Способ получения средства для лечения гнойно-некротических ран Советский патент 1995 года по МПК A61K31/557 A61K47/48 

I

Изобретение относится к медицине, а именно к получению иммобилизованного полиферментного препарата, предназначенного для лечения гнойно-некротических ран.

Целью изобретения является повышение лечебного эффекта средства.

Способ осуществляют следующим образом.

Комплекс ферментов, выделенный из гепатопанкреаса камчатского краба, содержащий ДНК-азу, РНК-азу, щелочную фрсфатазу, фосфодиэстеразу 1 типа, проте- олитические ферменты, иммобилизуют на хитозане. Иммобилизацию проводят путем ковалентного связывания ферментов с хи- тозаном через бифункциональный реагент глутаровый альдегид.

Ферменты из гепатопанкреаса выделяют путем экстрагирования ацетоном или путем высалйвания гемогенизата гепатопанкреаса сульфатом аммония.

Гепатопанкреас камчатского краба гомогенизируют в 8-12-кратном объеме ацетона, охлажденного до 15-20°С, разводят двойным объемом ацетона, осаждают, промывают осадок ацетоном, ресуспендируют в 10 объемах ацетона, центрифугируют при 12000 g в течение 20 мин. Для удаления липидов осадок ресуспендируют в 10 обье- мах н-бутанола, центрифугируют. Для очистки белка от н-бутанола осадок промывают, ацетоном.

Замороженный гепатопанкреас гомогенизируют в 8-кратном объеме 10 мМ фрс- фатного буфера, рН 7,5. Гомогенизат центрифугируют при 12000 g в течение 10 мин. Белок из раствора осаждают 3-4 М рас- етвором сульфата аммония. Осадок отделяют фильтрованием.

Получение средства предусматривает перевод хитозана, используемого в качестве носителя, в гелеобразное состояние, с целью его активирования. Для этого порошок хитозана с М.м. 120000 Д, содержащего 80% свободных аминогрупп, обрабатывают 6Н уксусной кислотой, затем осаждают 6Н NaOH, гель отмывают водой до нейтральной реакции. От избытка воды гель освобождают на фильтре Шотта № 1. Получают 2 %-ный гель.

Для получения средства используется 2 %-ный гель хитозана. В случае, если используется 1 %-ный гель, суспензия носите- ля получается менее пригодной для получения мазевых форм. При концентрации хитозана 3-4% резко увеличивается плотность носителя.

Гель обрабатывают 2 %-ным раствором глутарового альдегида в фосфорном буфере

при рН 7,5, взятых в соотношении 1:1, выдерживают при температуре 18-20°С в течение 30 мин, пропускают через гель хитозана экстракт гепатопанкреаса камчатского краба, содержащего комплекс ферментов: ДНК-азу в количестве 100-120 ед/мг белка, РНК-азу 100-120 ед/мг, щелочную фосфата- зу 0,05--0,Ь7 ед/мг, фосфодиэстеразу 1 типа 0,05-0,06 ед/мг, протеазу 120 ед/мг, предварительно растворенный в фосфатном буфере рН 7,5, при соотношении хито- зан:экстракт 1:2,5-5 (по весу).

Активация хитозана происходит за счет образования альдиминных связей между аминогруппой хитозана и одной активной группой молекулы бифункционального реагента. Свободная активная группа глутарового альдегида связывается с аминной группой фермента. Для активации хитозана используют 2%-ный глутаровый альдегид в соотношении 1:1. Этого количества бифункционального реагента достаточно, чтобы проактивировать всё аминогруппы хитозана.

Использование фосфатного буфера обусловлено тем, что .он не содержит аминогрупп, которые вступали бы во взаимодействие с бифунциональным реагентом. Значение рН, равное 7,5, обусловлено тем, что оптимум рН действия ферментов, содержащихся в экстракте гепатопанкреаса, находится в области рН 7,5. Температура иммобилизации 18-20°С выбрана так, чтобы избежать денатурации ферментов.

Л р и м е р 1. 100 мл 2%-ного геля хитозана обрабатывают 100 мл 2%-ного глутарового альдегида в 50 мМ фосфатного буфера рН 7,5, выдерживают при температуре 18-20 С в течение 30 мин. Наносят гель на фильтр Шотта № 1, промывают его 5 объемами 50 мМ фосфатного буфера рН 7,5.

5 г экстракта из гепатопанкреаса камчатского краба, полученного путем экстрагирования ацетоном, содержащего комплекс ферментов в количестве 100 ед./мгбелка, РНК-азу 100 ед./мг, щелочную фосфатазу 0,07 ед./мг, фосфодизстеразу 1 типа 0,06 ед./мг, протеазу 120 ед./мг, растворяют в 400 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 7,5 и Центрифугируют при 4000 об/мин при 2°С в течение 5 мин. Недостаточную жидкость, содержащую комплекс ферментов, пропускают через гель хитозана и промывают двумя объемами 50 мМ фосфатного буфера рН 7,5. Полученный иммобилизованный полиферментный препарат характеризуется следующими активностями (ед./грамм хитозана): щелочная фосфа- таза - 10, фосфодиэстераза 1 типа - 10,

ДНК-аза -18000, РНК-аза -18000, протеаза -39000.

П р и м е р 2. Обработку хитозана глу- таровым альдегидом осуществляют так, как и в примере 1.

10 г экстракта из гепатопанкреаса камчатского краба (взят тот же экстракт, что и в примере 1) растворяют в 400 мл .10 мМ фосфатного буфера рН 7,5 и центрифугируют при 4000 об/мин при.2°С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость, содержащую комплекс ферментов, пропускают через гель хитозана и промывают двумя объемами 50 мМ фосфатного буфера рН 7,5.

Полученный иммобилизованный пол- иферментный препарат характеризуется следующими активностями (ед./грамм хитозана): щелочная фосфатаз а - 30, фосфоди- эстераза 1 типа - 25, ДНК-аза - 39000, Р.НК-аза - 39000, протеаза - 78000.

ПримерЗ. Обработку хитозана глу- таровым альдегидом осуществляют так же, как и в примерах 1-2.

7 г препарата, полученного путем выса- ливания. гомогенизата гепатопанкреаса камчатского краба сульфатом аммония, содержащего комплекс ферментов: ДНК-азу в количестве 120 ед./мг белка, РНК-азу 120 ед./мг, щелочную фосфатазу 0,05 ед./мг, фосфодиэстеразу 1 типа 0,05 ед./мг, проте- азу 120 ед./мг, растворяют в 400 мл 10 мМ фосфатного буфера рН 7,5 и центрифугируют при 4000 об/мин при 2°С в течение 5 мин. Надосадочную жидкость, содержащую комплекс ферментов, пропускают через гель хитозана и промывают двумя объемами 50 мМ фосфатного буфера рН 7,5. Полученный иммобилизованный полиферментный препарат характеризуется следующими активностями (ед,/грамм,хитозана): щелочная фосфатаза - 14, фосфодиэстераза 1 типа- 14. ДНК-аза - 25200, РНК-аза - 25200, протеаза - 54600.

Полиферментный -препарат, иммобилизованный на хитозане, был испытан для лечения больных-добровольцев с гнойнонекротическими ранами различной этиологии. Критерием оценки эффективности средства был срок очищения раны от гноя и некротизированной ткани.

При применении средства для лечения послеоперационных гнойных ран, уже через 6-8 ч после его нанесения на рану отмечалось очищение раны от обильного гнойного отделяемого, на 2-3 сутки появлялись яркие сочные грануляции, к 5-6 суткам достигалось хорошее очищение раны от обильного гнойного отделяемого, появление краевой и очаговой эпителизации, на 10-15 сутки наступала значительная (до 70-80%) эпители- зация неглубоких ран (размером 5x7 см).

При лечении послеоперационных ран известным препаратом профезимом очищение раны от гнойно-некротического отделяемого происходит, в среднем, за 8 суток. Медленнее протекают репаративные процессы: появление краевой эпителизации наблюдается к 14-17 суткам, значительная эпителизация (до 50%) наступает, в среднем, через 4 недели.

Очищение гнойных ран, вызванных другими патологическими процессами (абсцессы, посттравматические гнойные раны, воспаление мягких тканей в области спиц у больных оперированных по Илизарову) при применении полиферментного препарата, иммобилизованного на хитозане, происходит в большинстве случаев за 3-4 суток. Те же сроки очищения таких ран от гнойно-некротического отделяемого наблюдаются при лечении профезимом. У больных с переломами, остеомиелитом, при лечении полиферментным комплексом, иммобилизованным на хитозане, очищение происходит за 5-6 суток, кроме того, ускоряется секвестрация костной ткани, отхождение секвестров. При лечении этих заболеваний профезимом секвестрации костной ткани не. наблюдается, очищение ран происходит за 14-20 суток.

Иммобилизованный на хитозане полиферментный комплекс был испытан для лечения больных с термическими ожогами 111 А степени и трофическими язвами. После отторжения струпа для эпителизации ожо- говой раны потребовалось 6 перевязок. Перевязки делали через день. При лечении трофических язв полиферментным комплексом, иммобилизованным на хитозане, очищение ран происходит за 5-6 суток.

П р им е р 1. Больной Н. поступил в клинику с диагнозом: открытый перелом большой берцовой кости левой голени. В отделяемом из раны высеяна синегнойная палочка. Проведена иммобилизация перелома гипсовой повязкой и осуществлялись ежедневные перевязки с иммобилизованным на хитозане полиферментным комплексом. Уже после третьей перевязки рана очистилась от некротизированных тканей, появились ро зовые грануляции. На пятые сутки выполнена аутодермопластика. При- живление трансплантатов полное.

Пример 2. Больная Н, оперирована в клинике по методу Ияизарова по поводу ложного сустава голени. В процессе лечения возникло осложнение-воспаление мягких тканей в области спиц. Традиционные методы не подавили воспалительный процесс. Проводились неоднократные замены спиц. Применение полиферментного комплекса, иммобилизованного на хитозане, позволило снять воспалительный процесс и сохранить спицы.

Больная С. находилась в клинике по поводу постинфекционного абсцесса. Проводились перевязки с полиферментным комплексом, иммобилизованным на хитозане. После третьей перевязки гнойная полость очистилась от некротиэированных тканей и рана была подготовлена к наложению вторичных швов.

Таким образом, испытания полиферментного комплекса, иммобилизованного на хитозане, показали большую эффективность его в сравнении с профезимом: ускоряется

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ РАН, включающий иммобилизацию ферментного препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения лечебного эффекта средства, иммобилизацию проводят путем обработки 2%- ного геля хитозана 2%-ным раствором глутарового альдегида в фосфатном буфере при рК 7,5, взятых в соотношении 1:1, выдерживания его при темочищение ран от гноя и некротизированных тканей, сокращаются сроки лечения.

Терапевтическая эффективность иммобилизованного на хитозане полиферментного комплекса обусловлена сочетанным действием ферментов, обладающих различной специфичностью, и носителя, обладающего иммуностимулирующим, антимикробным и коагулирующим действием.

0 Необходимо отметить простоту получения средства, доступность исходного сырья. Хитозан, являющийся продуктом дезацети- лирования природного полисахарида хитина, производится в больших количествах в

промышленности. Источник получения полиферментного комплекса - гепатопанкреас камчатского краба является отходом пере-, работки крабов и доступен в больших количествах.

пературе 18 - 20 С в течение 30 мин, после чего пропускают через гель экстракт гепатопанкреаса камчатского краба, содержащего комплекс ферментов: ДНК-азу в количестве 100.- 120 ед/мг белка, РНК-азу - 100 - 120 ед/мг. щелочную фосфатазу - 0,05 - 0,07 ед/мг, фосфодиэстеразу 1 типа - 0,05 - 0,06 ед/мг и протеазу - 120 кд/мг, предварительно растворенный в фосфатном буфере рН 7,5 при соотношении хито- зин : экстракт 1 : 2,5 - 5 .(по массе).

Использование: в области медицины, в частности при получении препаратов для лечения термических ожогов, трофических язв, инфицированных ран. Сущность изобретения: иммобилизацию ферментного препарата проводят путем обработки 2%-го геля хитозана 2%-ным раствором глутаро- вого альдегида в фосфатном буфере при рН 7,5, взятых в соотношении 1:1. выдерживают при температуре 18-20° в течение 30 мин, после чего пропускают через него экстракт гепатопанкреаса камчатского краба, содержащий комплекс ферментов: ДНК-азу 100-120 ед/мг белка, РНК-азу 100 - 120 ед/мг, щелочную фосфатазу 0,05 - 0,07 ед/мг, фосфодиэстеразу 1 типа 0,05 - 0,06 ед/мг, протеазы 120 ед/мг, предварительно растворенный в фосфатном буфере рН 7,5, при соотношении хи- тозан: экстракт 1 :2,5 - 5 (по весу). Способ позволяет повысить лечебный эффект средства.