ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS CYANOOXIDANS, РАЗЛАГАЮЩИЙ ЦИАНИСТЫЕ СОЕДИНЕНИЯ НАТРИЯ И КАЛИЯ Советский патент 1995 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к биологической очистке сточных вод, и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке стоков от цианидов на золотоизвлекательных фабриках, в гальваническом, коксохимическом производствах и предприятиях цветной металлургии.

Цианиды присутствуют в промышленных сточных водах рудообогатительных фабрик, рудников, приисков, гальванических цехов металлургических и металлообрабатывающих заводов, газогенераторных станций, газовых и коксохимических заводов. Токсические и смертельные концентрации для рыб 0,04-0,3 мг/л цианидов.

Известны штаммы Pseudomonas Fluorescens, устойчивые к 50 мг/л цианида, но деградирующие при этой концентрации только 50% этого высокотоксичного соединения.

Известен штамм микроводорослей Scenedesmus obliguus 885, который характеризуется устойчивостью к цианистым соединениям при концентрациях не выше 63-64 мг/л, а также способный в лабораторных условиях полностью окислять их через 120 ч.

Однако известный штамм является малоэффективным, так как для окисления даже малых концентраций цианидов требуется значительное время, а при высокой концентрации (выше 64 мг/л) штамм погибает.

Известен также штамм Bacillus cyanooxidans 661-М2, полученный методом индуцированного мутагенеза, способный разрушать цианиды в сточных водах при концентрациях циана до 70 мг/л в течение 4-6 сут. Данный штамм устойчив к цианистым соединениям при их концентрации до 100 мг/л.

Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, обладающего способностью разлагать цианиды с большей скоростью в широком диапазоне концентраций.

Это достигается тем, что выделен штамм бактерий Bacillus cyanooxidans, устойчивый к цианистым соединениям при их концентрации до 1000 мг/л, использующий цианиды в качестве источников азота и полностью разлагающий их в концентрациях до 250 мг/л.

Штамм выделен из сточных вод Кентауского обогатительного комбината.

Штамм Bacillus cyanooxidans депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР и хранится в ней под номером ВКМ В-1838Д.

Штамм имеет следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки. Клетки одиночные, прямые, короткие палочки 0,6-0,8х1,3-1,8 мкм, подвижные: движутся при помощи перитрихиально расположенных жгутиков. Грамположительные. Образуют эллиптические эндоспоры, расположенные терминально. Внутриклеточные кристаллы белка отсутствуют. На минеральной агаризованной среде Путилиной с 200 мг/л цианида калия образуют 1 мм точечные желтовато-белые округлые колонии. На МПА колонии концентрические, слабо выпуклые, с ровным краем, желтовато-белые, однородные, консистенция вязкая, профиль кратерообразный, до 5 мм в диаметре. На МПБ образуют пленку и вызывают слабое помутнение. Пигмент в среду не выделяют.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Имеет каталазу, дает отрицательную оксидазную реакцию. Растет при 10-55^оС, оптимум при 30-35^оС. Пределы рН для роста 5,0-9,0. Оптимум рН 6,0-8,0. Реакция Фогес-Проскауэра (на ацетоин) положительная. Рост в анаэробных условиях отсутствует. Кислота образуется из глюкозы, арабинозы, целлобиозы, фруктозы, мальтозы, маннозы, раффинозы, рибозы, сорбозы, глицерина, сахарозы, трегалозы. Нет кислотообразования из ксилозы, маннита, адонита, дульцита, галактозы, инозита, лактозы, рамнозы, сорбита. Газ из глюкозы не образует. Гидролизует казеин, крахмал, желатин. Не гидролизует твин-80, мочевину, хитин, декстрин. Утилизирует глюкозу, арабинозу, фруктозу, глицерин, инулин, лактат, мальтозу, маннозу, раффинозу, рибозу, сахарозу, трегалозу, пируват, цитрат, малат. Не использует метанол, этанол, бутанол, метиламин, саркозин, формиат, ксилозу, фумарат, α-кетоглутарат, n-оксибензоат, м-оксибензоат, аланин, валин, глицин, серин, метилмочевину, бетаин, фенилаланин, орнитин, гистидин, сорбит, мелицитозу, тиамин, пропионат, ацетат, аспартат, глутамат, глутарат, гликолат, маннит, сукцинат.

Тирозин не разлагает.

Фенилаланин не дезаминирует. Нитраты до нитритов не восстанавливает, газ из NO₃ не образует. Имеет желтковую лецетиназу. Липаза, аргининдигидролаза, лизиндекарбоксилаза и β-галактозидаза отсутствуют. Индола не образует. На среде с глицерином образует диоксиацетон. Растет при рН 5,7 и 6,8; при 2, 7 и 10. NaCl в среде роста нет. Нет роста при 5^оС и 65^оС. Растет в присутствии лизоцима. Не растет автотрофно в атмосфере СО₂+Н₂+О₂. Поли β-оксибутират внутриклеточно не накапливает.

В качестве источника азота использует КСN, NaCN, соли аммония. Не усваивает нитратный, нитритный азот и мочевину.

ГЦ моль. % ДНК (т.пл.) 42,3. Не нуждается в факторах роста, не патогенен.

Уровень ДНК-ДНК гомологии Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838 D и типовой культуры Vacillus subtillis ВКМ В-501Т составляет 35%, с Bacillus pumilus АТСС 7061 составляет 27%.

Условия хранения штамма Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - молоко. При этом свойства штамма устойчивы. В лабораторных условиях культура поддерживается на косяках с МПА и пересевается 1 раз в месяц.

Испытания по разрушению цианидов предлагаемым штаммом проводили как в лабораторных условиях, так и в биореакторе.

П р и м е р 1. Деградация цианидов штаммом Bacillus сyanooxidans при периодическом культивировании в лабораторных условиях.

Культуру Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д выращивают на МПА с 0,2% КСN (или NaCN) в течение суток при 29^оС. Суспензию выросшей культуры высевают в колбы на 750 мл с 200 мл среды следующего состава, г/л: К₂НРО₄ 0,5; КН₂РО₄ 0,5; MgSO₄˙7H₂O 0,150; FeSO₄˙7H₂O 0,002, пируват натрия 0,1; КСN 0,2; рН среды 8,0-8,3.

Культивирование проводят на качалке (120 об/мин) при 30^оС. Параллельно ставят контроль на деградацию цианида без бактерий, также при рН 8,0-8,3.

В течение 3 сут. через 3 ч отбирают пробы и определяют концентрацию цианида колориметрически с пикриновой кислотой (см. табл. 1). Содержание цианида через 12 ч составляет 50% от исходного, через 2 сут. 5%, через 3 сут. цианид в среде отсутствует.

П р и м е р 2. Деградация цианидов в биореакторе при иммобилизации клеток на синтетическом материале типа "вии", поликапроамидное волокно.

Верхнюю часть лабораторного биореактора (цилиндр h=1 м, d=10 см) заполняют синтетическим материалом типа "вии", закрепленным на насадке, вверху устанавливают капельницу, обеспечивающую регулируемую подачу среды, внизу - сток, подают 130 мл суспензии (10⁶ клеток/мл) Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д и заполняют синтетической средой, как в примере 1, но без пирувата натрия, т. е. без дополнительного источника углерода. После иммобилизации штамма в течение суток в стационарных условиях устанавливают проток биореактора 0,06-1 ч и варьируют концентрации цианидов в подаваемой синтетической среде. Отбор проб и анализ содержания цианидов осуществляют ежедневно в течение 3 месяцев. При концентрациях цианида от 10 до 250 мг/л достигается 100%-ная деградация цианида, при 300-500 мг/л деградация близка к 100% (см. табл. 2). В течение трех месяцев при 15-25^оС биореактор работает стабильно.

П р и м е р 3. Деградация цианидов производственных сточных вод в лабораторных условиях.

Культуру Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д выращивают на МПА с 0,2% KCN (или NaCN) в течение 1 сут. при 29^оС. Суспензию выросшей культуры высевают в колбы на 750 мл с 200 мл сточной воды, содержащей источники фосфора: г/л: К₂НРО₄ 0,5; КН₂РО₄ 0,5 и КСN 0,2, как в примере 1.

Культивируют на качалке (120 об/мин) при 30^оС, анализ проб на содержание цианидов осуществляют, как в примере 1. Через трое суток цианид в среде отсутствует.

П р и м е р 4. Деградация цианидов производственных сточных вод в биореакторе.

Для очистки реального стока используют иммобилизованные на стеклоткани клетки. В биореактор объемом 250 мл, имеющий штуцера для подвода среды и воздуха, помещают стеклоткань площадью 100 см² и вносят 100 мл суспензии клеток Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д (10х6 клеток на мл) в синтетической минеральной среде, как в примере 1, но с содержанием цианида 100 мг/л. В течение 3 сут. проводят культивирование при ежесуточном добавлении КСN до конечной концентрации 100 мг/л и аэрации (10 мл воздуха в 1 мин.). Количество сорбированных клеток определяют по разнице внесенной биомассы и ее остаточного содержания в растворе после проведения иммобилизации. Количество сорбированных на стеклоткани клеток через 3 сут. составляло 73% от внесенного. После этого начинают подавать сточную воду Кентауской обогатительной фабрики, нейтрализованную до рН 8,9, с добавлением однозамещенного фосфорнокислого калия 100 мг/л и содержанием цианида 100 мг/л. Скорость протока ступенчато увеличивали до 0,06 ч. Процесс очистки проводят при 20^оС, фракции обрабатываемой сточной воды собирают с интервалом в 3 ч анализируют на содержание цианида. Концентрация цианида в очищенной воде составляла 0,1 мг/л, т.е. достигалась степень очистки 99,99%.

Следовательно, предлагаемый штамм Bacillus Cyanooxidans ВКМ В-1838 Д при периодическом культивировании в лабораторных условиях способен полностью разлагать цианид при его концентрации до 200 мг/л за 2,5 сут. В проточных условиях культивирования клетки Bacillus cyanooxidans, иммобилизованные на синтетических носителях, способны полностью разлагать цианистые соединения натрия и калия при их концентрации до 250 мг/л. При концентрации цианидов до 500 мг/л степень деградации достигает 98%.

В производственных сточных водах штамм Bacillus Cyanooxidans ВКМ А-1838Д полностью разлагает цианиды в концентрации до 200 мг/л за 3 сут.

Таким образом, преимущество предлагаемого штамма в сравнении с известными связано с его повышенной устойчивостью и более высокой окислительной способностью к цианистым соединениям калия и натрия, что позволяет эффективно использовать его для очистки цианидсодержащих сточных вод.

Штамм Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д устойчив к цианистым соединениям при их концентрации до 1000 мг/л, что в 10 раз выше по сравнению со штаммом-прототипом, который устойчив к цианистым соединениям при их концентрации до 100 мг/л.

В производственных сточных водах предлагаемый штамм полностью разлагает цианиды при их концентрации до 200 мг/л за 3 сут., что в несколько раз больше, чем штамм-прототип, который разлагает цианиды в сточных водах при концентрациях циана до 70 мг/л в течение 4-6 сут.

Использование: биологическая очистка сточных вод от цианидов. Сущность изобретения: из сточных вод Кентаусского обогатительного комбината выделен штамм бактерий Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д, устойчивый к цианистым соединениям при их концентрации до 1 г/л. В производственных сточных водах штамм за 3 сут. полностью разлагает цианиды при их концентрации до 200 мг/л. 2 табл.

ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS CYANOOXIDANS, РАЗЛАГАЮЩИЙ ЦИАНИСТЫЕ СОЕДИНЕНИЯ НАТРИЯ И КАЛИЯ.

Штамм бактерий Bacillus cyanooxidans ВКМ В-1838Д, разлагающий цианистые соединения натрия и калия.