Штамм бактерий РSеUDомоNаS Sp., осуществляющий полное разложение метилацетата Советский патент 1991 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C02F3/34 C02F101/30 C02F103/36 

1

(21)4761823/13 (22) 28.08.89 (46) 23.10.91. Бюл. №39 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР (72)Д.Ю.Раков, Н.В.Доронина, Ю.А.Троцен- ко и Р.М.Алиева (53)663.15(088.8)

(56) Бюлер Н., Пирсон Д. Органические синтезы, ч. 2. - М.: Мир, 1973.

Вейганд-Хильгетан. Методы эксперимента в органической химии. М.: Химия, 1968.

(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИЙ ПОЛНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ МЕТИЛАЦЕТАТА

(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод аце- тальдегидного производства. Штамм Pseudomonas sp. BKM В-1736Д выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм способен полностью разлагать метилацетат при его концентрации 0,1-6 г/л, за 5-8 ч, после предварительной адаптации не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат в качестве источников углерода и энергии. 1 табл.

сл

С

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности биологической очистке сточных вод, и касается нового штамма бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства.

Цель изобретения - получение нового штамма бактерий, обладающего способностью утилизировать метилацетат.

Метилацетат (метиловый эфир уксусной кислоты) - летучий, высокотоксичный синтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях.

Металацетат может быть гидролизован до ацетата и метанола химическим путем при нагревании в щелочных условиях. Таким образом, при омылении метилацетата необходимы большие количества щелочи, что усугубляется низкой кислотностью стока ацетальдегидного производства (рН 3-4), и постоянное нагревание реактора (для отгонки метанола и смещения реакции в сторону разложения металацетата). В эк псгиче- ском плане подобная очистка малоэффективна, поскольку образуется токсичный метанол. Создание дополнительных реакторов требует значительных капиталовложений.

Микробиологическая очистка имеет по сравнению с известным методом ряд пре: имуществ: полная утилизация метилацетата бактериями - деструкторами в локальном стоке и меньшие энергозатраты.

о

00

ел ю ю ел

Выделен штамм Pseudomonos sp. 27RD, попностью разлагающий метилаце- тат. Штамм выделен из сточных вод аце- тальдегидного производства. Штамм полностью разлагает метилацетат, используя его в качестве источника углерода и энергии.

Штамм имеет следующие культурально- морфологические и физиолого-биохимиче- ские свойства.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки - бесцветные подвижные палочки 0,5-0,8 х 1,5-2,5 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорооб- разующие, не имеющие сложных внутрици- топлазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не образует простек. Размножается путем деления пополам. Колонии на МПА до 4 мм в диаметре, округлые, с ровным краем, непрозрачные, бетые, слизистые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция маслянистая.

Среды для выращивания: мясо-пептон- ный бульон (агар), синтетическая среда Д (пример 1) с метилацетатом, глюкозо-карто- фельный агар.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб, расчет при температуре от 10 до 41°С, оптимум 28-32°С. Оптимум рН 6,8- 7,2, при рН 3,6 не растет. Флуоресцирующие пигменты, пиоцианин, каротиноиды не образует. Имеет аргининдигидролазу, ката- лазу, образует индол. Оксидазная реакция отрицательная. Нитраты восстанавливает в нитриты. Левам из сахарозы, ацетоин не образует. Желатин, целлюлозу поли-/3-ок- сибутират, твин-80 не разлагает, но гидро- лизует крахмал. Поли- /3-оксибутират внутриклеточно не накапливает, DL- З-окси- бутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде. В качестве источника углерода для роста использует: метанол, этанол, мезо-инозит, метилацетат, этилацетат, бутилацетат, глюкозу, трегалозу, L-арабинозу, фруктозу, L-рамнозу, D-рибозу, D-ксилозу, сахарозу, ацетат, фумарат, сукцинат, а-кетоглутарат, DL-валин, D-серин, DL-аргинин.

Среду с глюкозой подкисляет, газообразование отсутствует. Рост не обеспечивает формальдегид, формиат, метиламин, диметиламин, триметиламин, этиламин, бетаин, саркозин, этилформиат, изопропа- нол, изобутанол, / -аланин, L-серин, фени- лаланин, глиоксилат, п-оксибензоат, m-оксибензоаг. Анаэробно не ферментирует глюкозу. Не растет автотрофно в атмосфере СОа + Н2 + 02.

В качестве источника азота использует соли аммония, нитраты и некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается. Т.пл. - 61,8.

Штамм обладает карбоксилэстеразой, катализирующей гидролиз эфирной связи метилацетата с образованием метанола и

ацетата. Ацетат ассимилирует через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт (изоцитратлиазу ималатсинтазу). Метанол использует через фруктозобис- фосфатальдолазный вариант рибулозомонофосфатного цикла фиксации формальдегида, Карбоксилэстераза, дегид- рогеназы метанола (ФМС), формиата (ФМС), формальдегида (НАД) и гексулозо- фосфатсинтаза индуцибельны. Оксипируватредуктаза и рибулоз обисфосфаткарбок- силаза отсутствует.

Штамм является факультативным мети- лотрофом. Условия хранения штамма.

Штамм хранится в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - молоко. При этом свойства штамма устойчивы. В лабораторных условиях культура поддержи- вается на косяках с МПА и пересевается через 2 нед.

Поскольку ферменты, ответственные за деградацию метилацетата, индуцибельные, существенные отличия наблюдаются при использовании этого субстрата адаптированной и неадаптированной культурой. Адаптированная культура Pseudomonas sp. ВКМ В-1736Д осуществляет полное разложение метилацетата при его концентрациях от 0,1 до 6 г/л за 5-48 ч соответственно (таблица 1).

В стоках ацетальдегидного производства содержится около 0,15-0,20 г/л метилацетата, однако при залповых выбросах концентрация этого соединения может достигать 1,0-2,0 г/л.

П р и м е р 1. Использование метилацетата неадаптированной культурой.

Культуру Pseudomonas sp. 27KL) (ВКМ В-1736Д) выращивают на МПА в течение суток. Суспензию выросшей культуры (неадаптированной) высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды следующего состава, г/л дистиллированной воды: (МН4)Н2Р041,0

К2НР04 1,0

NaCI5,0

MgSCM-7H200,2

FeSO r7H200,004

Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин, метилацетат вносят в колбу в концентрации 2 г/л и после засева закрывают резиновой пробкой для предотвращения испарения метилацетата.

Культуру выращивают на качалке при 180 об/мин при 29°С. Контроль за процессом деградации метилацетата осуществляют хроматографически. Колонка (70 см; 0-2 мм) заполнена Порапаком Q, скорость Н230мл/мин,воздуха300мл/мин, М2-ЗОмл/мин. Температура колонки 110°С. Ацетат определяют на газовом хроматографе. Колонка (1,8 м; ЈС- 4 мм), заполнена Порапаком QS. Скорость Нг 35 мл/мин, воздуха 300 мл/мин, N2 35 мл/мин. Температура колонки 160°С.

Процесс разложения метилацетата неадаптированной культурой начинается только через 4 сут. Содержание метилацетата по данным газовой хроматографии через 43 сут составляет 93% от исходного, через 5 сут 75%, через 6 сут 25%, через 7 сут метилацетат и продукты его гидролиза - метанол и ацетат в среде не обнаруживается. Период активной деградации метилацетата совпз- дает с активным приростом биомассы.

П р и м е р 2. Использование метилацетата адаптированной культурой.

30 мл суспензии, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной культуры Pseudomonas sp. 27RD (адаптированной, не менее 3 пассажей на среде с метилацетатом), высевают в колбы на 750 мл со 100 мл среды,описанной в примере 1.

В качестве источника углерода в энергии вносят 2 г/л метилацетата. Количественный газохроматографический анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждый 3 ч в течение 24 ч культивирования. К 6 ч культивирования в среде накапливается около 0,015 г/л метанола, который полностью исчезнет к 21 ч Ацетат отсутствует в течение всего периода культивирования. К 12 ч содержание метилацетата в среде составляет 15% от исходного. Анализ культуральной жидкости через 24 ч свидетельствует о полном использовании метилацетата.

Таким образом, штамм Pseudomonas sp.27RD(BKM В-1736Д)обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 6 г/л. используя продукты его гидролиза ацетат и метанол в качестве источников углерода и энергии, что обеспечивает возможность использования данного штамма при очистке промышленных сточных вод ацетальдегидного производства.

Формула изобретения Штамм бактерий Pseudomonas sp. BKM В-1736Д, осуществляющий полное разложение метилацетата.