Сырье для получения молибдокофактора Советский патент 1993 года по МПК C12P9/00 C12N9/00 

Изобретение относится к биохимии, а именно к получению молибдокофактора.

Молибдокофактор (Мо-со) представляет собой 6-замещенный птерин в тетрагидро- форме, связанный с молибденом и, возможно, с пептидом. Может быть использован в научных исследованиях для установления структуры и свойств Мо-со, а также молибдоферментов (Mo-ферментов) (нитратредуктаза, ксантиноксидаза, ксантиндегидро- генаэа, альдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со. Последний может также быть использован при диагностике и лечении ряда неврологических и урологических заболеваний, связан- ных с недостатком и нарушениями биосинтеза Мо-со.

Наиболее распространенным является выделение Мо-со из животных и растительных тканей, клеток микроорганизмов, которые содержат Mo-ферменты. При этом для получения кофактора необходимо сначала выделить и очистить Mo-фермент , а затем из фермента выделить кофактор. Известно также использование зерна пшеницы в качестве сырья для получения Мо-со. Со- .держание Мо-со в семенах пшеницы, определенное по восстановлению активности дефектной по Мо-со нитратредуктазы мутанта гриба Neurospora crassa nit-1 соответствует 17,2 нмолей N02 - образованных за 1 минуту на 1 г воздушно сухой массы семян. При использовании зерна пшеницы в качестве источника для получения Мо-со необходима стадия отделения отрубей от эндосперма, что усложняет процесс получения кофактора. Кроме того в зерне пшеницы Мо-со обнаружен только в форме, связанной с белком, что также требует дополнисо

О

о

д

о

Ч

ы

тельной стадии при выделении, а именно применения денатурирующих агентов, тепловой или кислотной обработки исходного препарата.

Цель изобретения - увеличение выхода Мо-со и упрощение процесса его получения. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве сырья для получения Мо-со используют семена гороха, содержание Мо-со в которых в среднем в 10 раз, а для отдельных генотипов семян гороха в 20-30 раз выше, чем в зерне пшеницы. Кроме того, в семенах гороха Мо-со присутствует как в связанной с белком, так и в свободной форме, при этом содержание свободного Мо-со у ряда генотипов (таблица) превышает количество кофактора в связанной форме.

Пример. 5г семян каждого генотипа измельчают до состояния муки. Затем навеску муки 0,5 г экстрагируют в 2,5 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 с добавками №-ЭДТА(1 мМ)и восстановленного глу- татиона (3 мМ). Экстракцию проводят в течение 60 минут при перемешивании на магнитной мешалке при температуре 5°С. После этого экстракт центрифугируют при 13000 х g в течение 40 минут. Супернатант используют для определения содержания свободного и связанного Мо-со.

Процедура, определения связанного Мо-со включает следующие две стадии: 1 - освобождение кофактора от белка, 2 - ком- плиментация освобожденного Мо-со апо- нитратредуктазой экстракта мутанта nlt-1 гриба Neurospora crassa, дефектной по Мо- со и определение активности вновь образовавшейся in vitro нитратредуктазы. Для освобождения Мо-со экстракты подвергают тепловому шоку (прогревание на водяной бане 70°С в течение 90 секунд). Прогревание проводят в смеси, содержащей в объеме 60 мкл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4 с добавками - 1 мМ Na-ЭДТА и 3 мМ восстановленного глутагиона. При определении содержания свободного Мо-со для комплиментации используют экстракт без прогревания;

5

0

5

0

5

0

5

Комплиментацию Мо-со с экстрактом мутанта гриба Neurospora crassa nlt-1 проводят следующим образом: к 60 мкл экстракта добавляют 120 мкл смеси, состоящей из экстракта Neurospora crassa nlt-1 (80 мкл), раствора NADPH -2х10 4 М (20 мкл), раствора Na2Mo04 0,1 М (20 мкл) и оставляют на 20 часов при 5°С. Активность вновь образовавшейся In vitro нитратредуктазы 0 определяют добавлением к комплиментаци- онной смеси 100 мкл раствора FAD ( М) и 100 мкл раствора NaNOa (0,1 М) и инкубируют 40 минут на водяной бане (20°С). Для остановки реакции и удаления избытка NADPH пробы кипятят на водяной бане в течение 1.5 минут. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры и добавляют реагенты для определения нитритов: 0,5 мл раствора сульфаниловой кислоты (6 г кислоты в 1 л 20% соляной кислоты) и 0,5 мл раствора N-1-нафтилэтилендиамина солянокислого (1,23 г в 1 л дистиллированной воды). Спустя 15 минут, необходимо для развития окраски, количество образовавшихся нитридов определяют спектрофотометриче- ски при длине волны 548 нм, Содержание Мо-со выражают в нмолях нитридов, образовавшихся за 1 минуту в расчете на 1 г воздушно-сухой массы семян. Аналитическая повторность всех анализов трехкратная, биологическая - двухкратная.

Мутант гриба Neurospora crassa nlt-1 выращивают на среде Фриза. Результаты определений представлены в таблице.

Таким образом семена гороха содержат в среднем в 10 раз, а отдельные генотипы в 20:30 раз больше Мо-со, чем семена пшеницы, при этом многие сорта гороха содержат Мо-со преимущественно в свободной форме, что значительно упрощает процесс выделения. Выход целевого продукта при использовании в качестве сырья для его получения семян гороха значительно возрастает, а себестоимость снижается.

Формула изобретения

Применение семян гороха в качестве сырья для получения молибдокофактора.

Использование: изобретение может быть использовано в научных исследованиях для установления структуры и свойств молибдокофактора (Мо-со), а также молибдоферментов (Мо-ферментов) (нитратредуктаза, ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза, формиатдегидрогеназа и ряда других ферментов), активным центром которых является Мо-со. Последний может также быть использован при диагностике и лечении наследственных заболева- ,ний, связанных с отсутствием в печени больных Mo-ферментов. Сущность изобретения: предлагается в качестве сырья для получения молибдокофактора использовать семена гороха, которые содержат молибдо- кофактор как в свободной, так и в связанной с белком форме. 1 табл.

Содержание молибдокофактора в семенах гороха и пшеницы

Примечание: единица измерения молибдокофактора - нмоли нитрита, образовавшегося за 1 мин в расчете на 1 г воздушно-сухой массы семян

Продолжение таблицы