Способ прогнозирования врожденной патологии у детей Советский патент 1993 года по МПК G01N33/48 

СО

с

Использование: в медицине и может применяться при диагностики в неопатологии, в том числе и в медицинской генетике. Сущность изобретения: проводят феноти- пическую оценку количества микроаномалий развития у новорожденных с последующим микрофлуориметрическим исследованием структурно-функциональных особенностей хроматина лимфоцитов периферической крови, регистрируемых по изменению связывания флуорохромного красителя акридинового оранжевого с ДНК хроматина лимфоцитов. При выявлении у новорожденного 5-ти и более микроаномалий развития и изменений связывания с ДНК красителя более чем на 16% по сравнению с контролем ребенка выделяют в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии. Способ позволяет повысить точность прогноза. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, a именно к медицинской генетике.

Цель изобретения - прогнозирование врожденной патологии у детей путем фено- типической оценки микроанрмалий развития и микрофлуориметрии ядер лимфоцитов препаратов крови.

Поставленная цель достигается тем, что новорожденные обследуются клинически и при выявлении у них пяти и более феноти- пических признаков микроаномалий развития проводится анализ крови, суть которого заключается в определении интенсивности свечения комплекса: дезоксирибонуклеино- вая кислота - флуорохромный основной краситель акридиновый оранжевый (ДНКАО). При изменении связывания флуорохро- ма с ДНК, регистрируемого микроцитсфлуо- , риметрией ядер лимфоцитов, свыше 16% по сравнению с контролем (клинически здоровые индивиды), выделяют ребенка в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии.

Способ осуществляется следующим образом: проводят оценку фенотипических проявлений микроаномалий развития у новорожденных. Перечень используемых микропризнаков включает микроаномалии развития шеи и туловища, кожи, волос, головы и лица, глаз, ротовой полости, ушей, позвоночника, конечностей, живота и половых органов. Цитохимический анллид крови про00

л Х| 00

ел

4

Ы

оодят так: мазок готовят непосредственно из 20-15 мкл цельной крови, взятой из пэль- ца. Мазки не подсушивая, фиксируют в смеси абсолютного этанола и ацетона (1:1) не менее 30 минут при комнатной температуре (при температуре +4° С возможно хранение препаратов в фиксирующей смеси до 72 ч). Затем проводят гидратацию препаратов, последовательно инкубируя их по 5 мин в спиртах понижающей концентрации (100°, 90°, 60°, 30°), промывают в дистиллированной воде 1 мин. После этого препараты инкубируют 5 минут в ацетатном буфере (рН 4,4) (5,5 г ацетата натрия - CHaCOONa ЗНаО и 6,8 г хлорида натрия - NaCI растворяют в дистиллированной воде, конечный объем раствора- 1 л, к нему необходимо добавить 4,9 мл ледяной уксусной кислоты - СНзСООН). Затем проводят окраску препаратов в течение 15 минут в растворе флуорохромного красителя акридинового оранжевого (АО), который готовят на ацетатном буфере - рН 4,4 (мо- лярность раствора КГ4; 30,1 мг красителя растворяют в ацетатном буфере, доводя объем раствора до 1 л). После окраски препараты 3 раза по 5 мин промывают в ацетатном буфере, содержащим акридиновый оранжевый в концентрации 10 М (2 мл раствора АО 10 М и 198 мл раствора ацетатного буфера) и заключают в каплю того же раствора под покровное стекло, края которого окантовывают резиновым клеем. Интенсивность связывания красителя ядрами лимфоцитов регистрируют на зондовом ци- тофлуориметре типа Люмам-И 3. Люминесценцию возбуждают светом с длиной волны 436 нм при помощи интерференционного опак-иллюминатора. Интенсивность зеленой (530 нм) люминесценции выражается в условных,единицах, снимаемых со светового индикатора числового вольтметра. Изменение флуоресценции комплекса ДНК-АО у обследуемых оценивают в процентах относительно показателей контроля (донора). Для сопоставления показателей нормы и патологии берут усредненные данные флуоресценции 10 клеток каждого образца, причем окраску сравниваемых препаратов производят одновременно. Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

П р и м е р 1. Ребенок Р-ко, родился 29.10.1985 г,, от первых родов (№ ист. развития новорожденного - 4276). Беременность протекала без особенностей. Матери ребенка 22 года, отцу - 23, родители практически здоровы. Роды срочные. Родился живой доношенный ребенок мужского пола массой 3100 г, рост 50 см, с оценкой по шкале Апгар - 8-9 баллов. Период адаптации протекал благоприятно. На 3-й сутки

была взята кровь на цитохимический показатель - изменение флуоресценции комплекса ДНК-АО в пределах нормы (2%), Из микроаномалий развития у ребенка отмечалось высокое небо (количество микроанома- лий развития (MAP) - 1). Объективно состояние ребенка расценивалось как удовлетворительное, На 7--е сутки ребенок выписан домой. При обследовании ребенка в

катамнезе (возраст 1 г.) наблюдалось соответствующее возрасту физическое и пс ихо- моторное развитие. В момент осмотри . ребенок практически здоров.

П р и м е р 2. Ребенок М-ва, родился

5 26.12.1985 г., от вторых родов(№ ист, развития новорожденного - 5215). Первая беременность в 1982 г., от 1 брака закончилась срочными родами, ребенок здоров. Данная беременность - 2-я, от второго брака. Про0 текала с явлениями угрозы прерывания при сроке 7-8 недель, женщина находилась на стационарном лечении, получала сохраняющую терапию. Мать страдает экстрагени- тальным заболеванием - зоб II степени,

5 отец здоров. Роды при сроке 39-40 недель протекали без особенностей. Родилась живая доношенная девочка массой 3000 г, рост 50 см, с оценкой по шкале Апгар - 7-8 баллов. Состояние ребенка расценено какудов0 летворительное. Фенотипически у ребенка при рождении отмечено б MAP: телеангиэк- тазии на затылке, уздечка верхней губы, дизморфичные ушные раковины, клинодак- тилия мизинцев на руках, высокое небо,

5 кожная синдактилия II-III пальцев на стопах, На 3-й сутки у ребенка была взята кровь на цитохимический анализ - отличие интенсивности свечения ядер лимфоцитов от контроля составляло 18%. С учетом вы0 явленных MAP и цитохимического показателя крови ребенок был выделен в группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, В катамнезе, в возрасте 1 года, ребенок был повторно обсле5 дован, установлено, что становление опорно-двигательной и речевой функции у ребенка идет с задержкой. Ребенок состоит на учете у невропатолога с диагнозом- перинатальная энцефалопатия неясного гене0 за. Также была выявлена патология со стороны мочевыделительной системы, ребенок состоит на учете у уролога с диагнозом -аномалии развития мочеточников, вторичный пиелонефрит.

5 П р и м е р 3. Ребенок Б-в, родился 6,10.1985 г., от 3-й беременности, 2 срочных родов. Матери ребенка 31 год, отцу - 31 год- Мать страдает хроническим заболеванием - неспецифический полиартрит, с обострением в 3-4 недели беременности. Отец - инва,лид I группы (после травмы). У женщины первая беременность в 1977 г. закончилась срочными родами без особенностей, развитие ребенка соответствует возрасту. Вторая беременность - медицинский аборт без осложнений. Данная беременность - третья, прот.жала с явлениями токсикоза I половины беременности. Роды срочные без особенностей, родилась живая доношенная девочка массой 3350 г, рост 50 см с оценкой по шкале Апгар 7-8 баллов. Фенотипически у ребенка отмечалось 10 MAP: монголоид- ный разрез глазных щелей, гипертелоризм, эпикант, узкое небо, дизморфичные ушные раковины, четырехпальцевые борозды на обеих ладонях, брахидактилия, брахицефалия, выраженная общая гипотония, эускуль- тативно выслушивается систолический шум на верхушке. Ребенку был выставлен клинический диагноз синдром Дауна. На вторые сутки жизни у ребенка было взята кровь на цитохимический и цитогенетический анализы. Цитохимический тест показал отличие от контроля на 22%. Цитогенетический анализ крови получен через месяц, который подтвердил клинический диагноз; кариотип 47хх + 21.

При обследовании новорожденных детей нами было обнаружено сочетание достоверного увеличения количества MAP и достоверного (р 0,001) изменения связывания флуорохрома АО с ДНК хроматина лимфоцитов у детей с врожденными и наследственными заболеваниями различного генеза по сравнению со здоровыми детьми (табл. 1).

Проведена клиническая оценка состояния здоровья детей в кэтамнезе (203 чел.). Установлено, что физическое развитие детей взаимосвязано с количеством микроаномалий развития: так, только 26,8 % детей с повышенной стигматизацией имели показатели физического развития, соответствующие .их возрастной норме. Аналогичная связь установлена при оценке психомоторного развития детей: у 67,9% детей имеющих пять и более MAP, отмечалась задержка психомоторного развития, тогда как у детей, имеющих 1 MAP-лишь в 2,3% случаев.

По оценке максимального расхождения функций распределения двух выборок (здоровые и нОЕЮрожденные с отклонениями в состоянии здоровья) определены статистические высокозначимые значения границ чувствительности предполагаемых диагностических критериев: количество MAP и ци- тохимический показатель (Критерий Колмогорова-СмирмоваТублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессоа.- М.:

Медицина, 1978, с. 294). Для MAP значение границы проявления наследственной и врожденной патологии равно 5 (выборка здоровых-345чел..детей с наследственной 5 и врожденной патологией - 35; значимость различий - 0,00001); для цитохимического теста - 16% (выборка здоровых составила 102 чел., детей с отклонениями в состоянии здоровья 109, значимость различий 0 0,00001).

Учитывая данные вышеприведенных исследований было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 79 новорожденных в раннем неонатальном пери5 оде и повторно в годовалом возрасте (только клинический осмотр).

Результаты обследования приведены в табл. 2.

Наследственная и врожденная патоло0 гия диагностирована у 35 детей (группы 1а, 16,4а, 46), причем при рождении патология была выявлена у 20 детей, в возрасте года - у 15. А предлагаемый способ позволил выделить в группу риска в раннем неонаталь5 ном периоде из них 34 ребенка (30 новорожденных проходили в группу риска по обоим критериям - группа 1а, 4-ро по одному из тестов - группы 16, 4а).

Из 34 новорожденных, имевших надпо0 роговые значения цитохимических показателей (группы с 1а по 6а), 5 и более MAP обнаружено у 91,2% (31 ребенок - группы 1а, 26). Из них врожденная и наследственная патология диагностирована у 30 детей

5 (группа 1 а). Структура потоков представлена: врожденные пороки сердца, ортопедическая патология, патология органов слуха, зрения, почек и мочевыделительной системы, Лишь 1 ребенок (группа 4а) с врожден0 ной патологией имел меньше 5 MAP, но цитологический тест у него превышал пороговое значение.

Детей, изменения структуры хроматина которых не превышали 16% (по сравнению

5 с контрольными показателями), наблюдалось 45 человек (группы с 16 по 66). Из них более 5 MAP было у 7 (15,6%) (группы 16, 26, 36). Причем, у 3-х из них была выявлена врожденная патология (группа 16), 2-е

0 состояли на диспансерном учете у невропатолога по поводу перинатальной энцефа- лопатии (группа 26) и лишь 2 ребенка были практически здоровы (группа 36).

Меньше 5 MAP наблюдалось у 38 детей

5 (группы 46, 56, 66) и только у 1 из них диагностировали врожденную патологию (врожденная глухота, возможно, тератогенного характера) (группа 46).

По данным катэмнеза выяснено, что практически здоровых детей было 35 человен (группы 36, 6а, 66): у 32 оба критерия (количество MAP и цитохимический показатель) имели значения соответствующие норме (группа 66), у 2-х детей количество MAP превышало 5 (группа 36), у 1-го пороговое значение превышал цитохимический показатель (группа 6а).

Чувствительность способа соответствует 70,5%, т.к. ложно-отрицательный результат (хотя бы по одному из критериев) из 44 действительно больных детей (группы 1а, 16, 26, 26, 4э, 46, 5а, 56) наблюдался у 13 (группы 16, 26, 46,56, 4а, 5а); а учет ложно- отрицательного результата одновременно по двум критериям дает чувствительность предлагаемого способа 86,4%. Специфичность - 91,4%: ложноположительные результаты из 35 здоровых детей (группы 36, 6а, 66) отмечены у 3-х (группы 36, 6а) (по Одному из двух учитываемых критериев; ложноположительных результатов по 2-м критерием одновременно среди здоровых не отмечено).

Данные клинико-лабораторного обследования детей представлены в табл. 3.

На основании представленных материалов можно заключить, что предлагаемый способ позволяет в ранние сроки выявлять среди здоровых новорожденных детей группу риска по реализации наследственной и врожденной патологии, что представляется важным для своевременного назначения коррегирующей терапии. Кроме того, отмеДанные клинико-лабораторного обследования новорожденных

Группы обследованных новорожденных

Средняя частота микроаномалий развития

Здоровые

С врожденной и наследственной патологией

Достверность различий (р)

тим дополнительные преимущества предлагаемого способа: позволяет дать объективную оценку состояния новорожденного, выраженную в числовых значениях; относительная дешевизна способа (стоимость одного анализа составляет 2 рубля 80 коп.); позволяет значительно ускорить диагностическую процедуру (анализ проводится за 2- 2,5 ч, тогда как на кариотипирование

затрачивается в среднем 101 ч на способ выбранный за прототип - 7 часов; 4 - мало травматичен (для анализа достаточно капли крови), прост в исполнении и не требует высококвалифицированной подготовки исполнителя, импортных препаратов и аппаратуры.

Формула изобретения Способ прогнозирования врожденной

патологии у детей путем феиотипической оценки микроаномалмй развития, от л ич а- ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, у новорожденного при выявлении пяти и более фенотипических

признаков микроаномалий развития дополнительно проводят микрофлуориметрию ядер лимфоцитов препаратов крови, предварительно окрашенных акридиновым оранжевым, измеряют интенсивность флуоресценции акридинового оранжевого и при ее увеличении относительно нормы на 16% и более прогнозируют врожденную патологию.

Таблица1

Изменение интенсивности

флуоресценции комплекса

ДНК-АО (в % относительно

показателей донора

5,3 ±1,1 ()

23,2±3,0 (п-79)

0.001

Таблица2

Распределение детей с учетом пороговых значений количества микроаномалий развития и цитохимического теста по группам в соответствии с состоянием здоровья (по данным ката мнеза)

Т а б л и

Ц а

Продолжение табл„ 3

1

J.L...I.L...1

112

15

27

28

48

207

67

k г

5

5

5

7 Р-а 117

А8 К-а 237

5 7

26

30

191

19

91 5

6

6

6

6

11

Перинатальная энцефалопатия

Дисплазип Лисплазия тазо- тазобедрен- бедренных сус- ных суета- тавов

ВОВ

Врожденная катаракта

Врожденный

порок

сердца

Дисплазия тазобедренныхсуета BOB

Врожденный

вывих

бедра

Врожденный порок сердца, перинатальная энцефалопатия

Врожденный порок сердца, задержка, психо-физического развития

Аномалия, развития мочеточника, вторичный пиело- нефрит, перинатальная энцефалопатия

Перинатальная энцефалопатия

Перинатальная

энцефалопатия,

гипотрофия

Патология зрения

Патология опорно- двигательного аппарата

МРПР неклассифицированный комплекс

Лисплазия тазобедренных, суставов

Врожденный порок сердца, перинатальная энцефалопатия

Врожденный вывих бедра

Продолжение таблс 3

са-Муна-Бидля

17

1817854

16

Продолжение табл.З