Способ получения молибдокофактора Советский патент 1989 года по МПК C12N11/00 C07D475/00 

СЛ

1C

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения молибдокофактора (Мо-ко), и может быть использовано в энзимологии и медицине. Цель изобретения - упрощение процесса получения молибдокофактора и повышение чистоты целевого продукта. Способ заключается в выделении молибдокофактора непосредственно из экстракта отрубей зерен пшеницы. Отруби экстрагируют буферным раствором, экстракт обессоливают для отделения низкомолекулярных тиолсодержащих соединений и обрабатывают мочевиной или додецилсульфатом натрия для денатурации белков и отделения Мо-ко. Мо-ко адсорбируют на тиолсефарозе, а элюцию проводят 2-меркаптоэтанолом, который затем отделяют упариванием. Полученный препарат Мо-ко гомогенен при тонкослойной хроматографии, что свидетельствует о высокой степени его чистоты. Упрощение процесса в основном заключается в том, что выделение Мо-ко осуществляется непосредственно из экстракта отрубей, а не из предварительно очищенного препарата белка (или фермента), содержащего Мо-ко.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получе- йия молибдокофактора (Мо-ко) и может быть использовано в энзнмологии, в медицине.

Цель изобретения - упрощение процесса получения Мо-ко и повышение чистоты целевого продукта.

Способ заключается в выделении Мо-ко из отрубей зерна пшеницы. Отруби обрабатывают буферным раствором для экстракции белков, содержащих связанный Мо-ко, а затем полученный экстракт обессоливают для отделения

низкомолекулярных соединений, способных связываться с тиолсефарозой. Содержащиеся в экстракте белки обрабатывают 8М мочевиной или 1%-ным до- децилсульфатом натрия для отщепления Мо-ко и переведения его в растворимое состояние. Затем проводят свя- зьшание Мо-ко на тиолсефарозе и элю- цию целевого продукта 2-меркаптоэтанолом. В предлагаемом способе отсутствует процедзфа выделения очищенного препарата белка, содержащего Мо-ко, так как выделение Мо-ко проводится из практически не;о

очищенной смеси различных белков, что существенно упрощает процесс , очистки Мо-ко. Замена прогревания на обработку денатурирующими реагентами позволяет избежать изменений Мо-ко и образования неактивных форм этого вещества, что в конечном итоге увеличивает чистоту целевого продукта. Проведение элюции 2-меркап- тоэтанолом, который в отличие от использовавшегося ранее глутатиона может быть легко отделен упариванием, также повышает чистоту целевого продукта.

Пример. 20 г отрубей зерна пшени1у 1 смешивают с 100 мл 100 i Na-фосфатного буфера (рН 7,5), содержащего 0,5 мМ ЭДТА, 0,5М NaCl, 1 мМ аскорбиновой кислоты. Эту суспензию центрифугируют при 1200g в течение 10 мин на холоде (4 С). Су- пернатант пропускают через сефадекс G-25 (или G-50) для удаления низко- молекулярных тиолсодержащих соединений экстракта, которые также могу связаться с сефарозой. В белковый пик экстракта добавляют мочевину до 8м или SDS до 1% для денатурации белковой молекулы и выхода Мо-ко в раствор. Результаты, полученные при использовании двух денатуратов, идетичны.

1 г сухого геля тиолсефарозы 4В (сефарозаглутатио«-2-пиридШ1ДИсуль- фид) замачивают в дегазированном 100 мМ Na-фосфатном буфере. Соотношение буфера к гелю 200 мл/1 г. Гел готов к использованию через 15 мин. Его помещают в целлофановьш мешок (2x30 см), который перед диализом сплющивают в ленту, чтобы максимальное количество гранул тиолсефарозы соприкасалось с мембраной. Это позволяет достичь наибольшего доступа кофактора, проникающего через мембрану к всем гранулам сефарозы. Затем целлофановый мешок с тиолсефа- розой помещают в раствор источника Мо-ко (экстракт отрубей).

Сосуд с раствором, где проводитс диализ, тщательно дегазируют и заполняют азотом. Диализ проводят до полного насыщения сефарозы кофактором, периодически обновляя источник Мо-ко (через каждые 30 мчн),

Насыщение сефарозы определяют слдующим образом. Кроме большого целлофанового мешка в раствор источник

0

5

0

5

0

5

0

5

Мо-ко помещают 10-15 маленьких мешочков с тиолсефарозой и через определенные промежутки времени (30- 45 мин) снимают их по одному, элю- ируют Мо-ко 2-меркаптоэтанолом.

Полное связывание Мо-ко с тиолсефарозой подтверждается отсутствием следов 2-тиопиридина при последующей элюции связанного кофактора 2-меркаптоэтаиолом. Содержание 2-тиопиридина контролируется спектрофото- метрически при длине волны 343 им.

Сефароза насьш ается полностью в течение 2,5-3 ч диализа. Во время диализа экстракт отрубей обновляется свежими порциями через каждые 30- 45 мин, так как отделяющийся от белка Мо-ко, не достигнув сефарозы, инактивируется в условиях диализа (т.е. при комнатной температуре).

Связывание протекает с одинаковой эффективностью в аэробных и анаэробных условиях. После насьщения кофактором сефарозу промывают несколько раз указанным буфером, содержащим 1М NaCl. Затем тщательно промьшают дистиллированной водой.

Иммобилизованньй на тиолсефарозе Мо-ко сохраняет 90% активности по отношению к исходному в течение 2 мес., тогда как препарат Мо-ко в растворе(в буфере) инакт 1вируется полностью в течение 10-12 ч даже в анаэробных условиях. Лиофильное высушивание сефарозы с иммобилизованным кофактором и хранение на холоде (4 С) позволяют сохранить активный Мо-ко до 1,5 лет.

Элюция Мо-ко с тиолсефарозой осуществляется 2-меркаптоэтаналом, причем последний легко отделяется от Мо-ко упариванием.

Полученный препарат Мо-ко гомогенен по данным тонкослойной хроматографии в различных условиях, причем значения Rj у полученного предлагаемым и известным способами Мо-ко идентичны. Содержание сульфогидриль- ных групп, фосфата, а также флуоресцентные характеристики полученного Мо-ко не отличаются от соответству- няцих характеристик известного Мо-ко. Эти данные свидетельствуют, что выделенное ор Ганическое соединение яв- ,ляется Мо-ко, представляющим собой производное птерина, содержащее две ; сульфогидрильные и одну фосфатную группы.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет упростить процесс выделения Мо-ко за счет исключения стадий вьщеления белков, содержащих Мо-ко, и стадий дополнительной очистки Мо-ко, а также получить препарат, не содержащий неактивных продуктов деградации Мо-ко и глутатиона.

Формула изобретения Способ получения молибдокофакто- ра, включающий обработку исходного сырья, содержащего связанный с белками молибдокофактор, отщепление мо0097

10

15

либдокофактора от белков, его связывание с тиолсефарозой и элюцию целевого продукта тиолсодержащими соединениями, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целевого продукта, в качестве исходного сырья используют пшеничные отруби, которые обрабатьшают буферные раствором и полученный экстракт обессоливают, отщепление молибдокофактора от белков осуществляют обработкой додецил- сульфатом натрия или мочевиной, а элюцию целевого продукта проводят раствором 2-меркаптоэтанола.