ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM ESTINOGENUM A.KOMATSU ET S. ABE EX G. SM. - ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ P И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/14 C12N9/14 C12N9/14 C12R1/80 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения высокоактивной эндонуклеазы Pest [ЕС 3.1.4.21] - одноцепочечной нуклеат-5'-олигонуклеотидгидролазы, которая может найти применение в пищевой промышленности для ферментации продуктов, в молекулярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты и строения рибосомальной, транспортной и вирусной рибонуклеиновой кислоты, в генетической инженерии для получения рекомбинантных молекул и при получении 5'-рибо- и 5'-дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Активными продуцентами нуклеаз являются микроскопические грибы [1]. Из культуры Aspergillus sp. , выделенной из зерен пшеницы, получена и использована для ферментации пищевых продуктов гетеросубъединичная нуклеаза с молекулярной массой 125000, имеющая специфичность к одноцепочечной ДНК и РНК [2] . Из наземных микроскопических грибов Penicillium citrinum и Aspergillus oryzae получены нуклеазы Р1 и S1 соответственно [3].

Известен способ получения нуклеазы S1 из амилоризина путем экстракции сухого порошка, прогревания надосадочной жидкости при 70^oС, осаждения сульфатом аммония (до насыщения 70-100%), последовательной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, на сульфосефадексе С-50 и хроматографии на сефадексе G-100 [4]. Выход продукта по этому способу не превышает 16%, а удельная активность фермента 450 ед/мг белка, не смотря на то, что для очистки нуклеазы в способе предусмотрена трехкратная хроматография, усложняющая процесс получения фермента.

Известен также способ получения нуклеазы S1, включающий экстрагирование "такадиастазы", осаждение сульфатом аммония (до насыщения 60-90%), диализ, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером рН 7,0, ступенчатое элюирование фермента 0,04 М калием фосфорнокислым однозамещенным и 0,2 М натрием хлористым в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,0 и гельхроматографию на сефадексе G-75 [5]. Выход продукта невысок и составляет 3%. Полученный препарат имеет удельную активность 18425 ед/мг белка. Степень его очиски равна 1000. Однако получаемый по этому способу препарат включает примеси рибонуклеаз, фосфодиэстераз, ферментов, расщепляющих нативную ДНК, ухудшающих его качество.

Из всех известных способов наиболее близок к заявляемому способ получения нуклеазы S1 из культуральной жидкости гриба Aspergillus oryzae, выращенного на питательной среде, обогащенной сернокислым цинком [6]. Культуральную жидкость с нуклеазной активностью 220 ед/мл подкисляют до рН 5,7 и добавляют сульфат аммония до насыщения 65%, центрифугируют 40 мин при 4500 об/мин, добавляют сульфат аммония до насыщения 95% и оставляют на 20 часов. Раствор центрифугируют при 9000 об/мин в течение 1 часа, осадок растворяют в 0,02 М растворе ацетата аммония, содержащего 0,1 мМ ионов цинка, и диализуют против 0,02 М раствора ацетата аммония, содержащего 0,1 мМ ионов цинка. Наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,02 М раствором уксуснокислого аммония, содержащего 0,1 мМ ионов цинка, и элюируют градиентом от 0,02 до 0,5 М раствора аммония уксуснокислого, содержащего 0,1 мМ ионов цинка. Полученная нуклеаза является гомогенным белком с удельной активностью 23300 ед/мг белка и не содержит примесей других ферментов, расщепляющих РНК и нативную ДНК. Выход целевого продукта составляет 23%. Способ-прототип относительно неудобен по своей сложности, длительности и дороговизне сырья.

Получение гомогенных ферментных белков не является основной задачей при поиске и выделении нуклеаз из культуры микроскопических грибов. Прежде всего ставится задача найти и выделить нуклеазу с ценной для практических целей субстратной специфичностью, которая была бы пригодна для использования в качестве специфического реагента. Поэтому при получении ферментного белка, пригодного для использования в качестве специфического реагента, необходим способ, позволяющий освободить данную нуклеазу от примесей ферментов, мешающих ее использованию в качестве специфического реагента. Также ставится задача повысить продуктивность штамма, продуцирующего нуклеазу, и получить препарат с высокой активностью.

Поставленная задача решается выявлением нового штамма гриба, обладающего способностью продуцировать эндонуклеазу P_est-одноцепочечную нуклеат-5'-олигонуклеотид-гидролазу, и разработкой нового способа получения эндонуклеазы, предусматривающего культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с получением культуры, обогащенной нуклеазной активностью, с последующим выделением целевого продукта, отличающегося тем, что в качестве продуцента используют штамм гриба Penicillium estinogenum A. Komatsu et S. Abe ex G. Sm., выделение продукта осуществляют путем экстракции культуры 2,5 объемами 0,03 М Na-ацетатного буфера рН 3,2, термообработки полученного экстракта при 75^oС, отделении твердой части, фракционированного концентрирования белков на хитозановом сорбенте и очистки сырого ферментного препарата с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-75.

Активность эндонуклеазы P_est определяют по расщеплению poly U. Стандартная инкубационная смесь в объеме 1 мл содержит 23 мМ poly U, 0,03 M ацетат Na, 1 мМ ZnSO₄, 0,5 М NaCl, pH 3,7. После 30 мин инкубации при 37^oС реакцию останавливают добавлением 2 мл смеси 0,5 М HClO₄ и 0,1% LаNО₃. За единицу активности эндонуклеазы P_est принимают прирост оптической плотности в кислоторастворимой фракции на 1 единицу оптической плотности, измеренной при 260 нм.

Удельную активность выражают в единицах активности фермента на 1 мг белка. Концентрацию белка в растворе определяют по методу Бредфорд [7].

Гидрогель хитозана с бифункциональным сшивающим агентом готовят следующим образом: 2,75 г хитозана последовательно обрабатывают 6,0 н. растворами уксусной кислоты, едкого натра, дистиллированной воды до рН 7,0. К 50 мл полученного геля хитозана прибавляют 100 мл 2% раствора глутарового альдегида в 0,05 М натрийфосфатном буфере рН 7,0 и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Затем прибавляют 3,0 г глицина, растворенного в 50 мл 0,05 М натрийфосфатного буфера рН 7,0, и выдерживают при комнатной температуре 30 минут. Полученный сорбент отмывают от продуктов реакции дистиллированной водой и уравновешивают [8].

Исследование свойств эндонуклеазы, продуцируемой штаммом Penicillium estinogenum A. Komatsu et S. Abe ex G. Sm. и выделяемой согласно изобретению, показало, что фермент имеет молекулярную массу 29 кДа, стабилен в области рН 2,9-8,0, проявляет максимальную активность в 0,03 М Na-ацетатном буфере, рН 3,7 в присутствии 1 мМ ZnSO₄, 0,5 М NaCl или 0,3 М KCl. Эндонуклеаза P_est термостабильна и не теряет первоначальной активности после 30 мин инкубации при 75^oС. Для проявления активности фермент требует присутствия ионов двухвалентных металлов. Ингибированный ЭДТА или цитратом Na фермент реактивируется добавлением в инкубационную смесь эквимолярного количества ZnSО₄. Фермент гидролизует одноцепочечную ДНК и РНК и проявляет предпочтение к poly U. Эндонуклеаза P_est успешно использована для получения 5'-мононуклеотидов и в генной инженерии.

Штамм Penicillium estinogenum A. Komatsu et S. Abe ex G. Sm., обладающий способностью продуцировать эндонуклеазу, выделен из колониальной асцидии, собранной возле побережья о.Шикотан (Курильские острова).

Штамму Penicillium estinogenum A. Komatsu et S. Abe ex G. Sm. присвоен коллекционный номер КММ 4628 в Коллекции Морских Микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН (официальный акроним КММ и номер 644 во Всемирной федерации коллекций культур - WFCC).

Штамм Penicillium estinogenum A. Komatsu et S. Abe ex G. Sm. характеризуется следующими свойствами.

Культуральные признаки: Колонии на среде Чапека бархатисто-войлочные, гладкие, однако приподнятые в центре, достигают 5 см в диаметре за две недели роста при температуре 20-25^oС, в зоне образования конидий-голубовато-зеленые, с возрастом становятся от темно-зеленых до оливково-коричневых, покрываются паутинистым, воздушным светло-серым мицеллием. Запах плесневый. Иногда образуется экссудат в больших золотисто-желтых каплях. Янтарно-желтый пигмент диффундирует в окружающий агар.

На среде Чапека с дрожжевым экстрактом колонии растут быстрее, достигая 5,7 см в диаметре за две недели роста при температуре 20-25^oС, такой же текстуры, как на среде Чапека, но радиально-складчатые, от зеленовато-серых до серо-коричневых в зоне конидиобразования, с белым краем из погруженного мицеллия, достигающим 3 мм ширины. Запах сильный, плесневый. Экссудат образуется обильно в ярко-желтых каплях. Янтарно желтый пигмент диффундирует в окружающий агар. Обратная сторона колоний, сначала янтарно-желтая, становится светло-красно-коричневой.

На среде сусло-агар колонии достигают 4,3 см в диаметре. Они плоские, бархатистые, голубовато-зеленые, с тонким белым растущим краем, порошащие, обильно образуют конидии. Экссудат не образуется. Пигмент в агаре отсутствует. Обратная сторона колоний от охряной в центре до бесцветной на краях колоний.

Морфологические признаки: Конидиеносцы, слегка шероховатые, образуются на субстратном мицеллии, несут мутовку из 4-6 метул, 8-16•2,5-4 мкм. Конидиогенные структуры симметричные. Каждая метула заканчивается мутовкой из 3-8 фиалид (стеригм), достигающих 8-12•2,5-3 мкм. Конидии от шаровидных до широкоовальных, гладкие или слегка шероховатые, до 3,5-4,5 мкм длины, образуются в длинных, параллельных колонках.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Penicillium estinogenum выращивают методом поверхностного культивирования при температуре 22^oС в течение 168 ч на питательной среде следующего состава: отруби пшеничные 95%, опилки 5%, влажность среды 55% достигается 5%-ным экстрактом молок лососевых рыб (выварочные воды) на натуральной морской воде. Для получения фермента эндонуклеазы P_est культуру, выросшую на среде, экстрагируют 2,5 объемами 0,03 М Na-ацетатного буфера рН 3,2. Далее экстракт с концентрацией белка 1,0 мг/мл и удельной активностью эндонуклеазы 90 ед/мг белка выдерживают при температуре 75^oС в течение 15 мин и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывают, супернатант разводят 0,03 М Na-ацетатным буфером рН 3,2 и пропускают через широкую колонку с 500 мл модифицированного гидрогеля хитозана, уравновешенного 0,03 М Na-ацетатным буфером рН 3,2. Колонку промывают 2,5 объемами 0,5 М NaCl для удаления примесей большинства пигментов, балластных белков, а также фосфатазной и фосфодиэстеразной активностей. Эндонуклеазу P_est элюируют с хитозанового сорбента 1 М NaCl, концентрируют ультрафильтрацией на мембране РМ-10 (Amersham) до 1 мл и наносят на колонку с сефадексом G-75, уравновешенную 0,03 М Na-ацетатным буфером, содержащим 1 mM ZnSO₄, 0,5 М NaCl, 1% глицерина, рН 4,6. Элюцию фермента проводят тем же буфером со скоростью 13 мл/ч, отбирая фракции по 3 мл. Фракции, содержащие эндонуклеазу P_est, объединяют и концентрируют на мембране РМ-10 до минимального объема.

Полученный препарат является гомогенным белком при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле и не содержит примесей идентичных ферментов, расщепляющих РНК и ДНК. В табл.1 приводятся характеристики продукта в процессе очистки (см. в конце описания).

Пример 2. Штамм Penicillium estinogenum выращивают методом поверхностного культивирования при температуре 22^oС на качалке (180 об/мин) в течение 168 ч на модифицированной среде Огата следующего состава: сахароза 5%, пептон 1%, соевая мука 0,5%, магний сернокислый 0,05%, кальций хлористый 0,01%, калий азотнокислый 0,2%, приготовленной на натуральной морской воде рН 7,8. Для получения фермента эндонуклеазы P_est культуральную жидкость освобождают от мицеллия и спор центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. Далее культуральную жидкость, содержащую 0,2 мг белка/мл культуральной жидкости и удельную активность эндонуклеазы 250 ед/мг белка, выдерживают при температуре 75^oС в течение 15 мин и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин. Осадок отбрасывают, супернатант разводят 0,03 М Na-ацетатным буфером рН 3,2. Далее выделение и очистку фермента осуществляют так же, как и в примере 1.

Полученный препарат является гомогенным белком при электрофорезе в SDS-полиакриламидном геле и не содержит примесей идентичных ферментов, расщепляющих РНК ДНК. В табл.2 приводятся характеристики продукта в процессе очистки (см. в конце описания).

Преимущества изобретения заключаются в том, что для приготовления питательной среды применяются отходы лесной и лесообрабатывающей промышленности (опилки), отходы мукомольного производства (отруби пшеничные) и выварочные воды, получаемые при переработке молок лососевых рыб, что позволяет исключить использование таких препаратов, как сахароза, пептон, соевая мука, и сократить затраты на производство фермента. При этом утилизируются отходы и решаются экологические проблемы
Кроме того, и что очень важно, использование этой питательной среды позволяет увеличить продуктивность штамма гриба Penicillium estinogenum A. Komatsu et S. Abe ex G. Sm. и получить препарат эндонуклеазы с высокой активностью.

За счет использования твердой среды для культивирования штамма-продуцента (поверхностное культивирование) исключается аэрирование, что позволяет до 70% сократить энергетические затраты на производство фермента.

Литература:
1. Безбородова С.И. Нуклеазы микроскопических грибов, в кн.: "Нуклеазы микроорганизмов." под ред. А.М. Безбородова. - М.: Наука, 1974, с.188-295.

2. Ito К; Matsuura Y; Minamiura N Purification and characterization of fungal nuclease composed of heterogenous subunits archives of biochemistry and biophysics 1994, Vol 309, Iss 1, pp 160-167.

3. Maekawa К., Tsunasawa S., Dibo G., Sakiyama F. Primary structure of nuclease P1 from Penicillium citrinum. Eur. J. Biochem. 1991, 200: 651-661.

4. Сенченко В.Н., Колбановская Е.Ю. и Бочаров А.Л. Получение и некоторые характеристики функционально-гомогенного препарата нуклеазы 81 из α-амилоризина. "Молекулярная биология", 1979, т.13, 6, с.1377-1383.

5. Ando T. Biochim. et biophys. acta, 1966, 114, 158.

6. Авторское свидетельство 998502, кл. С 12 N 9/22, 1983.

7. Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72(2): 248-254.

8. Авторское свидетельство 1811178, кл. С 08 В 37/08, 1989.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, и может быть использовано для получения высокоактивной эндонуклеазы Р_est[ЕС 3.1.4.21] - одноцепочечной нуклеат-5 -олигонуклеотид гидролазы, которую можно использовать в молекулярной биологии при изучении первичной структуры дезоксирибонуклеиновой кислоты и строения рибосомальной, транспортной и вирусной рибонуклеиновой кислоты, в генетической инженерии для получения рекомбинантны молекул и при получении 5'-рибо- и 5'-дезоксирибонуклеотидов из рибонуклеиновой кислоты и дезоксирибонуклеиновой кислоты. Штамм-продуцент выделен из колониальной асцидии, обитающей возле о. Шикотан (Курильские острова), депонирован в коллекции Морских Микроорганизмов ТИ БОХ ДВО РАН под 4628. Способ получения эндонуклеазы предусматривает культивирование штамма-продуцента на питательной среде, экстракцию культуры 2,5 объемами 0,03 М Na-ацетатного буфера рН 3,2, термообработку экстракта при 75^oС, отделение твердой части и последующее фракционированное концентрирование белков на хитозановом сорбенте. Очистку сырого ферментного препарата ведут с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-75. 2 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Штамм гриба Penicillium estinogenum A. Komatsu et. S. Abe ex G. Sm. KMM 4628 - продуцент эндонуклеазы Р_est.2. Способ получения эндонуклеазы Р_est, предусматривающий культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, с получением культуры, обогащенной нуклеазной активностью, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм гриба Penicillium estinogenum A. Komatsu et. S. Abe ex G. Sm. KMM 4628, а выделение продукта осуществляют путем экстракции культуры 2,5 объемами 0,03 М Na-ацетатного буфера рН 3,2, термообработки экстракта при 75°С, отделения твердой части, фракционированного концентрирования белков на хитозановом сорбенте и очистки сырого ферментного препарата с помощью гель-хроматографии на сефадексе G-75.3. Способ по п.2, отличающийся тем, что питательная среда содержит в качестве источника азота 5%-ный экстракт молок лососевых, в качестве источника углерода - отруби пшеничные и опилки, в качестве источника минеральных солей - натуральную морскую воду.