу (от общего веса связанных смолой частиц) оксида платины предварительно адсорбировано на частицы угольного порошка; связующее 50% по весу, уголь 45% по весу, и связанных с поверхностью электропроводной Тогау (торговая марка) угольной бумаги.

Пример 8 (фиг. 10). По методике примера 4 выход тока с палладиизирован- ного угольного бумажного электрода измеряют при 200 мВ (по отношению Ag/Ag CI), используя двухэлектродный элемент при различных концентрациях ЫАДН. В этом случае также имеют линейный ответ (фиг. 10). Электродный материал, как описано в примере 7, имеет связанные смолой частицы угля, которые включают 5% по весу пред- варительно адсорбированной платины тонкого помола.

В описанных примерах продемонстрировано использование электродных материалов для проведения быстрого и воспроизводимого окисления ЫАДН. Эти ответы значительно отличаются от результатов, которые получают с другими электродными материалами, как показано в сравнительных примерах при использовании платины, стеклоуглерода или графитового электродного материала, которые (за редким исключением) обычно вязкие, относительно нечувствительные и значительно с худшей воспроизводимостью. Представляется, что эффективность использованных платинизированных или палладиизирован- ных угольных электродов является результатом их гетерогенной структуры и их совместимости с биологическими молекулэ0 ми, такими как ЫАДН и ферменты, Окисление ЫАДН также эффективно проходит в присутствии ферментов и субстратов и может быть использовано в качестве базиса для быстрого связанного с МАДН фермента5 тивного исследования. Эффективность исследований пирувата (с использованием LDH) и ацетальдегида (с использованием АДН) видна из примеров, но большое число аналогичных исследований можно прове0 сти, используя другие ферменты и субстраты.

Токовый ответ платинизированной угольной бумаги на концентрацию ЫАДН при различных равновесных потенциалах.,

5Формула изобретения

1. Способ приготовления электродов для количественного электрохимического определения 1,4-дигидроникотинамида аденин динуклеотида (ЫАДН) в растворе,

0 включающий модификацию электрода из углеродного материала путем адсорбции веществ, снижающих перенапряжения в реакции электроокисления, отличающий- с я тем, что, с целью повышения операци5 онной стабильности электрода, в качестве углеродного материала используют связанный смолой слой угольных или графитовь.х частиц размером 5-30 нм, а в качестве веществ, снижающих перенапряжение реак0 ции электроокисления, используют частицы платины или палладия коллоидного размера 1,5-2,5 нм.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве смолы используют полит- 5 етрафторэтилен.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что связанный смолой слой угольных или графитовых частиц с адсорбированными частицами металла или окиси металла 0 наносят на поверхность электропроводящего подложечного слоя, представляющего собой электропроводную углеродную бумагу.

4. Способ по пп. 1 иЗ, отличаю щи й- 5 с я тем, что на поверхности электрода иммобилизуют ЫАО-зависимый фермент.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что на поверхности электрода дополнительно иммобилизуют кофактор NAD или NADH.

Токовый ответ плэтинизировэнной угольной бумаги на концентрацию МДН при

различных равновесных потенциалах

Использование: аналитическая химия, аналитическая биохимия. Сущность изобретения: концентрацию МАДН в анализируемом образце определяют методом электрохимического окисления, причем в качестве электрода используют связанный смолой слой угольных или графитовых частиц, содержащих также частицы платины или палладия. На электроде также могут быть иммобилизированы (МАД-зависимые ферменты и МАД. 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 10 ил.

ГТ Г

lii-tLltil- fQ

SO

Ю0{мм) Ю0(пкл) 100 пм 20 пМ НАИН

60

120Ш

Время, с.

Рм;3

810

K«H4tHTj a iuf МДН, нН

т г

120 Eg, LDH

.

wo

Скорость уменьшения тока 92 мкА-/мин

5

: т

100

t

о

ФцъЛ

100 мкл юо мм

пируйата

ЮОпкл ЮОнм I пиру дата

j

120

Ш

Вреня ,сех.

§

§

§.

У ми щ

щ

1

i

f.M- умн омош чшзоншоиц

О

23 4 5 6

концентрация пируВата, м моль/л

Фиг, 8

6 Ю 18 22 концентрация глю- козы,ммоль/л

Фие.9

Фиг.10

2030 НАДИ, ММОЛЪ/Л

2030 НАДИ НПОЛЬ/Л