Способ получения кислой дезоксирибонуклеазы Советский патент 1984 года по МПК C12N9/16 

00

о

00 Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается производства ферментных препаратов, а именно, к способу получения кислой дезоксирибонуклеазы 1ДНК-азы/ из животного сырья. Известен способ выделения и очистки кислой ДНК-азы из селезенки свиньи, который заключается в при-, готовлении кислого водного экстракта из свежей селезенки, подкислении экстракта до рН 2,5, двухступенчатого высаливания белКа, содержащего кислую ДНК-азу, сульфатом аммония с последующей хроматографической очист кой обессоленного сырья ферментного препарата, которая включает.три последовательные стадии: хроматографию на диэтиламиноэтил-сефадекс, хроматографию на гидрокснлапатите, хроматографию на карбоксиметил-сефадексе. Этим способом достигается очистка двух ферментных препаратов ДНК-аз IJ, йлход по активности 4,9 и 19,3%; выход по белку 0,018 и 0,07% соответственно. Недостатками этого способа выделв ния являются низкий выход целевого продукта, длительность и многостадийность очистки, а также использова ние на второй стадии очистки фермен та хроматографии на гидроксилапатите.-Метод хроматографирования ферментов на гидроксилапатите является сложным, трудоемким, плохо воспроизводимым и поэтому не применяется в широкомасштабном биохимическом производстве. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения кислой ДНК-азы из семенников лосося, который заключается в экстрагировании животной тка ни кислым водным раствором,-фракционировании экстракта сульфатом аммония, обессоливании, после чего фракции, обладающие ферментативной актив ностью, собирают и после добавления к ним дитиотреитола (1 мМ/ лиофилизируют. Лиофилизированный препарат фермента растворяют в разбавленном растворе NaOH таким образом, чтобы рН ферментного раствора равнялся 6,7. Препарат фермента наносят на колонку с гидроксилапатитом (2,5х 11 см/, уравновешенным 0,04 м N«-фос фатным буфером, рН 6,7. После отмывк колонки этим же буфером осуществляют ступенчатую хроматографию, постепенно повышая концентрацию фосфата Na в элюирующем растворе. Кислая ДНК-аза элюируется в 0,15 м Nc(-фосфатном буферном растворе. На этом этапе конечный целевой продукт концентрируют, диализуют в течение ночи против водного-раствора, содержащего 2,5 мМ 2-меркаптоэтанала, 5 мМ ЭДТА рН 7, и-оставляют храниться при-ЗО С Известным способом получают 1,4 мг ДНК-азы из 2 кг семенников лосося, что составляет 11% от активности сырого ферментного препарата в экстракте. Достигнута очистка .фермента пс5 активности в 5920 раз. Длительность способа 14-16 дней C2J. Недостатками известного способа являются его длительность и сложность. Кроме того, на одном из этапов очистки ферментного препарата используют гидроксилапатит, что свидетельствует о сложности процесса, связанной со строгим соблюдением технических условий хроматографии. Способ не обеспечивает достаточного выхода целевого продукта (выход ДНК-азы по белку составляет 0,0019% ). Цель изобретения - увеличение выход& целевого продукта и упрощение процесса. Поставленная цель достигаете тем, что согласно способу получения кислой ДНК-азы, включающему экстрагирование животной ткани кислым водным раствором, фракционирование экстракта сульфатом аммония, обессаливание и вьщеление целевого продукта с помощью хроматографии, экстрагированию подвергают печень минтая, а хроматографию обессоленного ферментного раствора осуществляют на фосфоцеллюлозе с элюцией-буфером рН 7,1-7,2, а затем на анионообменнике с элюцией тем же буфером, содержащим 0,30,35 М NaCl. В качестве анионообменника используют ДЭАЭ-целлюлозу или ДЭАЭ-сефадекс, или ТЭАЭ-целлюлозу, или АЭ-цел-. люлозу. Удельная активность кислой ДНК-азы, полученной данным способом составляет 50 ед. на 1 мг белка, степень очистки по активности 29,4 раза, выход фермента по активности 31%. Конечный целевой продукт не содержит интерферирующих примесных активностей:фосфатаз и фосфодиэстераз. Длительность процесса Ъчистки 4-5 дней. Пример. 35 г свежемороженной печени минтая мелко измельчают и экстрагируют кислым водным раствором (дистиллированная вода, физиапо-. гический или буферный раствор, подкисленные серной кислотой до рН 2,5) в скоростном электрогомогенизаторе, центрифугируют при 800Ох в течение 30 мин при . Супернатант собирают и операцию повторяют еще раз для полного извлечения фермента из ткани. К объединенному супернатанту добавляют сульфат аммония 30% насыщения при ,. перемоиивают до полного растворения соли и оставляют на 5-6 ч при для формирования осадка белка, который затем фильтруют через ДВОЙНОЙ бумажный фильтр при . К фильтрату добавляют сухо сульфат аммония (85% насыщения J при перемешивании и оставляют на 5-6 ч для полного осаждения белка. Осадок фильтруют через двойной бумажный фильтр или центрифугируют при 8000х в течение 1 ч , растворяют в минимальном объеме 0,05 М аммоний-ацета ного буфера, 0,002 М ЭДТА, рН 5,35,4 и затем обессоливают на колонке с сефадексом Г-25, уравновешенной этим же буфером со скоростью 220240 мл/ч. Обессоленный сырой ферментный препарат наносят на колонку (1,1х 6,3 см) с фосфоцеллюпозой, уравнове шейной 0,05 М аммоний-ацетатным буфером, 0,002 М ЭДТА, рН 5,3-5,4. Колонку промывают этим же буфером до исчезновения УФ-поглощения в элюате при А-280 нм. Десорбцию ферментного препарата, содержащего наряду с кислой ДНК-азой кислую РНК-азу, осуществляют 0,2 М Na -фос фатным буфером с 0,001 М ЭДТА, рН 7,1-7,2. Выход ферментного препарата из колонки контролируют по Увикорду (можно использовать Увикорд и самописец любого типа). Полученный после хроматографии На фосфоцеллюлозе ферментный препйрат разбавляют дистиллированной водой в 10-12 раз и наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (1x10 см J, уравновешенной 0,02 М М«-фосФатным буфером, 0,001 М ЭДТА, рН 7,1. Посл предварительной отмывки колонки эти же буфертгым раствором, содержащим 0,1 М Nctce , кислую ДНР-азу десорбируют 0,02 М No -фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и 0,3 М NeCe, рН 7,1.. На этом этапе происходит отделе ние кислой ДНК-азы от кислой РНК-аз (кислая РНК-аза в условиях, приве.денных в примере 1, не сорбируется JHa анионообменнике;, и полученный препарат кислой ДНК-азы (конечный целевой продукт ) не содержит интерферирующих примесных активностей фосфатам и фосфодиэстераз.Из 35 г печени получают 1,38 мг кислой, ДНК-азы (по белку), удельная активность фермента увеличивается в 29,4 раза по сравнению с исходной в сором препарате. П р и М е р 2. Хроматография ДНК-азы на колонке с ДЭАЭ-сефадексом. Полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе ферментный препарат (как в примере 1 разбавляют дистиллированной водой в 10-12 раз и наносят на колонку с ДЭАЭ-сефадексом (1x10 см1, уравновешенным 0,02 М . Nc -фocфaтным буфером, 0,001 М ЭДТА, рН 6,9-7,2. После предварительной отмывки . колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М NotCf , кислую ДНК-азу десорбируют 0,02 М N«-фосфатным буфером, содержащим-О,О01 М ЭДТА и 0,3.5 М NaCe , рН 6,9-7,2. П р и М е р 3. Хроматография ДНК-азы на колонке с ТЭАЭ-целлюлозой. Препарат ДНК-азы, полученный после хроматографии на фосфоцеллюлозе (как в примере 1), наносят на колонку с ТЭАЭ-целлюлозой (1x10 см У, уравновешенной 0,02 М Nd -фосфатным буфером, 0,001 М ЭДТА, рН 6,9-7,2. После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М NotCe , кислую ДНК-азу (конечный целевой продукт) десорбируют 0,02 М Мс(-фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и 0,3 М N«C , рН 6,9-7,2. П р и М е р 4. Хроматография ДНК-азы на колонке с АЭ-целлюлозой. Препарат, полученный после хроматографирования на фосфоцеллюлозе (как в примере 1), наносят на колонку с АЭ-целлюло,зой (1x10 см), уравновешенной 0,02 М N«-фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА, рН 6,9-7,2. После предварительной отмывки колонки этим же буферным раствором, содержащим 0,1 М Ncxce , кислую ДНК-азу ( конечный целевой продукт ) Десорбируют 0,02 М Nd-фосфатным буфером, содержащим 0,001 М ЭДТА и 0,3 М Note, рН 6,9-7,2. Сводные „количествённы е данные очистки кислой ДНК-азы на последней стадии очистки с использованиемразличных анионообменников приведены в табл. 1. Таблица

,Выход ДНК-азы по активности составляет 31,3%. Исследования свойств препарата кислой ДНК-азы, получаемой по предлагаемому способу, показывают ЧТО: оптимум рН фермента находится в Области 5,0-5,5 фермент стабилен а широком диапазоне рН t4,,0fc для проявления активности препарат фермента не требует ионов двухвалентных металлов; фермент расщепляет ДНК по эндонуклеазному типу с образованием З- концевых фосфатолигонуклеотидов; фермент проявляет высокую специфичность по отношению к ДНК, ,среди продуктов гидролиза преобладает крупные опигонуклеотиды с молекулярной массой более 40 тыс.дальтон

В табл. 2 представлены количественные данные процесса хроматографической очистки кислой ДНК-азы из печени минтая от стадии получения сырого ферментного препарата до выхода целевого продукта. За единицу активности фермента принимают такое количество ДНК-азы, которое за 1 ч инкубации при приводит к образованию 1 О гмнгк торастворимых продуктов гидролиза ДНК.

Таким образом, использование и данном способе в качестве источника ,сырья для получения кислой ДНК-азы печени минтая, а в качестве сорбентов для хроматографической очистки

ферментного препарата фосфоцеллюлозы и анионообменника приводит к увеличению выхода целевого продукта, сокращению длительности очистки ферментного препарата , упрощению процесса.