ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ И ВОССТАНАВЛИВАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬ К ОБУЧЕНИЮ И ФОРМИРОВАНИЮ ПАМЯТИ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕГО ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C07K5/37 A61K38/05 A61P25/28 

Группа изобретений относится к фармакологии, а именно к лекарственным средствам, содержащим пептиды и композиции на их основе, а также способам профилактики и/или лечения нарушений нервной системы.

В настоящее время для улучшения работы мозга используют препараты из группы ноотропов – веществ, оказывающих специфическое влияние на высшие интегративные функции мозга, улучшающих память, облегчающих процесс обучения, стимулирующих интеллектуальную деятельность и повышающих устойчивость мозга к повреждающим факторам. К ноотропным препаратам относятся пирацетам, его гомологи и аналоги (анирацетам, оксирацетам, прамирсцетам, нефирацетам, ноотропил, луцетам); ноопепт; биотредин; анвифен (фенибут, ноофен) и другие [Справочник лекарственных средств VIDAL (рег. №: № ФС77-79153 от 15.09.20) http://www.vidal.ru/]. До настоящего времени механизм действия пирацетама, его гомологов, аналогов и других ноотропных средств недостаточно изучен.

Пирацетам (анирацетам, оксирацетам, прамирсцетам, нефирацетам, ноотропил, луцетам) является первым синтезированным ноотропным препаратом, он воздействует на ЦНС и улучшает метаболические процессы мозга. Имеет широкий спектр показаний, среди которых можно выделить: нарушение активности и внимания; проблемы обучаемости (расстройства памяти); синдром алкогольной зависимости; тревожные и депрессивные состояния. Тем не менее, для наступления эффекта препарата требуется длительный прием. Существенный недостаток пирацетама – снижение вязкости крови, поэтому препарат противопоказан при нарушениях системы крови и тяжелых кровотечениях. Может наблюдаться синдром отмены. Запрещен к приему при заболеваниях почек.

Биотредин – комплексный препарат, в состав которого входят витамин B6 и аминокислота L-треонин, предшественник глицина. Этот препарат относится к тонизирующим и общеукрепляющим средствам, уменьшает психоэмоциональное напряжение, улучшает память, повышает работоспособность. При приеме препарата могут отмечаться головокружения и аллергические реакции. Противопоказан при одновременном приеме совместно с антидепрессантами и нейролептиками и в состоянии алкогольного опьянения.

Анвифен (фенибут, ноофен) – в состав входит аминофенилмасляная кислота, препарат показан для устранения напряженности, беспокойства, тревоги; повышения работоспособности; улучшения внимания, памяти. Анвифен с осторожностью применяется при поражениях ЖКТ и почечной недостаточности. При передозировке наблюдаются тошнота и головокружение.

Польза ноотропных препаратов заключается в улучшении мозгового кровоснабжения, но данные средства не являются полностью безопасными. У лекарств этой группы есть ряд противопоказаний: гиперчувствительность к компонентам; наличие хронических заболеваний; беременность и период лактации; многие ноотропы противопоказаны при эпилепсии.

При нарушении дозировки, режима приема или при выборе неподходящего препарата могут возникать побочные эффекты, которые ухудшают имеющуюся симптоматику и провоцируют новые расстройства: бессонница, лабильность артериального давления, аллергические реакции, головная боль, возбуждение и чрезмерная нервозность, диспепсия, отдышка. В связи с этим поиск новых эффективных и безопасных средств, обладающих нейростимулирующей активностью и восстанавливающих способность к обучению и формированию памяти обладает актуальностью.

Известны ноотропные препараты пептидной природы, в частности, из патента РФ № 2119496 известен этиловый эфир N–фенилацетил – L– пролилглицина, являющийся действующим веществом препарата Ноопепт. Действие препарата Ноопепт заключается в повышении устойчивости мозговой ткани к повреждающим факторам. Показания к применению: улучшение способности к обучению; улучшение памяти; улучшение внимания. При приеме ноопепта возникает меньше побочных эффектов, чем при действии пирацетама. Тем не менее ноопепт противопоказан при дефиците лактазы, выраженных нарушениях функции печени и/или почек, а также в возрасте до 18 лет.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи расширения арсенала ноотропных средств, получения средства пептидной природы, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти.

Задача решена путем применения в качестве средства, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти, дипептида формулы Н-Glu(Ala)-OH.

Дипептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Ранее неизвестное свойство дипептида H-Glu(Ala)-OH стимулировать пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, а также восстанавливать способность к обучению и формированию памяти выявлено при его экспериментальном изучении.

Согласно изобретению, предлагается лекарственное средство, способное стимулировать пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающее стимулирующим действием на высшую ассоциативную деятельность и восстанавливающее способность к обучению и формированию памяти, которое содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество дипептида в качестве активного начала, представляющего собой соединение γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) или его химические модификации (например, в виде солей и других производных).

Понятие «лекарственное средство», используемое в данной заявке, подразумевает использование любой лекарственной формы, содержащей различные фармацевтические производные дипептида, которые обладают терапевтическим эффектом, для лечения нейродегенеративных заболеваний и когнитивных нарушений различной этиологии, при которых необходима стимуляция регенерации нервной ткани и активация дифференцировки нейронов.

Понятие «эффективное количество», используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной препаративной форме.

Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению, предлагаемый дипептид или его фармацевтически приемлемые производные смешиваются как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования [см., например, Гаврилов А.С. Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов / А.С. Гаврилов - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 760 с.; Краснюк И.И. Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм: учебник / И. И. Краснюк, Г. В. Михайлова, Л. И. Мурадова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 560 с.; Технология изготовления лекарственных форм: учебник / В. А. Гроссман - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 336 с.0; Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов [Электронный ресурс]: учеб. пособие / Лойд В. Аллен, А. С. Гаврилов - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 512 с.; Контроль качества лекарственных средств [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Т. В. Плетенёвой - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 560 с.; Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм [Электронный ресурс]: учебник / И. И. Краснюк, Г. В. Михайлова, Л. И. Мурадова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 560 с.].

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм, например, парентерального, интраназального, перорального или местного (например, в виде аппликаций, мази).

При изготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для перорального или местного применения могут использоваться любые известные фармацевтические компоненты.

Для парентерального (интраназального) введения носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности или для сохранения стерильности.

Согласно изобретению, дипептид активен при введении его в дозах 0,1-100 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от степени тяжести и характера течения заболевания.

Заявляемое лекарственное средство предлагается для парентерального, интраназального, перорального и местного применения.

Изобретение включает способ стимуляции процессов пролиферации клеток нервной ткани и активации дифференцировки нейронов у человека или животного, нуждающихся в такой стимуляции, а также охватывает фармацевтические композиции для осуществления этого способа. Согласно изобретению способ стимуляции процессов регенерации нервной ткани путем введения лекарственного средства, содержащего в качестве активного начала дипептид формулы γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) или его химические модификации в виде солей и других производных, проявляется в активации пролиферации и дифференцировки клеток нервной ткани, нейропротекторном действии, восстановлении условно-рефлекторной деятельности нервной системы, способности к обучению и формированию памяти. Способ включает профилактическое или лечебное введение субъекту, нуждающемуся в этом, заявляемого лекарственного средства в дозах 0,1–10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день при внутримышечном введении, 1–10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день при интраназальном введении и 10–100 мкг/кг массы тела по крайней мере два раза в день при пероральном введении в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта – не менее 30 дней, в зависимости от характера течения и тяжести заболевания.

Изобретение предназначено для профилактики и/или лечения когнитивных нарушений, нейродегенеративных заболеваний, послеоперационных осложнений в виде нарушения интеллектуальной функции головного мозга, трофических нарушений в головном мозге, обусловленных ишемическими процессами, различных других патологий нервной системы, при которых необходима стимуляция регенерации нервной ткани посредством активации пролиферативного потенциала клеток нервной ткани и стимуляции процесса их дифференцировки.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза дипептида формулы γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) (пример 1), примером испытания токсичности (пример 2), примерами изучения биологической активности дипептида в условиях in vitro и in vivo (примеры 3, 4, 5, 6, 7, 8), примером изучения эффективности применения фармацевтической композиции на основе дипептида формулы γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH) у пожилых мужчин с нарушением памяти (пример 9).

Пример 1. Синтез дипептида γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH).

1.1. Название: γ-глутамил-аланин

1.2. Структурная формула: H-Glu(Ala)-OH

1.3. Брутто-формула: C₈H₁₄N₂O₅

1.4. Молекулярный вес без противоиона: 218,21

1.5. Противоион – ацетат

1.6. Внешний вид: белый порошок без запаха.

1.7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:

1.8. Характеристика продукта

– Растворимость: растворим в воде, изотоническом растворе хлорида натрия 0,9 % для инъекций; нерастворим в спирте 95 %, хлороформе, эфире и других органических растворителях.

– Прозрачность и цветность раствора: раствор 0,05 г препарата в 10 мл воды прозрачен и бесцветен.

– рН 0,001 % раствора: 4,0–5,0 (потенциометрически).

– Содержание влаги: не более 10 %.

– Удельное оптическое вращение: [α]_D²²: от -31 ° до -33 ° (c=1, H₂O).

– Содержание основного вещества по ВЭЖХ: не менее 97 %.

– Тонкослойная хроматография: ТСХ-индивидуален, R_{f =} 0,80 (ацетонитрил-вода 1:3).

1.9. Схема синтеза пептида

1) Z-Glu(OSu)-OH (I), γ-N-оксисукцинимидный эфир N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-глутаминовой кислоты

6,2 ммоль мелкоизмельченного порошка N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-глутаминовой кислоты растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляют 0,71 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка N-оксисукцинимида. 1,27 г (6,2 ммоль) порошка N,N'-дициклогексилкарбодиимида растворяют в 20 мл диметилформамида. Оба раствора охлаждают до температуры –15 °С. Растворы объединяют и перемешивают при охлаждении льдом в течение 24 часов. Полученный раствор активированного эфира используют на следующей стадии.

2) Z-Glu(Ala-OBzl)-OBzl (II), α-бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(γ-аланилбензилат)-глутаминовой кислоты.

К раствору активированного эфира Z-Glu(OSu)-OBzl (I), полученного на предыдущей стадии, добавляют 1,34 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка тозилата бензилового эфира аланина и 0,86 мл триэтиламина. Перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем в реакционную смесь при перемешивании постепенно вливают 150 мл 2н раствора серной кислоты, продукт выпадает в виде масла, который затем растворяют в 50 мл этилацетата.

Затем содержимое реакционной колбы расслаивают в делительной воронке, нижнюю водную фазу сливают в стакан вместимостью 250 мл, а верхнюю органическую фазу – в стакан вместимостью 500 мл. Процедуру повторяют трижды с новыми порциями этилацетата (по 30 мл), затем все этилацетатные порции объединяют в исходной делительной воронке, в которую добавляют 20 мл 2 н раствора серной кислоты и осуществляют экстракцию, повторяя процедуру дважды. Затем этилацетатный раствор промывают последовательно водой (30 мл), дважды раствором бикарбоната натрия (30 мл), дважды раствором серной кислоты (30 мл) и водой (30 мл). Затем в этилацетатный раствор добавляют около 20 мг безводного сульфата натрия и оставляют на 10–12 часов.

Отфильтрованный этилацетатный раствор упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С на вакуумном роторном испарителе (Buchi Rotavapor R-114 или аналогичном) до прекращения отгонки растворителя и образования на дне колбы густого сиропа, который растворяют в 20 мл этилацетата, добавляя к раствору при постоянном перемешивании порциями гексан до появления устойчивой мути (около 20 мл). Колбу с полученной мутной системой оставляют в холодильнике при температуре 4 °С в течение не менее 2 суток для завершения процесса кристаллизации.

Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают под вакуумом через пористый фильтр Шота, 2 раза промывают гексаном (5 мл), далее продукт переносят в чашку Петри без крышки. Окончательно продукт высушивают над пятиокисью фосфора в вакууме при температуре не выше 40 °С до постоянного веса.

3) H-Glu(Ala)-OH (III), γ-глутамил-аланин

α-Бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(γ-аланилбензилат)-глутаминовой кислоты, полученный на предыдущей стадии, растворяют в смеси метанола (60 мл), дистиллированной воды (20 мл) и уксусной кислоты (20 мл) в присутствии 3 мл катализатора палладия на угле (Pd/C).

Контроль за полнотой деблокирования проводят в режиме ТСХ на пластинках Silufol в системе бензол-ацетон (2:1), деблокированный продукт имеет нулевую подвижность, исходный продукт имеет R_f=0,75. Реакция деблокирования считается законченной, если имеются только следовые количества исходного продукта (визуально).

Объединенный фильтрат упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С.

Для очистки 315 мг препарата растворяют в 4 мл 0,01 % трифторуксусной кислоты и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250мм Diasorb-130-C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Solvent Module,168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования - А: 0,1 % трифторуксусная кислота; В: 50% раствор ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте; градиент В 0→ 5% за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при длине волны 215 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин.

Отбирают фракции основного пика, свободного от примесей (в примерном интервале 54,0 мин. - 66,0 мин.), объединяют их и упаривают в вакууме до образования сиропа, повторяя упаривание ещё 5 раз каждый раз с новой порцией (10 мл) 10% уксусной кислоты. Остаток в колбе сушат в вакууме при температуре не выше 40 °С над твердым КОН в течение не менее 2 суток. После сушки продукт не должен иметь запаха.

После упаривания и сушки в вакууме остаток растворяют в 20 мл деионизованной воды и лиофилизируют.

4) Анализ готового препарата

– Содержание основного вещества определяют методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex C 18 LUNA 4,6×150 мм. A: 0,1 % TFA, B: MeCN; градиент B 0-100 % за 10 мин. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при длине волны 220 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества не менее 97%.

– ТСХ: на хроматограммах образцов, обработанных раствором нингидрина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) фиолетового цвета с совпадающими R_f; на хроматограммах образцов, обработанных раствором бензидина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) темно-синего цвета с совпадающими R_f (ацетонитрил-вода 2:1, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

– Содержание влаги: не более 10% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при температуре 100°C).

– рН 0,01% раствора: от 4,0 до 5,0 (потенциометрически).

– Удельное оптическое вращение: от –31 до –33° в пересчете на сухое вещество (0,1% водный раствор, температура 23°С, D-линия спектра натрия).

Пример 2. Изучение токсичности дипептида γ-глутамил-аланин (H-Glu(Ala)-OH).

Изучение общетоксического действия дипептида H-Glu(Ala)-OH проводилось в соответствии с требованиями «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств», М.: Гриф и К., 2012, 944 с. Цель изучения состояла в определении переносимых токсических доз препарата, оценке степени и характера патологических изменений в различных органах и системах организма и выявлении зависимости токсических эффектов от дозы и длительности применения препарата.

Исследование острой токсичности дипептида H-Glu(Ala)-OH проведено на 100 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-23 г, содержавшихся на стандартном режиме и получавших стандартное питание в условиях вивария. Животные методом простой рандомизации были разделены на 10 равных групп по 10 мышей в каждой. Препарат вводили животным однократно внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) в объеме 0,25 мл в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу (ТД), рекомендуемую для клинического изучения, которая составляет 0,0014 мг/кг). Животным контрольной группы в том же объеме вводился физиологический раствор.

В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.

Таким образом, дипептид H-Glu(Ala)-OH в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций при внутримышечном или внутрижелудочном введении, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.

Хроническую токсичность дипептида H-Glu(Ala)-OH, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам с массой тела 150-250 мг. Животным ежедневно вводили внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) препарат в дозах 0,1 мг/кг (70 ТД), 1,0 мг/кг (700 ТД), 3 мг/кг (2000 ТД) в 0,5 мл физиологического раствора в течение 30 дней. Наблюдение за животными вели в течение 60 дней после начала эксперимента. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось еженедельно. В начале и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Изучение подострой и хронической токсичности дипептида H-Glu(Ala)-OH свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата внутримышечно или внутрижелудочно в дозах, превышающих терапевтическую в 70-2000 раз.

Пример 3. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на развитие эксплантатов подкорковых структур головного мозга крыс.

Органотипическое культивирование ткани подкорковых структур самцов крыс линии Wistаr в возрасте 3 месяцев проводилось по описанной ранее методике [Хавинсон и др., 2012]. В экспериментах использовано 300 фрагментов подкорковых структур, содержащих таламус. Отпрепарированные фрагменты ткани разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм³, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна.

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. Пептид H-Glu(Ala)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].

В процессе культивирования вокруг эксплантатов образовывалась зона роста, состоящая из мигрирующих нейроцитов и пролиферирующих глиальных клеток. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в процентах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.

Установлено, что в органотипических культурах подкорковых структур головного мозга крыс введение в питательную среду для культивирования пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению зоны роста эксплантатов на 60 % по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем действии пептида H-Glu(Ala)-OH в отношении процесса пролиферации клеток подкорковых структур головного мозга.

Пример 4. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на экспрессию транскрипционных факторов в органотипической культуре ткани подкорковых структур головного мозга крыс.

Органотипическое культивирование ткани подкорковых структур головного мозга молодых (3 мес.) и старых (24 мес.) крыс линии Wistаr проводилось по описанной методике [Хавинсон и др., 2012].

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. Пептид H-Glu(Ala)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].

Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела: Pax6 (1:50, Dako), CXCL12 (1:50, Dako). Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Указанный параметр отражает интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.

Установлено, что в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга молодой и старой крыс введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии CXCL12 в 1,3 и 4,1 раза по сравнению с соответствующим контролем. Кроме того, в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга старой крысы введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии Pax6 в 1,6 раза по сравнению с контролем.

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем действии пептида H-Glu(Ala)-OH в отношении процессов дифференцировки и пролиферации нейрональных клеток эпифиза.

Пример 5. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на дифференцировку, пролиферацию и апоптоз клеток в органотипических культурах ткани сетчатки крыс и цыплят.

Органотипическое культивирование ткани сетчатки 10-дневных цыплят и крыс линии Wistаr проводилось по описанной методике [Хавинсон и др., 2012].

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. Пептид H-Glu(Ala)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].

Для иммуноцитохимического исследования использовали первичные моноклональные антитела: Brn3 (1:50, Dako), Marth5 (1:50, Dako), Pax6 (1:50, Dako), Math1 (1:50, Dako), Prox1 (1:50, Dako), TTR (1:50, Dako), Ki67 (1:50, Dako). Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование. Относительную площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения, и выражали в процентах. Указанный параметр отражает интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.

Установлено, что в органотипических культурах ткани сетчатки цыплят введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии Brn3 в 2,5 раза, Рах6 – в 1,2 раза, Math1– в 3,6 раза, TTR – в 1,7 раза, Prox1 – в 1,8 раза. Кроме того, в органотипических культурах ткани сетчатки цыплят введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии маркера пролиферации Ki67 в 2,6 раза по сравнению с контролем.

Введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому снижению площади экспрессии маркера апоптоза p53 в органотипических культурах ткани сетчатки крыс в 1,5 раза по сравнению с контролем. Кроме того, в органотипических культурах ткани сетчатки крыс введение пептида H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению площади экспрессии маркера опосредованной пролиферации CXCL12 в 1,9 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, пептид H-Glu(Ala)-OH стимулирует экспрессию ключевых белков, участвующих в дифференцировке нейрональных клеток сетчатки. Установлено, что пептид H-Glu(Ala)-OH стимулирует дифференцировку тканей сетчатки в направлении ганглиозных нейронов (повышение экспрессии маркеров Brn3, Prox1), амакринных клеток (повышение экспрессии маркеров Math1, Prox1) и клеток пигментного эпителия (повышение экспрессии белка ТТR), а так же усиливает экспрессию маркера ранней дифференцировки клеток сетчатки Pax6. Кроме того, пептид H-Glu(Ala)-OH способствует активации процессов пролиферации и снижению апоптоза клеток сетчатки in vitro.

Пример 6. Цитопротекторное влияние пептида H-Glu(Ala)-OH в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга крыс при действии цитостатика циклофосфана.

Органотипическое культивирование тканей подкорковых структур головного мозга самцов крыс линии Wistаr в возрасте 3 месяцев проводилось по описанной методике [Хавинсон и др., 2012]. Отпрепарированные фрагменты ткани разделяли на более мелкие части величиной около 1 мм³, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна.

В исследовании использовалась среда с pH 7,2 из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40% - 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. Эксплантаты помещались в чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и культивировались в 3 мл питательной среды указанного состава. 1 группа являлась контрольной, в культуры 2 группы добавляли циклофосфан в концентрации 2 мг/мл, в культуры 3 группы добавляли одновременно циклофосфан в концентрации 2 мг/мл и пептид H-Glu(Ala)-OH в концентрации 0,05 нг/мл. Эксплантаты экспериментальных и контрольной групп развивались в одинаковых объёмах питательной среды. Продолжительность культивирования составляла трое суток, такой временной интервал является необходимым и достаточным для формирования полноценной зоны роста [Чалисова Н.И. и др., 2005].

В процессе культивирования вокруг эксплантатов образовывалась зона роста, состоящая из мигрирующих нейроцитов и пролиферирующих глиальных клеток. Определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в процентах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для расчета ИП эксплантатов использовали программу PhotoM 1.2. Статистическая обработка экспериментальных данных проводилась в программе Statistica 6.0. Были использованы статистические критерии Шапиро-Уилка, Крускала–Уоллиса и Манна-Уитни. Критический уровень статистической значимости нулевой гипотезы (об отсутствии различий) принимали равным 0,05.

Установлено, что в органотипических культурах тканей подкорковых структур головного мозга крыс введение цитостатика циклофосфана приводило к статистически значимому снижению зоны роста эксплантатов в 0,85 раза по сравнению с контролем, при одновременном введении цитостатика циклофосфана с пептидом H-Glu(Ala)-OH приводило к статистически значимому увеличению зоны роста эксплантатов в 1,3 раза по сравнению с контролем.

Таким образом угнетающее влияние цитостатика циклофосфана на ткань подкорковых структур головного мозга крыс нивелировалось при одновременном добавлении пептида H-Glu(Ala)-OH, из чего следует, пептид H-Glu(Ala)-OH обладает цитопротекторным действием в отношении клеток подкорковых структур головного мозга.

Пример 7. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на условно-рефлекторную деятельность пчел Apis mellifera carnica Pollm.

В поведенческих опытах с насекомыми объектом исследования служила медоносная пчела краинской расы Apis mellifera carnica Pollm в возрасте 10-40 дней [Лопатина и др., 2002, 2010]. Для изучения условно-рефлекторной деятельности пчел оценивали образование пищевого условного рефлекса вытягивания хоботка на обонятельный раздражитель (PER). У фиксированных за крылья пчел вырабатывали условный рефлекс вытягивания хоботка путем однократного сочетания запаха гвоздики и пищевого подкрепления – 50% раствора сахарозы. Через 1 мин (КП - кратковременная память) и 180 мин (ДП - долговременная память) по окончании процедуры обучения у пчел проверяли наличие условной реакции на запах. До обучения у пчел оценивали сенсорную возбудимость – наличие спонтанной реакции вытягивания хоботка на еще неподкрепленный запах (при наличии таковой пчел выбраковывали) и пищевую возбудимость – вытягивание хоботка в ответ на соприкосновение раствора сахарозы с антеннами (вкусовая рецепция) (в отсутствие таковой пчел выбраковывали). За 3 ч до процедуры обучения пчел изолировали, лишая их пищи и контакта с семьей, для повышения пищевой мотивации. Фоновой условно-рефлекторный уровень определяли, как количество пчел, сохраняющих в памяти условную реакцию в контрольной группе (инъекции физиологического раствора), и выражали в процентах. За 30 мин до обучения пчелам дорзально в торакс делали инъекции 2 мкл раствора пептида H-Glu(Ala)-OH в концентрациях 10^-7М и 10^-6М (опыт) или 2 мкл физиологического раствора (контроль). В каждой серии экспериментов использовали 60 пчел. Число пчел, ответивших условной реакцией, оценивали в процентах по отношению к контрольному уровню (принятому за 100%).

Установлено, что пептид H-Glu(Ala)-OH в концентрации 10^-6М повышал КП на 47% по сравнению с контролем. Кроме того, пептид H-Glu(Ala)-OH в концентрации 10^-7М повышал ДП на 35% по сравнению с контролем. Более чувствительной к действию дипептида оказалась ДП, так как эффект достигался при введении меньшей концентрации.

Таким образом пептид H-Glu(Ala)-OH обладает стимулирующим действием на высшую ассоциативную деятельность насекомых.

Пример 8. Влияние пептида H-Glu(Ala)-OH на обучение и формирование памяти у дрозофил agnts3 (модель болезни Паркинсона).

В работе использовали линии Drosophila melanogaster: canton-S (CS) - линия дикого типа (контрольные нормальные организмы) и мутантная линия agn^ts3. Локус agnostic был обнаружен при целенаправленном скрининге мутаций, индуцированных этилметансульфонатом в линии CS, несет температурочувствительную (ts) мутацию по гену limk1, который кодирует ключевой фермент ремоделирования актина LIMK1. Мух выращивали в стаканчиках объемом 160 мл на стандартной изюмно-дрожжевой среде при температуре +25^оС±0,5°С, 60% влажности и свето-темновом цикле 12:12 ч. Тестирование пептида проводили через 15 сут у 5-суточных имаго. Развитие дрозофилы от стадии яйца до стадии окукливания происходило на питательной среде с пептидом H-Glu(Ala)-OH. Пептид применяли в концентрации 0,05 мкг/мл. Вылетающих на 10 сут развития из куколки мух содержали до тестирования в течение 5 сут на среде без пептида H-Glu(Ala)-OH.

При анализе когнитивного поведения дрозофилы использовали метод условно–рефлекторного подавления ухаживания [Kamyshev et al., 1999]. Отбирали самцов исследуемых линий и содержали их индивидуально. В качестве объектов ухаживания для самцов использовали оплодотворенных за сутки до опыта самок линии CS в возрасте 5 сут. Обучение и тестирование проводили в возрасте 5 сут в специальных экспериментальных камерах.

Для выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания (тренировки) 5-суточного самца, не имеющего опыта полового поведения, помещали в экспериментальную камеру вместе с оплодотворённой 5-суточной самкой CS и оставляли на 30 мин (тренировка).

Оценку способности к обучению и формированию памяти проводили в специальной модели. Обучение тестировали сразу после тренировки, а среднесрочную память – через 3 ч (180 мин) после тренировки, используя новых оплодотворенных самок CS в возрасте 5 сут. В качестве контроля использовали самцов, не имеющих опыта полового поведения.

Этограмму поведения самца регистрировали в течение 300 с, фиксируя время начала отдельных элементов ухаживания (ориентация и преследование, вибрация, лизание, попытка копуляции), а также время исполнения элементов, не связанных с ухаживанием (активность-побежка, прининг, покой). Регистрацию начинали через 45 с после помещения мухи в камеру. В каждой группе тестировали 20 мух. Для расшифровки и анализа данных использовали специально разработанные компьютерные программы.

Для каждого самца вычисляли индекс ухаживания (ИУ), т.е. время ухаживания самца за самкой, выраженное в процентах от общего времени наблюдения. Для количественной оценки результатов обучения вычисляли индекс обучения (ИО) по следующей формуле:

ИО = [(ИУн - ИУт) / ИУн] x 100% = (1 - ИУт / ИУн) x 100%,

где ИУн - средний индекс ухаживания для независимых выборок самцов, не имеющих опыта полового поведения, ИУт - средний индекс ухаживания для независимых выборок самцов, прошедших тренировку [Kamyshev et al., 1999].

При изучении способности к обучению было установлено, что у линии дикого типа CS ИО был равен 95,4±23,6 %, что свидетельствует о нормальном протекании процессов обучения. У мутанта agnts3 (модель болезни Паркинсона) ИО был снижен в 4,75 раз и составил 20,1±5,2 %. При добавлении пептида H-Glu(Ala)-OH в среду, на которой происходило развитие мутанта agnts3, ИО увеличивался в 3,39 раза и составил 68,1±15,3%, что статистически значимо не отличалось от ИО в норме (p<0,05).

При изучении формирования среднесрочной памяти установлено, что у линии дикого типа CS ИО был равен 86,8±21,7 %. У мутанта agnts3 (модель болезни Паркинсона) ИО составил 14,7±3,8 %. При добавлении пептида H-Glu(Ala)-OH в среду, на которой происходило развитие мутанта agnts3, ИО увеличивался в 3,97 раза и составил 58,4±14,5 %, что статистически значимо не отличалось от ИО в норме (p<0,05).

Таким образом, пептид H-Glu(Ala)-OH восстанавливает способность к обучению и формированию памяти у мутантной линии Drosophila melanogaster agnts3 (модель болезни Паркинсона), устраняя дефекты на различных стадиях формирования памяти.

Пример 9 . Влияние фармацевтической композиции на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH на функции памяти у мужчин пожилого возраста

Фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH применяли у 199 мужчин в возрасте 60-74 года (средний возраст 66,1±0,2 года), которые жаловались на снижение памяти. Критерием исключения являлось наличие у обследуемых избыточного веса, никотиновой и/или алкогольной зависимости, а также заболеваний мозга и ЦНС. Мужчины методом простой рандомизации были разделены на четыре группы – три основных и контрольную.

Первую основную группу (ОГ-1) составили 56 человек (средний возраст 68,2±0,4 года), применявших фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH в дозах 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-1/1, n=22) или 100,0 мкг пептида на 1 кг массы тела (ОГ-1/2, n=34) перорально по 1 капсуле 2 раза в день ежедневно в течение 30 дней. Во вторую основную группу (ОГ-2) вошло 59 человек (средний возраст 67,4±0,4 года), которые получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH в виде раствора интраназально по 5 капель в каждый носовой ход в дозах 1,0 мкг/кг массы тела (ОГ-2/1, n=17) или 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-2/2, n=42) в день в течение 30 дней. В третью основную группу (ОГ-3) вошло 56 человек (средний возраст 65,8±0,3 года), которые получали фармацевтическую композицию на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH в виде раствора для внутримышечного применения по 1 мл в дозах 0,1 мкг/кг массы тела (ОГ-3/1, n=36) или 10,0 мкг/кг массы тела (ОГ-3/2, n=20) в день в течение 30 дней. Контрольная группа (КГ) состояла из 28 человек (средний возраст 67,1±0,2 года), которые получали в качестве препарата сравнения поливитамины Декамевит^®, предназначенные для лиц пожилого возраста.

Результаты исследования функции памяти у лиц пожилого возраста посредством тестов «Кратковременная зрительная память на числа», «Оперативная память» и «Долговременная память» выявили сходные по выраженности положительные изменения функций памяти в трех основных группах.

Так, после применения фармацевтической композиции на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH кратковременная зрительная память достоверно улучшилась у лиц ОГ-1, ОГ-2 и ОГ-3 по сравнению с показателями в контрольной группе в 1,7, 1,8 и 1,9 раза соответственно во всех трех подгруппах каждой основной группы (р<0,05). Аналогичная тенденция отмечалась и по показателям оперативной памяти: в трех основных группах (и двух подгруппах в каждой группе) показатель улучшился в 1,6, 1,5 и 1,7 раза соответственно по сравнению с показателем после коррекции в контрольной группе (р<0,05). Показатель долговременной памяти имел тенденцию к улучшению, однако отличия в основных группах по сравнению с контрольной группой не были достоверными (р>0,05). Данные представлены в таблице.

Источники информации

Хавинсон В.Х., Линькова Н.С., Проняева В.Е., Чалисова Н.И., Концевая Е.А., Полякова В.О., Кветная Т.В., Кветной И.М., Яковлев Г.М. Методика создания монослоя клеток на базе органотипической культуры для тестирования физиологически активных веществ // Бюл. эксп. биол. мед. – 2012. - №2. – С. 759-763.

Чалисова Н.И., Князькин И.В., Кветной И.М. Нейроиммуноэндокринные механизмы действия пептидов и аминокислот в тканевых культура. Научная серия Молекулярная нейроиммуноэндокринология. - Санкт-Петербург: ДЕАН, 2005. - 125 с.

Лопатина Н.Г., Зачепило Т.Г., Чеснокова Е.Г., Савватеева-Попова Е.В. Поведенческие и молекулярные аспекты дефицита эндогенных кинуренинов у медоносной пчелы Apis mellifera L // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. - 2010. - Т. 60, N 2. - С. 229-235.

Лопатина Н.Г., Рыжова И.В., Чеснокова Е.Г., Зачепило Т.Г., Войке Е. Центральные не-NMDA рецепторы медоносной пчелы в условиях наследственно обусловленного дефицита кинуренинов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. - Т. 135, № 4. - С. 458-460.

Kamyshev N. G., Iliadi K. G., Bragina J. V. Drosophila conditioned courtship: Two ways of testing memory // Learning and Memory. 1999. Vol. 6. № 1. P. 1-20.

Таблица – Влияние фармацевтической композиции на основе дипептида H-Glu(Ala)-OH на показатели функции памяти у мужчин пожилого возраста

Показатель КГ ОГ-1 ОГ-2 ОГ-3 Исходное состояние После коррекции Исходное состояние После коррекции Исходное состояние После коррекции Исходное состояние После коррекции Кратковременная зрительная память на числа, баллы 2,0±0,4 2,1±0,4 ОГ-1/1
2,1±0,3
ОГ-1/2
2,0±0,1 ОГ-1/1
3,6±0,5*#
ОГ-1/2
3,9±0,2*# ОГ-1/1
2,0±0,3
ОГ-1/2
1,8±0,3 ОГ-2/1
3,8±0,4*#
ОГ-2/2
4,1±0,1*# ОГ-1/1
2,1±0,09
ОГ-1/2
1,8±0,4 ОГ-3/1
4,1±0,2*#
ОГ-3/2
4,3±0,1*# Оперативная
память, баллы 10,4±1,1 12,8±1,3 ОГ-1/1
10,1±1,0
ОГ-1/2
9,8±0,8 ОГ-1/1
20,4±1,1*#
ОГ-1/2
21,6±0,8*# ОГ-1/1
10,2±1,4
ОГ-1/2
9,7±1,1 ОГ-2/1
19,6±0,9*#
ОГ-2/2
22,5±0,7*# ОГ-1/1
10,3±1,0
ОГ-1/2
10,0±0,7 ОГ-3/1
21,7±1,2*#
ОГ-3/2
23,4±1,3*# Долговременная
память, баллы 13,2±1,1 13,9±1,3 ОГ-1/1
13,4±1,1
ОГ-1/2
13,0±1,0 ОГ-1/1
15,8±1,3
ОГ-1/2
17,2±1,1*# ОГ-1/1
13,0±1,3
ОГ-1/2
13,2±1,1 ОГ-2/1
16,1±1,0
ОГ-2/2
17,8±0,9*# ОГ-1/1
13,3±1,1
ОГ-1/2
13,1±0,9 ОГ-3/1
15,8±1,2
ОГ-3/2
18,1±1,0*#

* - р<0,05 по сравнению с исходным показателем в данной группе;

# - р<0,05 по сравнению с соответствующим показателем в контрольной группе

Изобретение относится к фармакологии, а именно к лекарственным средствам, содержащим пептиды и композиции на их основе, а также способам профилактики и/или лечения нарушений нервной системы. Предлагается применение пептида γ-глутамил-аланина формулы H-Glu(Ala)-OH в качестве средства, стимулирующего пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти. Также предлагается способ профилактики и/или лечения нервной системы при нейродегенеративных патологиях, при которых необходима стимуляция репаративных процессов в тканях головного мозга и регенерации нейронов, заключающийся во введении γ-глутамил-аланина. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 9 пр.

1. Применение пептида γ-глутамил-аланина формулы H-Glu(Ala)-OH в качестве средства, стимулирующего пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти.

2. Способ профилактики и/или лечения нарушений нервной системы при нейродегенеративных патологиях, при которых необходима стимуляция репаративных процессов в тканях головного мозга и регенерации нейронов, заключающийся в парентеральном, интраназальном или пероральном введении пептида γ-глутамил-аланина формулы H-Glu(Ala)-OH в качестве лекарственного средства, стимулирующего пролиферацию клеток нервной ткани и дифференцировку нейронов, обладающего нейростимулирующей и нейропротекторной активностью, а также восстанавливающего способность к обучению и формированию памяти, при этом при парентеральном введении доза лекарственного средства составляет от 0,1 до 10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день, при интраназальном – от 1 до 10 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день, при пероральном – от 10 до 100 мкг/кг массы тела по крайней мере два раза в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.