Штамм гриба АLтеRNаRIа SoLaNI SoRaUeR, используемый для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции томатов на устойчивость к ранней листовой пятнистости.

Цель изобретения - штамм гриба, предназначенный для повышения устойчивости томатов к альтернариозу.

Описание штамма ВКМ F - 3236 Д.

Штамм выделен из растения томата Lycopersicon esculentum Mill, сорта Ранний 83 в теплице с пленочным покрытием Молдавского НИИ овощеводства.

Штамм был выделен путем снятия одной диктиоспоры (диктиоконидии) гриба с инфекционного пятна при помощи стерильной тонкой иглы и перенесения споры на стерильное агаризованное пивное сусло.

Штамм идентифицирован по определителю: Ellis M. Dematiaceous Hyphomycetes. Kew: Commonwealth Agrlc. Bureou, 1971.

Для использования штамм выращивают на жидкой среде Чапека-Докса в течение 12-70 суток. Минимальное время культивирования используют в случае погруженной культуры, например, на роторных встряхи- вателях. Максимальное время роста используют в случае стационарной культуры.

Для уверенной идентификации штамм его выращивают на живых листьях томатов. Мицелий осторожно втирают в листья и оставляют во влажной камере при обычных условиях и рассеянном дневном освещении на срок 10-14 суток. При этом на листьях образуются инфекционные пятна, некоторые из которых покрыты редкими диктиоко- нидиями, типичными для вида.

Для поддержания культуры в обычных лабораторных условиях, ее выращивают на стандартных агзризованных питательных средах, например, сусло-агаре. При этом идентифицируют по серой окраске мицелия.

(Л

00

00

о

темной окраске низа колоний (причем, пигмент часто диффундирует в питательную среду), а также присутствию (редкому) спо- роношений. Главным признаком штамма В KM F - 3236 Д, отличающим его от других штаммов вида Alternaria solan, является спектр липофильных низкомолекулярных экзометаболитов, который можно определить с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Особенности спектра описаны ниже.

Культурзльно-морфологическме свойства.

Характеристика колоний на плотной среде.

При росте на стандартной среде Чапека при 24°С колонии штамма имеют морфологию, типичную для данного вида: колонии широко растущие, за 8-10 суток роста диаметр достигает 40 мм, за 60 суток - 220-250 мм. Колонии темно-серые с оливковым оттенком, поверхность стареющих культур часто приобретает белесый налет с каплями бесцветного экссудата. На агаризованном пивном сусле этот экссудат имеет янтарную окраску. При росте на жидких и агаризован- ных средах часто выделяется темный пигмент, который диффундирует в среду.

Тип вегетативного тела - мицелий.

Субстратный мицелий.

Среда, Т°, возраст, .условия роста: сусло-агар, 20°С, 10 суток, рост мицелия из одной диктиоконидии, выделенной с листа томата при искусственном заражении.

Гифы под микроскопом темно-окрашенный, септированные, диаметром 4-10 мкм, анастомозирующие, иногда встречаются хламидоскопы. При росте мицелия из диктиоконидии субстратный мицелий образует микросклероции.

Воздушный мицелий.

Среда, Т°, возраст, условия роста: сусло-агар, 20°С, 10 суток, рост мицелия из диктиоконидии.

При моноспоровом рассеве воздушный мицелий встречается не у всех изолятов. Цвет воздушного мицелия оливково-серый, гифы в части, прилегающей к субстрату, темно-окрашенные, их воздушные концы часто бесцветные. Иногда встречаются вздутые клетки овальной формы, а также хламидос- поры. Гифы септированные.

Тип размножения.

Вегетативное (обломками мицелия) и конидиальное.

Покоящиеся структуры.

Микросклероции, хламидоспоры, диктиоконидии, алевриоконидии.

Бесполое размножение.

Типичные диктиоконидии образуются на листьях томатов при искусственном заражении. Они имеют форму тонкой морковки с длинным отростком. Наиболее крупные конидии достигают 250-300 мкм в длину, считая вместе с отростком, и 20-25 мкм в диаметре. В культуре также изредка образуются диктиоконидии, главным образом по краям чашек Петри, в местах контакта мице- лия и стенок чашек. Диктиоконидии в культуре имеют меньшие размеры и часто деформированы, либо редуцированы до цепочки хламидоспор. Конидиеносцы морфологически не выражены.

Хламидоспоры - интеркалярные, темно- окрашенные, - довольно часто образуются в культуре. Они могут встречаться поодиночке, либо образовывать цепочки и сростки.

Алевриоконидии (ранее у данного вида не отмеченные) имеют сферическую форму, диаметр 30-40 мкм, орнаментированную поверхность.

Артроконидии (ранее у данного вида не отмеченные) образуются по голоартриче- скому типу, и их трудно отличить от фораг- ментов мицелия.

Последние два типа конидий встречаются в культуре крайне редко, и обнаружить их при обычном микроскопическом исследовании, как правило, не представляется возможным.

Кроме диктиоконидии, все типы споро- ношения могут образовываться в темноте. Половое размножение.

Не отмечено.

Физиолого-биохимические свойства.

Тип катаболизма: дыхание.

Симбиотропные отношения: не выявле- ны.

Отношение к:

кислороду - аэроб.

Температура роста: максимальная 30- 32°С, оптимальная - 20-424°С, минималь- ная не выявлена.

рН: оптимальное значение 6-7, нормальный рост культуры наблюдается при значениях рН 4-8, ингибирующие роит значения рН не выявлены. Другие характерные физиологические особенности не выявлены.

Маркерные признаки штамма и методы их выявления.

Маркерным биохимическим признаком штамма является состав экстракта, выявля- емый, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Выявление маркерного признака проводят следующим образом. Культуру гриба выращивают на жидкой среде Чапека-Докса погруженной культуре на роторных встряхивателях при 90-110 об/мин. Температура культивирования 20-22°С, срок - 12-16 суток. Затем отделяют культуральную жидкость, подкисляют ее до рН 3-3,5 и экстрагируют хлороформом. После отгонки растворителя на роторном испарителе при температуре бани 40-50°С получают остаток, называемый экстрактом. Идентификацию состава экстракта проводят с помощью ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют с помощью хроматографа PU 4100 на колонке с обращенной фазой Lichrosorb RP 18 (5 мкм) размером 250x4,6 мм при температуре 40°С в градиенте от смеси метанол-вода 1:5 до 100% метанола в течение 40 мин при скорости растворителя 1 мл/мин. Полученные Фракции идентифицируют при помощи спектрофотометрического детектора при длине волны 275 нм. При этом отдельные фракции маркированы по временам удерживания на колонке прибора (мин.): 2,31, 5,82, 14,29, 16,50, 19,06, 22,43, 23,95, 28,54, 31,54, 33,79.

Гено- и хемотаксономические характеристики. Не имеются.

Непатогенен для человека и животных.

Пример 1. Штамм ВКМ F - 3236 Д выращивали в погруженной культуре на среде Чапека-Докса. В колбы Эрленмейера емкостью 300 мл наливают по 150 мл среды, автоклавируют 40 мин при 0,5-0,6 атм. избыточного давления, затем после охлаждения инокулируют мицелиальными дисками диаметром 10 мм. Диски вырезают, у краев семи-десятисуточных колоний гриба, выросших на агаризоаанном пивном сусле. Колбы с грибом помещают на роторные встряхивзтели WU-4 при интенсивности встряхивания 90-120 об/мин. Спустя 12 суток инкубации культуральную жидкость отфильтровывают, подкисляют до рН 3-43,5 и экстрагируют равным объемом хлороформа. После отгонки хлороформа на роторном испарителе получают экстракт штамма ВКМ F - 3236 Д, который используют в селекции томатов на устойчивость к альтернариозу.

Семена томатов сортов Молдавский ранний, Ранний-83 и Ликурич проращивали в присутствии водного раствора экстракта A.solani ВКМ F - 3236 Д в концентрации 0,1 %. Из 2000 семян каждого сорта отобрали по 20, корешки которых были наименее угнетены в росте. Полученные устойчивые проростки высадили в грунт. С растений собрали плоды, из которых выделили семена. Образцы семян с каждого растения проращивали: а) в присутствии воды, б) в присутствии 0,1% раствора экстракта. Спустя 5 суток измерили длину корешков проростков. Образцы, у которых отношение б/а было наибольшим, послужили основой след1 - ющего цикла отбора. По 2000 семян тех рг г,- тений, семена которых были наиболее устойчивыми (отношение б/а наибольшим), 5 проращивали в присутствии 0,1% водного раствора экстракта A.solani ВКМ F--323B Д, i По 2, наиболее устойчивых проростков ёы- садили в грунт. Затем сравнили поражение отобранных растений альтернариозом по

0 сравнению с растениями тех же сортов, не прошедшими отбор (табл. 1).

Пример 2. Штамм ВКМ F -- 3236 Д выращивали в поверхностной культуре на среде Чапека. В колбе Эрленмейера емко5 стью 300 мл наливали по 150 мл среды, ав- токлавировали 40 мин при 0,5-0,6 атм.избыточного давления, затем после охлаждения инокулировали мецилиальными дисками диаметром 10 мм. Диски вырезали

0 у краев семи-десятисуточных колоний, выросших на агармзованной среде Чапека-Докса. Колбы с грибом оставили в покое при комнатных условиях на 70 суток. По окончании инкубации отфильтровали культураль5 ную жидкость и экстрагировали равным объемом хлороформа. После отгонки хлороформа на роторном испарителе получили экстракт штамма ВКМ F-3236 Д, который использовали в селекции томатов на устой- .

0 чивость к альтернариозу.

Цветки растений томатов сортоа Молдавский ранний, Ранний-83 и Ликурич кас- трироеали накануне раскрывания. На рыльца пестиков наносили каплю водного

5 раствора экстракта A.solani ВШ F - 3236 Д в концентрации 0,1%. Затем наносили пыльцу томатов тех же сортов. После опыления цветки закрывали ватными изоляторами. Из созревших плодов выделяли семена

0 и подсчитывали их количества: а) в плодах, полученных при искусственном опылении с использованием экстракта штамма ВКМ F - 3236 Д: б) в плодах, полученных при искусственном опылении, где вместо экстракта

5 на рыльца пестиков наносили каплю воды;

. в) э плодах, где опыление происходило естесственным путем. Из семян, собранных с

растений, для которых отношение а/б было

наибольшим и приближенным к отношению

0 а/б, вырастили томаты следующего поколения. Их цветки кастрировали и повторили перечисленные действия. В следующем поколении растений провели сравнение поражаемое™ альтернариозом тех томатов,

5 которые подверглись пыльцевой селекции с применением штамма ВКМ F - 3236 Д, и сортообразцов исходных форм.

Результаты сравнения приведены в табл. 2.

Из данных, представленных в табл. 1иФормулаизобретения 2, видно, что использование заявляемого

штамма позволяет снизить поражаемое™Штамм гриба Alternarla solan sorauer

растений томатов альтернариозом и, такимВКМ F - 3236 Д, используемый для селекобразом, получить более устойчивые к забо-5 ции томатов на устойчивость к альтернзлеванию растения.риозу.

Таблица1

Полевая оценка поражаемости растений томатов альтернариозом (в баллах по пяти бальной шкале)

Использование: сельское хозяйство, селекция томатов на устойчивость к альтерна- риозу. Сущность изобретения: штамм микромицета Alternaria solani Sorauer выделен из растения томата. Депонирован в В КМ под № Р3236Д. Штамм выращивают глубинно на среде Чапека-Докса, затем фильтруют культура льну ю жидкость, подкисляют до рН 3,0-3,5, экстрагируют равным объемом хлороформа. Полученный экстракт штамма используют для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу. 2 табл.

Примечание. Различие поражаемости не прошедших отбор и отобранных растений каждого сорта достоверны также при проверке по критерию Стьюдента (t 0,05).

Таблица2

Полевая оценка поражаемости растений томатов альтернариозом (в баллах по пяти бальной шкале)