Способ стимуляции нейросекреторных клеток гипоталамуса в эксперименте Советский патент 1993 года по МПК A61K31/04 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины. Известно, что продуцируемый нейросекреторными клетками суп- раоптического ядра окситоци н, выделяясь в кровь, стимулирует сокращения матки и способствует выведению молока у лакти- рующих животных и человека. Высвобождение окситоцина обеспечивается воздействием ацетилхолина в области аксо- вазальных контактов, но тормозится при воздействии ацетилхолина в области тел нейронов на уровне гипоталамуса. Таким образом, регуляция высвобождения окситоцина может быть осуществлена за счет избирательного накопления ацетилхолина на разных уровнях нейросекреторного процесса, Решение данной задачи облегчается тем, что организация ядер гипоталамуса обеспечивает размещение различных частей нейросекреторного механизма в разных отделах мозга.

Целью данного изобретения явилось увеличение эффективности стимуляции и предупреждения тормозного действия ацетилхолина непосредственно на тела нервных клеток. Поставленная цель достигается тем что в известном способе применяются антихолинэстеразные препараты типа Прозерин, а предлагаемом способе использовался гексаметилен-бис 311-метил- карбаминовой кислоты-2-/2-диметил- . аминометил пиридинового эфира, далее условно называемого дистагмин. Название ; связано с тем, что молекула данного сое- i Динения представляет собой сдвоенную молекулу фармакопейного препарата Ами- ностигмин.

Изобретение соответствует критерию новизна, поскольку ho сравнению с прототипом у предлагаемого для стимуляции выведения окситоцина соединения существенно иная химическая формула.

Изобретение соответствует критерию существенные отличия, поскольку использование антихолинэстеразного средства иной структуры придало заявляемому феномену новые свойства: освобождение окситоцина стало более стабильным в результате меньшей проницаемости предлагаемого соединения через ГЭБ, менее опасным, поел

С

00

00

CJ

скольку его токсичность при сохранении ан- тихолинэстеразной активности на том же уровни резко снизилась.

Возможность достижения желаемого эффекта доказывается следующими приме- рами ..... .

Пример 1. Антихолйнэстерэзная активность.

Антихолйнэстеразную активность определяли в опытах ин витро. Как заявляемое соединение, так и прототип прозерин относятся к группе обратимых ингибиторов хо- линэстеразы и их взаимодействие с ферментом проходит по единой схеме, в которой на первом этапе электроэквивален- тное взаимодействие участников реакций определяется константой сродства - Ка, а на втором «- карбамилированиё фермента остатком карбаминовой кислоты - константа карбамилирования - К2. Суммарная би- молекулярная крнстанта Ка, определяет общую ингибирующую способность препарата, KpHctaHTH определяли графически по методу Прозоровского и соавт. (Фармакол. итоксикол. 1978, Т.22, Ns 4, 1035-1037). В качестве фермента использовали очищенную ацётилхолинэстеразу эритроцитов человека с удельной активностью 1,2-1,9 Е /мг. Скорость гидролиза ацетилхр- лина определяли методом непрерывного потёнцйометрйческого титрования на авто- титраторе ТТТИс фирмы Radiometer при постоянной величине рН 7,4. Растворьт изучаемых веществ в различных концентрациях прибавляли к ацетилхолинэстера е. Смесь инкубировали при постоянной температуре 37,40С. Регистрировали скорость гидролиза в интервале 1-6 мин. Найденные значения коэффициентов, характеризующих реакцию фермента с ацетияхолином в присутствии ингибиторов приведены в табл.1. -... -; .- , . .... .... / /:.-.: . ..; :. ...

Пример 2. Токсические дозы для животных.v

О токсическом действии заявляемого соединения и .прототипа судили по величине летальных и токсических доз, которые определяли экспресс-методом В.Б.Прозр- ровского и соавт .{Фармакол, и токсикол.). Полученные результаты приведены в табл.2.

Согласно данным таблицы заявляемое соединение в 84-32 раза менее токсичен по летальным дозам и в 100-430 раз по дозам токсическим. Существенно/что у кошек различия в токсичности выражены сильнее, чем у грызунов. Существенное возрастание разницы между препаратами при оценке по токсическим эффектам связано с более выраженным мышечным (фасцикуляторным) свойствам прозерина. Большее сродство

прозерина к холинореактивным .системам мышцы по сравнению с заявляемым соединением определяется наличием в составе его молекулы четвертичного азота.

Отношение летальных доз при в/в введении к в/ц для заявляемого соединения составляет 2,3, а для прозерина 1,4, что свидетельствует о меньшей разнице доз для прототипа, следовательно, большей его способности проникать через ГЭБ.

Отношение доз, вызывающих токсические центральные эффекты, к дозам, вызывающим токсические периферические эффекты у прототипа в 1,7-4,0 раза больше, чем у заявляемого соединения. Эти данные Свидетельствуют о том, что при попытке получить центральный эффект возникающие от малых доз периферические эффекты прототипа будут мешать его практическому . применению.. V -.-:

Выводы из примера 2: Заявляемое соединение менее токсично/чем прототип, оно хуже проникает через ГЭБ и не обладает высоким сродством к нервно-мышечным синапсам, в результате чего его побочное периферическое действие проявляется в меньшей степени. х ;;::у ;

При we р3. Состояние нейросекрётор- ных клеток сугтраоптического ядра (СОЯ) ги- поталамуса. .- ; . :. : -; / :... .-..-. ;

Результаты морфометрического анализа отражающего значения функционального состояния клеток СОЯ, вполне определено говорят о стимуляций секреторного процесса в случае действия дистагми- на и подавлении реакции при действии пррзерина. Примечательно, что действие высоких доз бизерина приводит к снижению эффекта знтйхолинэстеразного действия и вполне очевидно, в этой сверхвысокой дозировке его действие опосредуется на уровне лежащих за гематоэн цефаяическйм барьером образований гипоталамуса.

Морфологический анализ проводили на крысах весом 200-250 г. ВнутрйбрюшИнно крысам зах

заябляёмоё вещество дистргмин в дозах 1 г/кг, 5-Ю43 г/кг,1 г/кг. Через 40 мин после введения ингибиторов геоли- нэстераз крысы декопитировались и фрагменты головного мозга фиксировали в жидкости Буэна. Серийные фронтальные среды мозга толщиной 5 мкм окрашивали параальдегидфуксином с докрэской азркар- мином по Гомори-Гобу, На гистологических препаратах опытных и контрольных (с введением плацебо), определяли объем ядер и тела нейросекреторных клеток по формуле:

:рысам вводили: прозерин (прототип) в др- iax 1 г/кг; 1 г/кг, г/кг и

VЯАБ

используемой для структур, приближающихся к эллипсоидам вращения, где: V ..- объем ядра, А - больший и Б - меньший диаметры.

Наличие связи клеточного метаболизма и изменениями объема нейросекреторных клеток мы связываем с поступлением в клетки осмотически активных веществ - сажа- ров,

Транспорт Сахаров определяли по входу неутилизируемого сахара Д-ксилозы, являющегося аналогом глюкозы. Фрагменты гипоталамуса инкубировали в среде, содержащей 0,5 % растворы Д-ксилозы и сахарозы. Ткань гипоталамуса обсушивали, кипятили в дистиллированной воде и в без- .белковом экстракте определяли Д-ксилозу по методу Роя и Раиса (Roe, Rice, 1948). Вход сахара рассчитывали, как разность между ксйлозным и сахарозным пространством. ... ; . -- : / .. х г.. ...- .

Особенностью этой части работы явилось то что фрагменты гипоталамуса, содержащие суп раоптйчес кое ядро, получали от взрослых животных и инкубировали во влажной камере. Применение переживающей культуры фрагментов гипоталамуса требует обоснования некоторых функциональных характеристик. Цитоархитектони- ка лереднетипоталамйческой области такова, что при выделений супраоптическо- го ядра неизбежно перерезаются аксоны, составляющие гипоталамо-гипофйзарный тракт, и это может являться причиной серьезных нарушений деятельности нейросекреторных клеток, поскольку выпадает значительная часть функционально обусловленных процессов,

Однако, проведенные в нашей лаборатории эксперименты показали, что в течение 3-4 ч в культуре ткани переднего гипоталамуса не наблюдается некротических изменений, а эксплантаты обладают способностью синтезировать и выделять в среду белки. Значительно меньший выход белка в среду наблюдали при температуре инкубации 4°С. Можно думать, что гибели самих нейронов не происходит. В среде, содержащей нормальное количество Са , возможно образование мембраноподобных поверхностей и эалечивание культи аксона (Lumsden, 1970; Moss eta., 1974; Obata, 1974). Остается невыясненным механизм выделения белка в среду из эксплантатов, однако наличие ритмичности в этом процессе (Коваленко, 1981: Загустина, 1981; Грачев

и др., 1981) позволяет допустить возможность экзоцйтоподобных процессов. В целом, несмотря на незавершенность исследования характеристик переживаю- 5 щей культуры фрагментов гипоталамуса, этот методический подход представляет определенный интерес при изучении некоторых особенностей нейросекреторных образований. К достоинствам переживаю0 щей культуры фрагментов гипоталамуса можно отнести: а) отсутствие экстрагипота- ламических влияний; б) возможность контроля за состоянием среды инкубации; в) точная дозировка физиологически активных

5 веществ; г) возможность биохимического исследования эксплантатов и продукта, выделенного в среду; д) возможность проведения различного рода морфологических, морфометрических и других работ, сущест0 венно дополняющих информацию о деятельности нейросекреторных образований. Как показали наши исследования (Грачев, Скопичев, Пруцков, Коваленко, 1987), проведенные на фрагментах переднего ги5 поталамуса, происходит выход белка в среду инкубации, причем минимальное значение приходились на период с 30-й по 40-ю мин. опыта. Морфометрия нейросекреторных клеток и их ядер выявила синхронные

0 изменения, выражающиеся в первичном набухании и последующем уменьшений объема клеток и ядер. Следует отметить, что выделение белка в среду несколько опережает изменение клеточного объема.

5 Содержание Д-ксилозы в клетках супра- оптического ядра под непосредственным влиянием ацетйлхолина снизилось на 26%, что свидетельствует о существенных изменениях мембранно-транспортных

0 процессов (табл.3). Следовательно, можно говорить о четкой взаимозависимости процессов биосинтеза белка, трансмембранного транспорта Сахаров:

Наряду с этим мы сопоставили измёне5 ния объемов нейронов культуры клеток суп- раоптического ядра и уровень белкового синтеза. Используя в качестве меченого предшественника 3Н-лейцин, мы смогли одновременно оценить интенсивность

0 включения метки и размеры клеток. Сопоставление данных авторадиографии и мор- фометрии позволяет отметить чёткое соответствие изменений объемов клеток и количества гранул серебра над этими клет5 ками. Реакция на ацетилхолин, приводящая к уменьшению объема клеток, сопровождается значительным уменьшением включения 3Н-лейци«а. Оценивая результаты этого опыта, мы отметили высокую степень корреляции между изменением объема и интенсивность включения метки при инкубации культуры без физиологических воздействий (г ±0,98; Р 0,01) и при действии ацетилхолина (Я - ±0,96; Р 0.01). Все это указывает на функционально-метаболи- ческие изменения в нейросекреторных клетках.

Результаты данного опыта позволяют использовать для направленного воздействия на нейросекреторные клетки в одном случае негидролизуемый холинэстераза- ми ацетилхолин в гипофизе и стимулировать выделение секрета с последующей активацией всей цепи взаимосвязанных прбцессов секреторного цикла. Действие проникающего через гематсг-энцефалический барьер препарата приводит к изменениям уровня ацетолхолина в супраоптическом ядре и реализации его тормозного действия, Приводящего к уменьшению объема нейро- секреторных клеток.

Вывод из примера 3. Действие заявляемого вещества способно стимулировать нейросекреторную активность нейронов супраоптического ядра, и близкого по архи- тектонике параеентикулярного ядра. Повышение продукции эндогенных нейропептидов (окситоцина и вызопрессйна является необхо- для выполнения нарушенного секреторного процесса в нейросекреторных образованиях гипоталамуса.

Технико-экономическая эффективность. : . -.. .; .. ; .. ./...- ;-

Большое число функционально-морфологических исследований, проведенных на нейросекреторных клеток гипоталамуса, позволило выявить и подробно - описать цитофизиологические реакции нейросёкре- fopWbfx клеток при активации и подавлений секреторного процесса (Поленов, 1968, 1981). По Данным авторадиографического анализа, включение меченых предшественников РНК, процесс интенсификации белкового синтеза предваряется усилением

метаболизма нуклеиновых кислот (Голу- бицина, 1977). В нашем исследовании, проведенном в модельных условиях, нас интересовала сопоставимость клеточных реакций и морфометрических показателей культивируемой ткани с состоянием нейросекреторных образований интэктного мозга. Одним из наиболее широко применяемых показателей в большинстве исследований является величина (объем) нейросекреторных клеток (Абдулходжаева и др., 1975; Степанова, 1987). Очень важными для анализа деятельности нейросекреторных клеток оказались индивидуальные реакции клеток, непосредственно связанные с особенностями метаболических процессов.

Результаты применения заявляемого вещества дистагмина показали, что для стимуляции нейросекреторных клеток можно использовать действие ацетилхолина в гипофизе. Влияние проникающего через ге- мато-энцефаличеекий барьер ripe парата (прототипа) приводит к изменениям количества ацетилхолина на уровне супраоптиче- ского ядра, в результате чего уменьшается объем нейросекреторных клеток.

Восстановление продукции нейропептидов: окситоцина и вэзопресси на необходимо для лечения различных заболеваний, связанных с недостаточной их секрецией: атония матки и слабость родовой дейтельности, гйпбгалактия. амнезия и алкоголизм.

Формул а йзобрeteни я

Способ стимуляции нейросекреторных клеток гипоталамуса в эксперименте путем введения антйхолиностёразных препаратов, от л и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения эффективности воздействия, вводят гексаметилен-бис311-метилкарбо- миновой киелоты-2-2-диметиламинрметил пиридинового эфира в дозе 1.-108 г на 1 кг массы тела.

Изобретение относится к области экспериментальной медицины. Способ позволяет повысить эффективность стимуляции. Для этого вводят дистагмин в дозе 1 г/кг массы тела.3 табл.

KoricfaftTbj, характеризующие кинетику взаимодействия заявляемого соединения и прототипа с ацетилхолинэстеразой

Таблица 1

Таблица 2

Средние летальные и токсическиеi дозы, заявляемого соединения и прототипа в опытах на животных разных видов при разных путях введения препаратов

Примечание: в/ц - внутрицистернально, в/ж - внутрижелудочно по нарушению рефлексов - имеются ввиду безусловный рефлекс избегания удара током.

: -: - .-.-: ;.: ; :. . :. ;;;. : ::. . : -- ,- :-:- -:;. .-.Т а б л и ц. а 3

Содержание Сахаров мг % в ткани гипоталамуса (в опытах использованы V: rnnotanaMycu от 203 крыс)