Способ снижения неспецифической флуоресценции при иммунофлуоресцентной микроскопии клеточных белков Советский патент 1993 года по МПК G01N33/533 

Изобретение относится к клеточной биологии, а именно к иммуноцитохимическим методам исследования, и может быть использовано в лабораторной практике.

Цель изобретения - улучшение качества свечения комплекса антиген-антитело при иммунофлуоресцентной микроскопии биологических образцов за счет снижения неспецифической флюоресценции.

Поставленная цель достигается путем истощения вторичных антител с помощью обработки протопластами, полученными из высших растений, Роль связывающих белков в этом случае могут выполнять лектины, биологическая активность которых сходна с таковой гликопротеидов печени. Формируя рецепторные участки на поверхности мембраны растительной клетки, они сохраняются в нативном состоянии в изолированных протопластах и поэтому могут обеспечивать большую степень истощения вторичных антител (сыворотки). В результате такой процедуры значительно снижается неспецифическое свечение исследуемых объектов.

Сущность изобретения заключается в том, что концентрированную суспензию протопластов/полученных после соответствующей обработки растительной ткани или культивируемого каллуса ферментной смесью на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ, добавляют к вторичной сыворотке, меченной флуоресцентным зондом, в соотношении 1:1 (объем/объем) для ее истощения. После инкубации истощенную таким образом сыворотку очищают от примесей и используют для иммунофлуоресцентной микроскопии.

Пример 1. Лиофилизированная сыворотка (вторичные антитела) разводилась 0,15 М натрий-фосфатным буфером, рН 7,2 (из расчета 1 мг сыворотки на 1 мл буфера). После легкого встряхивания пробирку со смесью сыворотки и протопластов выдер- живали при комнатной температуре 55-60 мин, периодически взбалтывая во избежание осаждения протопластов. Затем смесь центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Очищенную таким образом от протопластов сыворотку переносили в другую пробирку и

(Л

С

разводили до концентрации, необходимой в конкретном опыте. После этого ее еще раз центрифугировали при 12000 об/мин на протяжении 5-7 мин.

Параллельно получали протопласты путем обработки каллуса табака Nicotiana tabacum смесью целлюлолитических ферментов. Свежеизолированные протопласты наносились на предметное стекло с полилизином и фиксировались в 3,7%-ном пара- формальдегиде в течение 60 мин. Фиксированные клетки пермеабилизирова- ли 1%-ным тритоном Х-100 в течение 30 мин. После промывки в буфере, содержащем 0,05 М MES, pH 6,7 0,05 М KCI, 2 мМ MgCl2, ЮмМЭГТА, 1 мМЭДТА, полученные образцы обрабатывали первичными антителами к тубулину (основному белку микротрубочек) (6) и вторичными антителами, истощенными, как указано выше.

Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии кортикальных микротрубочек в исследуемых протопластах показывают, что при обработке клеток вторичными антителами после их истощения в соответствии с предложенной процедурой качество получаемых изображений лучше, чем при обработке клеток вторичными антителами без истощения. Это выражается в резком снижении уровня неспецифического свечения наблюдаемых объектов, что позволяет более четко визуализировать пучки микротрубочек как в примембранном слое, так и в цитоплазме протопластов.

Пример 2. Культивируемые лимфоциты линии Molt-4 (Т-клеточный острый лим- фобластный лейкоз) наносились на предметное стекло с полилизином и фиксировались в 3,7%-ном параформальдегиде в течение 10 мин. Дальнейшая подготовка образцов для иммунофлуоресцентной микроскопии, включая использование первичных антител к тубулину, истощение вторичных антител и обработку ими биологического материала проводилась в соответствии с процедурой, изложенной в примере 1.

В результате обработки лимфоцитов вторичными антителами, истощенными протопластами, качество визуализации микротрубочек резко улучшается за счет снижения неспецифического свечения образцов и соответствующего уменьшения фона. При этом удается наблюдать отдельные нити упорядоченной сети цитоплазма- тических микротрубочек.

Пример 3. Каллус табака Nicotiana tabacum обрабатывали смесью целлюлолитических ферментов по методике (4) для получения протопластов. Фиксацию и пермеабилизацию протопластов осуществляли как описано в примере 1. Подготовленный таким образом материал обрабатывали первичными антителами AFB, специфически узнающими белки промежуточных фи5 ламентов в растительной клетке и реагирующими с белками промежуточных филаментов животной клетки. Истощение вторичных антител и окрашивание ими образцов производили аналогично процедуре,

0 описанной в примере 1.

Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии промежуточных филаментов в исследуемых протопластах показывают, что при обработке материала вторичными анти5 телами после их истощения удается получить четкое изображение визуализируемых структур в сравнении с обработкой клеток вторичными антителами без истощения. Пример 4. Лимфоидные клетки Molt-4

0 наносились на предметное стекло с полилизином. Фиксированные и пермеабилизиро- ванные клетки (см. пример 2) обрабатывались первичными антителами МРМ-2, которые узнают фосфорилирован5 ные белки в интерфазных и митотических клет ках, связанные с ядерной оболочкой. Последующая подготовка вторичных антител и обработка ими клеток производилась согласно процедуре, описанной в примере 1.

0 При исследовании взаимодействия антител МРМ-2 с лимфоидными клетками Molt- 4 установлено, что обработка образцов истощенными протопластами вторичными антителами позволяет идентифицировать

5 антигены к первичным антителам в составе ядерной оболочки, в то время, как другие компоненты клеток характеризуются низкими уровнями неспецифического свечения, чего не удается достичь при общепринятых

0 процедурах истощения вторичных антител или при использовании их без истощения.

Пример 5. Процедура подготовки протопластов из каллуса Nicotiana tabacum проводилась согласно известной методике.

5 После получения свежеизолированных протопластов они подвергались фиксации и пермеабилизации как описано в примере 1. Подготовленные клетки обрабатывались первичными антителами МРМ-13, получен0 ными против перицентриолярного материала, входящего в состав центров организации микротрубочек, а затем вторичными антителами, истощенными как описано в примере 1.

5 Использование в данном случае истощенных протопластами вторичных антител позволяет достичь более четкой идентификации диспергированных в цитоплазме свежеизолированных протопластов компо нентов центров организации микротрубочек без заметного фона, обусловленного неспецифической флуоресценцией.

Таким образом, приведенные примеры показывают, что истощение вторичной сыворотки протопластами позволяет улучшить качество результатов иммунофлюоресцент- ной микроскопии клеточных белков за счет снижения уровня неспецифической флуоресценции. Кроме того, при использовании самих протопластов в качестве объектов для иммунофлюоресцентной микроскопии становится возможным применение их же для истощения сыворотки.

Формула изобретения

0

Способ снижения неспецифической флуоресценции при иммунофлуоресцент- ной микроскопии клеточных белков, предусматривающий обработку комплекса выявляемых белков и специфических первых антител вторыми истощенными антителами, меченными флуоресцентным зондом, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа вторые антитела истощают суспензией протопластов растений в соотношении 1:1.

Использование: биотехнология, имму- ноцитохимические методы исследования. Сущность изобретения: для снижения неспецифической флуоресценции при исследовании клеточных белков предложено истощать вторые антитела суспензией протопластов. В результате эффективность им- мунофлуоресцентной микроскопии резко повышается за счет уменьшения фонового свечения.