Способ получения этиловых эфиров жирных кислот Советский патент 1993 года по МПК C12P7/62 

Изобретение относится к области биохимического синтеза органических веществ, в частности сложных эфиров жирных кислот и одно- и многоатомных спиртов.

Известен способ получения сложных эфиров на основе жирных кислот, включающий этерификацию жирных кислот состава С7-С,в спиртами состава Сю ПРИ нагревании в присутствии катализатора. В качестве катализатора используют полисульфофенилкетон на алюмосиликате. Процесс ведут при температуре 170-220°С.

Способ является сложным, так как в нем применяется дорогостоящий, трудно производимый катализатор. Процесс проходит при достаточно высокой температуре, при которой возможно окисление жирных кислот, особенно по- линенасыщенных.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению является способ получения сложных эфиров, заключающийся в том, что проводят реакцию этерификации с участием 100 частей алифатического одноатомного спирта,

со ю ю

Ьь

СО

25-бСО частей алифатической насыщенной или ненасыщенной карбоновой кислоты с числом атомов углерода от 3 до 22 и 00-100000 единиц (в расчете на 1 часть карбоновой кислоты) иммобилизованной липазы, полученной из микроорганизма. Реачцию проводят при температуре 20-80°С (предпочтительно при 30-60°С) при перемешивании. Образующийся сложный эфир отделяют от реакционной смеси.

Для осуществления способа требуется использование липазы, иммобилизованной на инертном носителе, и наличие в реакционной смеси исключительно только жирных кислот и спирта, чт значительно затрудняет стадию подготовки синтеза.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение способа получения этиловых эфиров жирных кислот С{)-С)В насыщенных, моно- и диненасыщенных иод действием микробной липазы.

Поставленная цель достигается тем что в способе получения этиловых1эфиров жирных кислот, включающим этери- .фикацию жирных кислот этанолом с использованием в качестве катализатора микробной липазы, отличием является то, что в качестве источника жирных кислот используют биомассу, полученную путем культивирования штамма Methylococcus capsulatus BCB-S, на которую после отделения культураль- ной жидкости наносят этанол в соотношении 5:1 - 5:10, полученную смесь выдерживают в течение 20-25 суток и подвергают обработке органическими растворителями для получения концентрата этиловых эфиров хирных кислот.

Использование биомассы, полученной путем культивирования штамма Н.capsulatus ВСБ-87, обусловлено высоким содерх анием жирных кислот (20%) нормального строения с числом атомов углерода or 13 до 18, насыщенных, моно- и диненасыщенных. Преобладающими являются пальмитиновая и пальмитолеиновая кислоты, содержание которых достигает и 9%, соответственно. В ощутимых количествах присутствует также олеиновая кислота (5,5).

Штамм, полученный во ВНИИСинтез- белок, выделен из сточных вод нефтя ной скважины ЛзССР и отселекциониро- ван путем выращивания в длительном непрерывном процессе при постепенном

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

понижении рН среды и повышении температуры. Морфологические, культураль- ные и физиологические признаки, а также технологическая характеристика изложены в паспорте штамма.

Штамм является ацидотермотолерант- ным, используется в настоящее время для промышленного получения кормового белка из метана. Это создает возможность организовать дешевое промышленное производство неионогенных поверхностно-активных веществ (этиловых эфиров жирных кислот), так как сырье для их синтеза может быть получено из биомассы штамма без снижения ее ценности как кормового белкового , , продукта.

Нанесение этанола на биомассу в указанных соотношениях обусловлено необходимостью достижения максимальной скорости синтеза этиловых эфиров жирных кислот. При соотношении биомассы и этанола менее 5:1 количество синтезированных этиловых эфиров жирных кислот не превышает 35%. При увеличении соотношения биомассы и этанола свыше 5:10 выход этиловых эфиров жирных кислот остается прежним (52%

Выдержка полученной смеси в течение 20-25 суток обусловлена полнотой образования этиловых эфиров жирных кислот. При выдержке менее 20 суток количество синтезированных этиловых эфиров жирных кислот не превышает 35- 0%. Максимальное количество эфиров образуется на 22-25 сутки. При дальнейшей выдержке увеличения количества эфиров практически не происходит.

Обработку смеси после выдержки проводят органическими растворителями с целью получения концентрата этиловых эфиров жирных кислот.

Указанные свойства являются не только новыми, но и позволяют получить положительный эффект, заключающийся в упрощении подготовки и самого процесса получения этиловых эфиров жирных кислот.

Способ осуществляется следующим образом. Проводят култивирование штамма М.capsulatus ВСБ-б в жидкой питательной среде, полученную биомассу отделяют центрифугированием, наносят этанол в соотношении 5:1 5:10 и выдерживают в течение 20 - 25 суток при комнатной температуре на встряхивателе. Процесс синтеза эфиров и его окончание контролируют

при помощи тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол в системе растворителей гексан:дизтиловый эфир-уксусная кислота (80:20:1) по количеству Фракций свободных мирных кислот и этиловых эфиров жирных кислот. Полученную смесь подвергают обработке хлороформом (3 раза по двухкратному количеству на экстрагируемый объем) с целью извлечения липи- лрв. Этиловые эфиры жирных кислот выделяют с помощью колоночной адсорбционной хроматографии.

Пример 1. Биомассу получали путем глубинного культивирования штамма бактерий M.capsulatus ВСБ-б в непрерывном режиме в Ферментере объемом tO л (рабочий объем 20 л) на питательной среде следующего состава, г/л: 80$ Н3Р04 - 0,05 мл, MgS04-7Н20- 0,02, КС1 - 0,025; микроэлементы (мг/л): ZnS04-7P20 - 0,03, MnS04 4Н20 - 1,9, CuS04-5Н20 - 1,0, HjBOj- 1,25, FeS04 7H20 -2,1, Na,,Mo04 2HZ0- ;0,045, CoS04-7H20 - 0,048, NiS04x 7ИгО - 0,1, A12(S04)3- 4H20 - 0,2, CrCl2-2H20 - 0,085.

Расход природного газа на 1 л среды - 15 л/ч, воздуха - 5 л/час, температура культивирования 2°С, рН среды 5,6, (U 0,25 ч 1 .

Содержание липидов составляет 15% от сухой биомассы.

Полученную биомассу отделяют центрифугированием (10 тыс. об/мин, 15 20 мин) и в количестве 50 г помещают в коническую колбу со шлифом на 200 мл. Влажность биомассы составляет 75%. В колбу вносят 10 г этанола, закрывают пробкой и ставят на встря- хиватель (100 циклов/мин, амплиту - да - 5). Колбу выдерживают в указанных условиях при комнатной температуре в течение 20 суток.

Этиловые эфиры жирных кислот экстрагируют хлороформом (3 раза по 100 мл) и выделяют с помощью колоночной адсорбционной хроматографии.

Количество синтезированных этило- Bbix эфиров жирных кислот составило 35%.

Пример 2. Бактериальную биомассу получали аналогично примеру 1.

10

15

20

25

Количество синтезированных этиловых эфиров жирных кислот составило 52е/-,.

Пример 3. Бактериальную биомассу получали аналогично примеру 1. В колбу с 50 г биомассы вносили 20 г этанола, что составляет 5:2, и выдерживали в течение 22 сут. Выделение синтезированных эфиров осуществляли аналогично примеру 1.

Количество синтезированных этило- . вых эфиров жирных кислот составило 50%.

Пример k. Бактериальную биомассу получали аналогично примеру 1. В колбу с 50 г биомассы вносили 5 г «этанола, что составляет 5:0,5, и выдерживали 15 суток. Выделение синтезированных эфиров осуществляли аналогично примеру 1.

Количество синтезированных этиловых эОироз жирных кислот составило 30%.

Пример 5. Бактериальную био- массу получали аналогично примеру 1. В колбу с 50 г биомассы вносили 200 г этанола, что составляет 5:20, и выдерживали в течение 30 суток. Выделение синтезированных эфиров осуществляли аналогично примеру I.

Количество синтезированных этиловых эфиров жирных кислот составило 52%.

Использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволит упростить получение этиловых эфи- роо жирных кислот за счет использования в качестве сырья для синтеза

40 внутриклеточных жирных кислот штамма M.capsulatus ВСБ-87 без их предварительного выделения из биомассы, а также за счет использования внутриклеточного фермента того же штамма

45 без его предварительного выделения из биомассы, и иммобилизации на инертном носителе.

30

35

Формула изобретения

Способ получения этиловых эфиров жирных кислот, включающий этерифика- цию жирных кислот этанолом с использованием в качестве катализатора мик

Область использования: биотехнология, биохимический синтез органических веществ, в частности сложных эфиров жирных кислот и одно- и многоатомных спиртов. Сущность изобретения: использование в качестве сырья для синтеза внутриклеточных жирных кислот штамма Methylococcus capsula- tus ВСБ-87 без их предварительного выделения из биомассы, а также за счет использования внутриклеточного фермента того же штамма без его предварительного выделения из биомассы и иммобилизации на инертном носителе. Способ осуществляется следующим об- .разом. Проводят культивирование штамма в жидкой питательной среде, полученную биомассу отделяют центрифугированием, наносят этанол в соотношении 5:1 - 5:Ю и выдерживают в течение 20-25 сут при комнатной температуре на встряхивателе. Полученную смесь подвергают обработке хлороформом с целью извлечения липидов. Этиловые эфиры жирных кислот выделяют с помощью колоночной адсорбционной хроматографии . сл с

В колбу с 50 г биомассы вносили.100 г ее робной липазы, отличающийэтанола, что составляет 5:10, и выдерживали в течение 25 сут. Выделение синтезированных эфиров осуществляли аналогично примеру 1.

с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве источника жирных кислот и липазы используют биомассу, полученную путем культивирования

с я тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве источника жирных кислот и липазы используют биомассу, полученную путем культивирования

71822 4118

штамма Methylococcus capsulatusсмесь выдерживают в течение 20-25 сут

ВКПМ-17 3, на которую после отделенияи выделяют целевой продукт экстрагикультурлльной жидкости наносят этанолрованием органическими растворителяв соотношении 5:1 - 5:10, полученнуюк ми.