Штамм аRтнRовастеR SpecIeS ВСТИ-5-продуцент нуклеотидов и рибозо-5-фосфата Советский патент 1982 года по МПК C12N15/00 C12P19/30 C12R1/06 

Изобретение относится к микробиологической промышленности в частности к получению лекарственных препаратов и реактивов нуклеотидов, а так.тке основы для их химического и ферментативного синтезов - рибозо-5-фосфата. и представляет собой штамм, который ПРИ определенных условиях культивирования накапливает в среде рибозо-5-фосфат гуанинфосфорибозцлтрансферазу ГФРТ-азу и синтезирует из внесенных оснований соответствующие нуклеозидмоно-, ди- и трифосфаты,

В нашей стране нет производства нуклеотидюв, а импорт их ограничен высокой стоимостью. Химический синтез этих соединений ДОРОГОЙ, многоступенчатый , требует сложного оборудования. Перспективен микробиологический -синтез данных веществ. Развитие микробиологического способа получения нуклеотидов и рибозо-5-фосфата сдерживает отсутствие стабильного и ПРОДУКТИВНОГО штамма.Известен поодуцент нуклеотидов 1.

Однако такой продуцент отличается невысоким выходом и нестабильностью синтеза нуклеотидов, рибозо-5-ФосФата.

Потоебность стоаны в различных нуклеотидах. их производных, рибозо-5-фосФата ГФРТ-азы, используеMOfi для получения ГМФ, непрерывно растет в связи с развитием исследований в области биологии, медицины. Кроме зтпго, гуанозинмонофосфорная кислота (З-ГИФ применяется в качестве интенсификатора вкуса и

10 повышения питательной ценности различных пишевых noonvKTOB. Ввипу ее абсолютной нётоксичности в качестве добавок предполагается дальнейший РОСТ потребности в этом сое15динении. По.луч,ение гуаниновых нуклеотидов с помощью ауксотрофных .мутантов в настоящее время представляет большие трудности, так как гуаниновые нуклеотиды ингибируют по прин20ципу обратной связи начальные реакции биосинтеза пуринов de novo. Поэтому с помощью мутантов можно получать лишь природные нуклеозидмонофос аты (ГМФ) в ограниченном коли25честве, а народному хозяйству требуются различные нуклеотиды., их аналоги, применяющиеся в медицине для лечения злокачественных опухо|Лей. Поэтому актуален поискштам30-ма - продуцента нуклеотидов ,. а-.также основы для их синтеза, синтеза различных соединений - рибозо-5-фосфата, который также импортируется. ; Наиболее близким к предлагаем(3№1у штамму является oтeчecтвe ный продуцент АТФ и незначительных количеств ГТФ Corynebacterium species ВСТИ 301Г2. Недостатком известного продуцента является то, что при его использовании требуется предварительная очистка питательных сред от ионов марганца и цинка, которые сильно лимитируют синтез нуклеотидов из оснований этой культурой. Для приготовления сред требуется использование высокоочищенных реактивов, дистиллированной ВОДЬ1. Кроме того известный штамм обладает нестабильностью синтеза нукле отидов, не накапливает в среде рибозо-5-фосфат, исключает применение дл получения их дешевых питательных сред. . Целью изобретения является проведение поиска и отбор культуры, способной накапливать в среде рибозо-5-фосфат аденин и гуанинфосфорибозилтрансфераз (АФРТ-азы и ГФРТ-азы) и синтезировать из внесенных оснований соответствующие нуклеотиды. Поставленная цель достигается следующим образом. В результате поиска и отбора из природных источни ков, выделяют штамм, способный накапливать в соеде рибозо-З-фосФат и син тезировать из экзогенных оснований срответств тошие нуклеотиды. Штамм де понирован во ВНИИантибиотиков, оегис рационный номер 1630, зарегистрирован Международной Федерацией коллекции культур в реестре под О 337. Характеристика штс1мма Arthrobacte species ВСТИ-5. Морфологические признаки. Бактерия, клетки которой расположены попарно, V-образно, встречаются и одиночные клетки, с округленнь ш концами, размеры О,6-1,Ох х1,2-3,0 мкм.Жгутиков нет, неподвиж ная. Граммположнтельна, некислотоустойчива, запасные вещества предста леыы волютиновыми зернами (полифосфаты) , которые к пяти суткам роста на МПА располагаются в клетке полярно, придавая ей гантелевидную форм МПА. Рост хороши, после двух суток роста при 30 С образует колонии 0,50,8 см в диаметре, желтоватого цвета, с ровным краем, выпуклые, непроз рачные, с ровной поверхностью, матовые, маслянистой консистенции, легко суспендируется водой МПБ.. Рост, умеренно мутный, пленку на поверхности не образует, осадок рыхлый, белый, аморфный. На среде с отваром Хоттин|Гера к трем суткам роста образует ко |лрнии 1,0-1,5 см в диаметре, желтого и желтоватого цвета. Пигмент в среде не диффундирует. Среда Гаузе,глицериново-аспарагинойый агар, среда Сабуро - к десяти суткамроста образуются слабые точечные, прозрачные колонии. Среда Чапека с крахмалом рост слабый, мелкие округлые, бесцвет,ные колонии. Физиологические признаки По отношению к кислороду - факультативный анаэроб. Оптимальная температура роста 28-37, при .15,41 рост слабый, при 4, роста нет. Молоко с метиленовым синим не. изменяет. Желатин не разясижает. Крахмал, клетчатку не гидролизует. Сероводород, индол, Л цетилметилкарбинол-, аммяак не образует. Нитраты редуцирует до нитритов. ПробыГна каталазу, уреазу положительные. Усваивает глюкозу, фруктозу, сахарозу, маннозу, ксилозу, рибозу, арабиноз у, галактозу, лактозу, мальтозу, раффинозу инозит, дульцит, маннит, глицерин. На глюкозе, фруктозе, сахарозе образует кцслоты, но не газ. В качестве источника, азота использует для роста различные аммонийные соли , многие природные аминокислоты, {ранят .штамм при 5-8С на косяках с МПА. П р и м е р 1. Ферментация. Посевную культуру. Arthrobacter spesies ВСТИ-5 выращивают в течение суток на качалке (220 об/мин, при ) в колбах Эрленмейера на 250 МП с 10 мл среды. Состав посевной среды, %s глюкоза 2,0 пептон 1,OJ дрожжевой экстракт 1,0, Had 0,3, рН 7,3. Посевной материал 10% (по объему) переносят в ферментационную среду, %: глюкоза 10,0: К НРОд1,0;КН2Р041,0, MgSO -THiO 1,0; CaCIj -ZHjp 0,01; пептон 1,0,- дрожжевой экстракт 1,0, мочевина 0,6 рН 8,3. Мочевину стерилизуют при .0,5 ати, 15 мин, рН сред доводят 5 и.КОН до стерилизации и стерилизуют при 1 ати, 20 мин. Выращивание в течение 3 сут. проводят в таких же условиях как и посевной материал. Для выделения рибозо-5-фосфата используют культуральную жидкость пятисуточной культуры. Для синтеза нуклеотидов в трехсуточную культуру вносят в качестве их предшест- . венника сухой препарат основания гуанин хлорид из расчета 3 мг/мл среды и продолжают инкубацию на качалке еще двое суток. Одновременно с гуанином в среду вносят ксилол из расчета 1% (по объему). . Определение нуклеотидов. Культуральную жидкость, после удаления клеток центрифугированием при 50000 х, 10 мин об рабатывают зслорной кислотой 1,2н, нейтрализуют 30%-ной КОН и хроматографиРУют на бумаге FN-1 в системе

астворителей изомасляная кислота .1 н. аммиак - ледяная кислота 10:5:1, рН 3,8, нисходящая, при . Пятна нуклеотидов, соответствующие свидетелям на хроматограмме, вырезают и элюируют в течение суток 3 мл 0,1 н. НС1. Количество нуклеотидов рассчитывают с переводными коэффициентами УФ-поглощающих элюатов при 260 нм,

Идентификацию отдельных нуклеотидов проводят путем сравнения их Rf с .Rf свидетелей на хроматограмме, спектрофотометрическими методаки (УФ-спектры), химическими - определение рибозы (орцинольным методом по Мейбаум), фосфора (по Фиске-Суббароу), основания: (спектрофотометрически при 260 нм), определение и молярного соотношения. Содержание нуклеотидов, образовавшихся.л культуральной жидкости, выражают в мг/мл среды.

Выделение рибозо-5-фосфата.

Культуральную .жидкос.ть, свободную от клеток, обрабатывают активированным углем СА фирмы Sigma для удсШё.ния белков и УФ-поглощающих . веществ нуклеиновой природы. Адсорб- цию проводят на холоду при перемешивании в течение часа. Контроль за ад сорбцией осуществляют, измеряя поглощение при 260 нм. Уголь удаляют центрифугированием при 10000x(j , 30 мин. , Супернатант используют для выделения рибозо-5-фосфата ионообменной хроматографией на колонке с Дауэкс-.l (формиатная форма) по методу Флакса. Рибозо-5-фосфат может быть выделен из элюатов в виде бариевой соли. Для этого фракции, содержащие рибозо-Б-фосфат, объединяют и упаривают на роторном испарителе до нужнбго объема при температуре не выше ЗО-ЗБ С, подщелачивают до рН 8,5 гидроокисью бария,- затем на холоду добавляют трех кратный объем этанола, осадок собирают центрифугированием при 5000х (} , 10. мин, промывают этанолом, эфиром, и сушат в вакуум-эксикаторе. К пяти суткам культ-ивирования продуцента в определенных условиях в среде накаплива1ется до 4 г/л рибозр-5-фосфата.

Пример 2. Условия ферментации такие же, как в поймеое 1, только в качестве предшественника вносят аденин. Выход АТФ (аденозинтрифосфооной КИСЛОТЫ) 2,0 мг/мл, АЛФ fсщенозиндифосфорной кислоты) 0,5 мг/мл,. АМФ Гаденозинмонофосфорной кислоты) 0,5 Ml /4Л.

П р и м е р 3. Условия ферментации такие же, как и в примере 1, только в качестве предшественника вносят гипоксантин. Выход ИМФ (ино- , зинмонофосфорной кислоты) 3,0 мг/мл.

П D и м е р 4. Условия ферментации такие же, как ив примере 1. только вместо гуанина вносят урацил. Выход УМФ ГуридинмоноФосФорной кислоты) 2.0 мг/мп.

Пример5, Условия Ферментации такие же, как и в примере 1, только вместо гуанина вносят соответствующие нуклеозиды: вместо гуанина гаунозин, аденина - аленозин. гипоксантина - инозин, урацила - уридин, выходы образовавшихся АТФ, АДФ, АМФ, /ГТФ, ГДФ, ГМФ, ИМФ, УМФ были выше незначительно.

П р и м е р 6. Ферментация. Посевнугр культуру Arthrobacter species ВСТИ-5 выращивают в течение суток на качалке (220 об/мин, при 30+/) в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл с 10.мл среды следующего состава, %i

глюкоза 2,0; пептон 1,0, мясной экстракт 1,0, NaCI 0,3i рН 7,3. Посевной материал (10% по объему) .переносят в ферментационную среду, %: глюкоза

10,0} КяНРОд 1,о,--кн рсч1го; ;

MgSO. 1,0; СаСIt -24,0 0,01,V мясной экстракт 0,8; мочевина 0,6 пептон 0,5; рН 8,3, Моче вину стериЛИЗуют отдельно при 0,5 ати,

15 мин, рН сред доводят 5 н. КОН до стерилизациии стерилизуют При 1 ати, 20 мин. Выращивание в течение 3 сут проводят в тех же условиях, что и посевной материал. Из трехсуточной культуральной жидкости удаляют клетки центрифугированием при ЮОООх ,

15 мин. Супернатант используют для фракционирования охлажденным до -15 С, этанолом до 50% насыщения, для чего приливают медленно равный объем этанола. Оссшок собирают центрифугирова-нием при 5000х , 10 мин, растворяют в 50 мМ трис-НС буфере, рН 7,5. Определение aктивнoctи аденин и гуанинФосфорибозилтрансферазы (АФРТ и ГФРТ) проводят по Шлоосбергу.

В работе используют меченые соелинення В/О Изотоп - аденин (удельная активность 4,1| юимп/мин/мкм), гуанин- С (удельная активность 4,6 х X Ю имп/мин/мкм) . Счет радиоактивности -осуществляют на сцинцилляционном счетчике СВС-1 с эффективностью счета/v60%. Активность ферментов выражают в нм синтезированного нуклеозидмонофосфата за минуту,, на мг белка.

Препараты нуклеотидов необходю для различных областей народного хозяйства, медицины, биологии, синтеза различных соединений. Так, ГДФ необходима для синтеза полигуаниловой кислоты, обладающей высокой противовирусной активностью. В нашей стране АТФ получают-из мяса, а остальные нуклеотиды и рибозо-5-фосфат импортируются по очень высокой стоимости. Растущие потребности страны в нуклеотидах и рибозо-5-фосфате не удовлетво ряются их производством. Предложенный штамм Arthrobacter specifes ВСТИ-5 позволяет получать природйые нуклеотиды АФРТ-аэы и ГФРТ-азы и рибозо-5-фосфат, используя дешевые среды, которые в дальнейшем могут б заменены на более рентабельные комп лексные среды, так как синтез нукле тидов и рибозо-5-фосфата предлагаемым продуцентом не зависит от присутствия в среде ионов марганца и цинка. Штамм в определ2нных условиях на 1капливает в совдек пяти суткам культивирования до 54 г/л рибозо-5-фосфата. При в.несении соответствующих оснований или нуклеозидов синтезирует: из аденина - АТФ 2,0 Г/Л5.АДФ 0,5 г/л,- АМФ 0,5 г/л; из гуанина - ГТФ 2,5 г/л, ГЯФ 0,8 г/л; ГМФ 0,5 г/л, гипоксантинаИМФ 3,0 г/л, из урацила 2 г/л, накапливает в -среде ферменты пуринового обмена - аденин и гуанинфосфорибозилтрансферазы с акмвностью к 72 ч ферментации 18 АМФ в минуту на мг белка; и 64 нм С ГМФ в минуту на мг белка. Формула изобретения Штамм Arthrobacter species ВСТИ-5 -(депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков, 1бЗО) продуцент нуклеотидрв и рибозо-5 фосфата. Источники информации, принятые во внимание приэкспертизе 1.Авторское свидетельство СССР О 395082. кл. С 12 Р 19/32. 1971. 2.Авторское свидетельство СССР 726161. кл. С 12 D 13/06, 1977.