Способ определения иммуногенности противочумных вакцин Советский патент 1993 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к способам определения эффективности иммунизации против чумы.

Целью изобретения является ускорение способа оценки эффективности иммунизации против чумы, экономия экспериментальных животных и упрощение исследования (исключение необходимости работы с вирулентным штаммом чумного микроба).

Это достигается определением соотношения субпопуляций перитонеальных макрофагов на 6-8 сутки после иммунизации экспериментальных животных подкожно в область верхней трети бедра.

Для этой цели перитонеальные микрофаги опытных и контрольных животных разделяют на отдельные субпопуляции методом адгезии в градиенте температур. Разделение осуществляют последовательно при четырех температурах (2, 10, 28 и 37°С соответственно), при которых,как показали наши предварительные исследования, происходит наиболее четкое разделение на субпопуляции, обладающие

разнонаправленной активностью при взаимодействии с чумным микробом. Монослои субпопуляций макрофагов, полученные при 2°С (А) и 37°С (Д) промывают культуральной средой, смывают с поверхности чашей, подсчитывают концентрацию клеток в камере Горяева и определяют соотношение между субпопуляциями Д и А, условно названные нами индексом распределения субпопуляций (ИРС). , где Д и А- концентрация клеток субпопуляций Д и А соответственно. В контроле ИРС 1. Чем эффективнее иммунизация, тем выше ИРС. В случае выживания всех животных 0 1) ИРС 15.

П р и м е р 1. На 6 сутки после подкожной иммунизации морских свинок.. Y. pes.tic ЕУ в дозах 1x10-1x10 м.к. перитонеальные макрофаги опытных и контрольных животных наносили на чашки из полистирола, предварительно обработанные бычьим сывороточным альбумином (БСА) и после инкубации при 2°С в течение 30 мин суспензию неприлипших клеток переносили на другие чашки, которые затем инкубировали 30 мин при 10°С, Эту процедуру адгезии-смыва по00

00

СА

00

вторяли при температуре 28 и 37°С. Монослои субпопуляций макрофагов, полученные при 2 и 37° отмывали в 4-х порциях культуральной среды для удаления неприкрепившихся клеток, снимали с поверхности чашек резиновым шпателем, определяли концентрацию клеток в камере Горяева и подсчитывали индекс распределения субпопуляций макрофагов (ИРС) по формуле: ИРС Д/А, где А и Д - субпопуляции макрофагов, выделенные при 2 и 37°С соответственно. Статистическую обработку результатов исследования проводили методом доверительных интервалов с помощью таблиц Стрелкова.

Параллельно определяли иммуногенность препаратов по индексу эффективности иммунизации 0):l b/n, где Ь - количество выживших (после заражения, an- общее число взятых & опыт животных. Полученные данные представлены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что эффективность иммунизации, оцениваемая в опытах ин витро с помощью предлагаемого способа соответствует индексу эффективности иммунизации, определяемому в опытах заражения иммунизированных животных вирулентным штаммом чумного мликроба. Изученная субкультура Y. pestls ЕУ обеспечивает резистентность экспериментальных животных к чуме в дозах 1x10s - 1х10в м.к.

П р и м е р 2. Условия опыта те же, что в примере -1. Изменен только срок взятия макрофагов. Он составляет 7 суток. Иммунизацию проводили антигеном FIB в дозах 6-400 мкг. Полученные данные представлены в табл.2.

Из табл.2 видно, что эффективность иммунизации оцениваемая в опытах ин витро с помощью предлагаемого способа (ИРС), соответствует индексу эффективности иммунизации, определяемому в опытах заражения иммунизированных животных

0

5

0

5

0

5

0

вирулентным штаммом чумного микроба. Антиген Ft В без адъюванта не защищает экспериментальных животных от чумы.

П р и м е р 3. Условия опыта те же, что в примере 1. Изменен только срок взятия макрофагов. Он составляет 8 сут. Иммунизацию проводили антигеном FIB в неполном адью- ванте Фрейм да (НАФ). Полученные данные представлены в табл.3.

Из табл.3 видно, что эффективность иммунизации, оцениваемая в опытах ин витро с помощью предлагаемого способа (ИРС), соответствует индексу эффективности ммунизации, определяемому в опытах заражения иммунизированных животных вирулентным штаммом чумного микроба. Антиген FIB в НАФ обеспечивает резистентность к чуме в дозах 25-100 мкг.

Предлагаемый способ дает возможность быстро определить эффективность иммунизации и иммуногенность препаратов, применяемых для профилактики чумы, в 8 раз сокращает сроки исследования, в 10 раз уменьшает количество используемых животных, исключает необходимость работы с вирулентным штаммом чумного микроба и содержания животных в заразно- экспериментальном отделе.

Формула изобретен и я

Способ определения иммуногенности противочумных вакцин путем подкожной иммунизации исследуемой вакциной экспериментальных животных и оценкой результатов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, на б-8-й сутки после иммунизации выделяют пери- тонеальные макрофаги, разделяют их на субпопуляции адгезией в градиенте температур 2,10, 28 и 37°С, определяют величину соотношения между субпопулядиями, полученными при 37 и 2°С, а иммуногенность вакцины оценивают по величине этого соотношения.

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: на 6-8 сут после подкожной иммунизации перитоне- альные макрофаги экспериментальных животных разделяют на субпопуляции методом адгезии в градиенте температур 2,10, 28 и 37°С, определяют соотношение между субпопуляциями, полученными при 37°С и 2°С и по величине этого соотношения судят об эффективности иммунизации. 3 табл,

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3