1
(21)4759597/13 (22)28.08.89 (46)30.10.91. Бюл. ISfc40 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Институт микробиологии и вирусологии АН КазССР (72)Д.Ю.Раков, Н.В.Доронина, Ю.А.Троцен- ко и Р.М.Алиева (53)663.15(088.8)
(56)Бюлер Н., Пирсон Д. Органические синтезы. Ч. 2. М.: Мир, 1973.
Вейганд-Хильгетач Методы эксперимента в органической химии, М.: Химия, 1968.
(54) КОНСОРЦИУМ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SP. И METHYLOBACILLUS METHANOLOVORUS, РАЗЛАГАЮЩИЙ МЕ- ТИЛАЦЕТАТ
(57)Изобретение относится к биотехнологии и касается нового консорциума штаммов бактерий, который может быть использован при биологической очистке сточных вод ацетальдегидного производства. Цель изобретения - консорциум штаммов бактерий, полностью разлагающий мети- лацетат. Консорциум бактерий полностью разлагает метилацетат, используя продукты его гидролиза - метанол и ацетат - в качестве источников углерода и энергии, при концентрации до 5 г/л в течение 15- 36 ч. В качестве деструктора метилацетата используют штамм факультативно-мети- лотрофных бактерий Pseudomonas sp BKM В-1735Д, обладающий карбоксилэстеразой, совместно со штаммом Methylobaclllus methanolovorus BKM В-1447Д, облигатно использующим метанол. Штамм Pseudomonas sp. выделен из сточных вод ацетальдегидного производства в Казахской ССР. Штамм Methylobaclllus methanolovorus выделен из активной коры очистных сооружений цел- люлозно бумажного комбината Эстонской ССР. Консорциум используют при соотношении штаммов 2:1. 1 табл.
(Л
С
Изобретение относится к биотехнологии и касается нового консорциума штаммов бактерий, который может быть использован при биологический очистке сточных вод ацетальдегидного производства.
Метилацетат (метиловый эфир уксусной кислоты) - летучий высокотоксичный синтетический поллютант, химически устойчивый при нормальных условиях. В патентной и научно-технической литературе нет сведений о микробной деградации этого соединения.
Цель изобретения - новый консорциум штаммов бактерий, полностью разлагающий метилацетат.
Изобретение заключается в том, что в качестве деструктора метилацетата используют консорциум, состоящий из штамма фа- кул ь тати в но-мети л отрофных бактерий Pseudomonas sp. 24 RA, обладающих карбоксилэстеразой, и штамма Methylobaclllus methanolovorus BKM В-1447Д. облигатно использующего метанол.
Консорциум бактерий полностью разлагает метилацетат, используя продукты его
о со
VJ
О О 00
гидролиза (мгмянол и ацетат) в клчесгпе ис точников углерода и энергии
Штамм Pseudomonas sp 24 RA выделен ич елочных вод ацетальдегидного произвол ста в Казахской ССР.
Штамм имеет следующие характеристики
Морфолого-культуральные признаки. Клетки -- бесцветные подвижные палочки 0,5 0,7 х 1,3-1,7 мкм с одним полярным жгутиком, грамотрицательные, неспорооб- разующие, не имеющие сложных внутрици- топлазматических мембран, подобных метанотрофным бактериям. Не имеют про- стек Размножаются делением пополам, образуют полярно расположенные пили.
Колонии на МПА до 5 мм в диаметре, округлые, непрозрачные, с ровным краем, белые, поверхность гладкая, профиль выпуклый, структура однородная, консистенция вязкая.
Физиолого-биохимические признаки. Аэроб, растет при 10-39°С, оптимум 28- 32°С. Оптимум рН 6,8-7,2, при рН 3,6 не растет.
Флюоресцирующие пигменты, пиоци- онин, каротиноиды не образует. Имеет оксидазу, каталазу, аргининдигидролазу. Нитраты восстанавливает в нитриты. Леван из сахарозы, ацетоин, индол, ацетилметилкарбинол не образует. Желатин, целлюлозу, поли- / -оксибути- рат не разлагает, но гидролизует крахмал и твин-80. Поли- / -оксибути- рат внутриклеточно не накапливает. DL- / -оксибутират не использует в качестве источника углерода в недостаточной по азоту среде.
Источниками углерода для роста служат формиат, метанол или этанол при низких концентрациях (0,05-0,1%), метилацетат, этилацетат, этилформиат, бутилацегат, изо- пропанол, изобутанол, «-арабиноза, фруктоза, а -рамноза, D-рибоза, D-ксилоза, глюкоза, сахароза, D-серин, ацетат, бетаин, саркозин, глицин, фумарат, сукцинат «-ке- тоглютарат.
Среду с глюкозой подкисляет, газообразование отсутствует. Глюкозу анаэробно не ферментирует. Рост не обеспечивают формальдегид, метиламин, триметиламин, этиламин, трегалоза, / -аланин, L-сорин, фенилаланин, DL-аргинин, глиоксилат, п-ок- сибензоат, М-оксибензоат, мезоинозит.
Не растет автотрофно в атмосфере С02 f H2 + 02. В качестве источников азота использует соли аммония, нитраты и некоторые аминокислоты. В ростовых факторах не нуждается.
I |Д мт,, % ДНК (,,„) G1 ( Ийлмм Moihylobacilliis moihnnolovonjs ВМК В 144 7Д пыделен из активной коры очистных сооружений цоллюлояно-бумажного комбината Эстонской ССР и имеет следующие характеристики
Морфолого-культуральные признаки. Бесцветные подвижные палочки 0,5 х х2 мкм с одним полярным жгутиком, грамот0 рицателыные. Спор и капсул не образуют, не имеют сложных внутрицитоплазматических мембранных структур, размножаются делением пополам.
Колонии на минеральной агаризован5 ной среде с метанолом в качестве источника углерода и энергии - округлые, выпуклые, бесцветные, гладкие, до 1 мм в диаметре, край ровный, структура однородная, консистенция вязкая.
0Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб, оптимальная температура для роста 35°С, оптимум рН 6,8-7,4. Облигатный метилотроф, использует метанол в качестве источника углерода и
5 энергии, не способен к росту на средах с полиуглеродными и другими одноуглерод- ными субстратами. Источниками азота служат соли аммония или нитраты. В дополнительных факторах роста не нуждается.
0В присутствии 0,5%-ного метанола в
среде гидролизует крахмал, клетчатку не разрушает, сероводород, индол, ацетоин не образует, желатину не разжижает. Катало-, уреазо-, оксидазоположителен. Нитраты
5 восстанавливает до нитритов. Использует метанол через 2-кето-3-дезокси-6-фосфог- люконатный вариант рибулозомонофосфат- ного цикла фиксации формальдегида. Гц моль % ДНК (Т„л)- 52,2.
0Тип взаимодействия между штаммами в
консорциуме при использовании метилаце- тата симбиотический. Штамм Pseudomonas sp. BKM В-1735Д обладает карбоксилэсте- разой, катализирующей гидролиз эфирной
5 связи метилацетата с образованием метанола и ацетата. Ацетат ассимилируется этим штаммом через цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт (изоцитратлиазу и малатсинтазу). Метанол ассимилируется
0 Pseudomonas sp. BKM В-1735Д через сери- новый путь Ci-метаболизма, однако использование метанола лимитируется низкой активностью алкогольоксидазы. Метанол- дегидрогенеза(ФМС, НАД) у данного штам5 ма отсутствует. В результате культура Pseudomonas sp. BKM В-1735Д при росте на среде с высокой концентрацией метилацетата (более 2 г/л) активно потребляет один из продуктов его деградации - ацетат, а метанол постепенно накапливается вереде
и начинает ингибировать дальнейшее расщепление мегилацетата
Methylobacillus methanolovorus BKM В- 1447Д - облигатный метилотроф, обладающий метанолдегидрогеназой (ФМС) и активно ассимилирующий метанол. Methylobaclllus methanolovorus BKM В- 1447Д не ингибируется метилацетатом, но не имеет карбоксилэстеразы и не может использовать метилацетат в качестве источника углерода и энергии.
При совместном культивировании Pseudomonas sp. BKM В-1735Д и М.methanolovorus BKM В-1447Д достигается полная утилизация метилацетэта.
Получение консорциума.
Консорциум может быть составлен из суспензии клеток Pseudomonas sp. BKM B- 1735Д, выращенной на среде Д с 2 г/л метилацетата, и суспензии Methylobacillus methanolovorus BKM В-1447Д, выращенной на среде К с 5 г/л метанола, в соотношении при равной плотности суспензий соответственно 2:1. При изменении этой пропорции (в пределах 0,5:1-4:1) в начале культивирования консорциума на метила- цетате штаммы в процессе роста постепенно достигают оптимального соотношения клеток (2:1). Это обусловлено тем, что рост облигатного метилотрофа Methylobacillus methanolovorus BKM В-1447Д лимитирован метанолом, образующимся при разложении метилацетата штаммом Pseudomonas sp. ВМК В-1735Д.
Состав среды Д, г/л дистиллированной воды:
(NI-M)H2PCM1,0
К2НРСм1,0
NaCI5,0
MgS04 7 НаО0,2
FeSCM 7 H200,004
Среду по 100 мл стерилизуют в колбах на 750 мл при 1 атм 30 мин. После засева 30 мл суспензии вносят 2 г/л метилацетата и закрывают колбы резиновыми пробками для предотвращения испарения метилацетата.
Культуру Pseudomonas sp. BKM В-1735Д выращивают на качалке при 180 об/мин при 30°С в течение 30 ч.
Состав среды ой воды: КН2РСм (NN4)2 SCM MgSCM 7 НаО FeSCM 7 Н20
К, г/л дистиллирован2,0 2,0 0,175 0,002
рН 7,2 доводят раствором NaOH. Среду стерилизуют при 1 атм 30 мин.
Культуру Meihylobacillii ; mrtb -.in BKM В-1447Д выращивают к tnnh-i-. tui 750 мл с 200 мл среды и 5 г/л метанола на качалке при 180 об/мин при 30°С R точение 5 24ч.
Условия хранения консорциума и составляющих его штаммов.
Консорциум сохраняют на жидкой среде Д при 4°С и производят пересевы через 10 каждые две недели, при этом культура сохраняет высокую биохимическую активность.
В лабораторных условиях культура Pseudomonas sp. BKM В-1735Д поддержи- 15 вается на косяках с МПА и пересевается через две недели, культура Methylobacillus methanolovorus BKM В-1447Д поддерживается на агаризованных (2%) косяках со средой К и 0,5% (об/об) метанола и пере- 0 севается один раз в месяц.
Штаммы Pseudomonas sp. BKM B- 1735Д и Methylobaclllus methanolovorus BKM В-1447Д хранятся в лиофильно высушенном состоянии, защитная среда - моло- 5 ко, при этом свойства штаммов устойчивы, П р и м е р. 30 мл суспензии 109 кл/мл, выросшей на среде с метилацетатом двухсуточной ассоциации культур Pseudomonas sp. BKM В-1735Д и Methylobaclllus 0 methanolovorus BKM В-1447Д высевают в колбы со средой Д. В качестве источника углерода и энергии вносят 5 г/л метилацетата. Культивирование осуществляют на качалке при 180 об/мин при 30°С. Количест- 5 венный газохроматографический анализ культуральной жидкости на содержание метилацетата, метанола и ацетата проводят через каждые 3 ч в течение 36 ч культивирования.
0Контроль за процессом деградации метилацетата осуществляют с помощью газовой хроматографии на хроматографе Руе Unlearn 104 по убыли метилацетата и образованию метанола. Колонка (70 см, 02 мм) 5 заполнена Порапаком Q. Скорость Н2 равна 30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, N2 - 30 мл/мин. Температура колонки 110°С.
Ацетат определяют на газовом хроматографе Хром 4. Колонка (1,8 м, 04 мм) 0 заполнена Порапаком QS. Скорость Н2 равна 35 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин, N2 - 35 мл/мин. Температура колонки 160°С.
К 15 ч культивирования разлагается
65% метилацетата, метанол и ацетат в среде
5 отсутствуют. К 36 ч метилацетат и продукты
его деградации (ацетат и метанол) в среде
не обнаруживаются.
Экспериментальные данные представлены в таблице.
Как следует из данных таблицы, полученный консорциум микроорганизмов полностью разлагает метилацетат. Один из штаммов консорциума (Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д) способен полностью разлагать метилзцетат при низких его концентрациях (0,1-0,5 г/л). При более высоком содержании метилацетата в среде его деградация и рост штамма тормозятся накапливающимся токсичным метанолом.
Таким образом, консорциум бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и
Methylobaclllus methanolovorus ВКМ В- 1447Д обладает способностью полностью разлагать метилацетат при его концентрации до 5 г/л в течение 15-36 ч. что обеспечивает возможность его использования при очистке промышленных сточных вод аце- тальдегидного производства.
Формула изобретения Консорциум штаммов бактерий Pseudomonas sp. ВКМ В-1735Д и Methylobaclllus methanolovorus ВКМ В- 1447Д, разлагающий метилацетат.
