СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АЛЛЕРГЕНОВ Советский патент 1995 года по МПК A61K39/35 A61K47/48 

Изобретение относится к иммунобиологии, а именно к способу получения новых полимер-белковых конъюгатов, где исходный белок теряет изначально ясно выраженные свойства индуцировать lgE антителообразование. Полученный конъюгат при иммунизации мышей не вызывает образования lgE антител к нативному белку (немодифицированному) при сохраненной способности индуцировать lgG антителообразование. Предлагаемый конъюгат может найти применение при иммунотерапии аллергических заболеваний.

Цель изобретения снижение аллергенности иммуногенов путем понижения способности аллергена индуцировать антитела класса lgE при сохранении к индукции антител класса lgG.

Это достигается способом получения модифицированного аллергена, отличием которого является то, что аллерген конъюгируют с сополимером N-винилпирролидона и малеинового ангидрида ср. мол.м. 30-70 КДа, модифицированного эпсилонаминокапроновой кислотой и активированного N-оксикукцинимидом, при рН 7,5-9,5 и массовом соотношении аллергена и модифицированного активированного сополимера, находящемся в интервале от 2:5 до 3:2.

Конъюгаты с модифицированным активированным сополимером, имеющим ср. мол.м. ниже 30 КДа, индуцировали низкие титры антител классов как lgE, так и lgG. Конъюгаты с модифицированным активированным сополимером, имеющим ср. мол.м. выше 70 КДа индуцировали низкие титры антител класса lgE. Использование соотношения аллерген; активированный сополимер ниже 2:5 снижает выход конъюгата, при соотношении аллерген: активированный сополимер выше 3:2 значительная часть аллергена не вступает в реакцию, и выход конъюгата на аллерген ниже.

Конъюгацию аллергена овальбумина (ОА) проводят линейным сополимером N-винилпирролидона и малеинового ангидрида (ВМА), модифицированного ε -аминокапроновой кислотой (АКК), в качестве спейсера. При такой обработке иммуногенные свойства аллергена сохраняются или усиливаются (индукция lgG-антител), а аллергены и индукция lgE-антител снижаются или вообще блокируются. Конъюгация ОА ВМА в отсутствии спейсера, а также простая смесь ВМА или ВМА-АКК с ОА не дает нужного эффекта.

Исходный ВМА получают методом радикальной сополимеризации в присутствии динитрила азо-бис-изомасляной кислоты. Молекулярную массу оценивают по значению характеристической вязкости. Состав полимера определяют методом ЯМР-спектроскопии и потенциометрического титрования. Средневязкостная молекулярная масса ВМА, используемого для данной цели, составляет 30-70 КДа. Гидролизованный ВМА не обладает токсичностью на мышах при введении 500 мг/кг веса.

Модификация ВМА АКК осуществляется методом, описанным ранее, и карбоксильные группы в полученном ВМА-АКК активировались с помощью трифторацетоксисукцинимида для последующего присоединения ОА.

Конъюгирование ОА с активированным ВМА-АКК осуществляется в водной среде при рН 7,5-9,5, при соотношении полимер: ОА 2:5 3:2, процесс ведут при температуре 4-20^оС. Продукт реакции выделяют с помощью ультрафильтрации и анализируют высокоэффективной гель-хроматографией. Его состав определяют аминокислотным анализом и УФ-спектрофотометрией.

Сополимер N-винилпирролидона и малеинового ангидрида (ВМА) производства Института элементоорганических соединений АН СССР (ВТУ 23-86) с ср.мол.м. 30-70 КДа, приведенная вязкость 0,11 дл/г.

П р и м е р 1. Сополимер N-винилпирролидона и малеинового ангидрида, модифицированный эпсилонаминокапроновой кислотой (ВПМА-АКК).

6,86 г эпсилонаминокапроновой кислоты суспендировали в 50 мл диметилформамида (ДМФ), добавляли 12,76 мл (52,3 ммоль) N,0-бистриметилсилилацетамида, перемешивали до получения прозрачного раствора и добавляли 5,1 г (26,15 ммоль ангидридных групп) ВМА. Реакционную смесь перемешивали в течение суток при 20^оС и полученный раствор выливали в 500 мл изопропанола. Осадок отфильтровывали, промывали изопропанолом, растворяли в 100 мл воды проводили диафильтрацию на мембране УМ-5 (Amicon). Концентрат высушивали лиофильно. Выход 5,38 г, содержание эпсилонаминокапроновой кислоты по данным аминокислотного анализа (Biotronic LC 5001) 2,7 ммоль/г.

П р и м е р 2. N-оксисукцинимидный эфир ВМА-АКК (ВМА-АКК-ОС).

К суспензии 0,9 г полимера, содержащего 2,7 ммоль эпсилонаминокапроновой кислоты, и 0,9 мл пиридина в 20 мл диметилформамида прибавляли 1,53 г (7,25 ммоль) трифторацетоксисукцинимида. Полученный через 5 мин прозрачный раствор выдерживали 1 ч при 20^оС и реакционную массу выливали в 300 мл изопропанола. Осадок отфильтровывали, промывали гексаном и высушивали в вакууме. Выход 1,13 г (97,5%). ИК-спектр в вазелиновом масле, 1/см: 1805, 1755, 1730, 1680, 1540 и 1205. Содержание N-оксисукцинимидных групп, определенное спектрофотометрией при 260 нм, полученного продукта в 0,1 М растворе аммиака составляло 1,99 ммоль/г.

П р и м е р 3. Получение смеси ОА и ВМА-АКК.

Смесь 50 мг ОА и 50 мг ВМА-АКК (соотношение 1:1) растворяют в 5 мл дист. воды при рН 7 и раствор высушивают лиофильно. Выход составляет 104 мг. Содержание ОА 49%
П р и м е р 4. Конъюгат ОА с ВМА (конъюгат 1).

К раствору 200 мг ВМА в 1 мл ДМФ прибавляли 200 мг ОА (соотношение 1:1) в 7 мл 0,2 М раствора Na₂HPO₄, перемешивали в течение суток. Раствор фильтровали через мембрану ХМ-100 и концентрат лиофилизовывали. Выход 480 мг, содержание ОА 22%
П р и м е р 5. Конъюгат яичного альбумина (ОА) с ВМА-АКК-ОС (конъюгат IIр и IIн).

В раствор 200 мг ОА ("Serva") в 5 мл 0,2 М Na₂HPO₄ (рН 9,5) добавляют 500 мг ВМА-АКК-ОС (соотношение 2:5) и полученную суспензию перемешивают до полного растворения в течение суток при 4^оС. Затем в раствор вводят 100 мкл конц. водного аммиака, перемешивают 1 ч, подкисляют до рН 5 и фильтруют. Фильтрат подвергают диафильтрации через мембрану с порами 100 КД (ХМ-100, Amicon) для обессоливания и удаления свободного ОА (М 45 КД). Образовавшийся в процессе ультрафильтрации осадок отфильтровывают. Фильтрат высушивают лиофильно: выход конъюгата IIp 103 мг, содержание ОА 14 мас. Набухший осадок с фильтра промывают дист. водой, суспендируют в воде и лиофилизуют. Выход конъюгата IIн 392 г, содержание ОА 23 мас.

П р и м е р 6. Конъюгат ОА с ВМА-АКК-ОС (конъюгат III).

Смесь 100 мг ВМА-АКК-ОС и 150 мг ОА (соотношение 3:2) в 8 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 8,1 перемешивали до растворения в течение суток. Раствор фильтровали через мембрану ХМ-100 и концентрат лиофилизовывали. Выход 201 мг, содержание ОА 25%
П р и м е р 7. Конъюгат ОА с ВМА-АКК-ОС (конъюгат IУ).

К раствору 50 мг ОА в 2 мл дист. воды добавляют 40 мкл N-метилморфолина (рН 7,5), 64 мг ВМА-АКК-ОС (соотношение 5:6) и перемешивают до образования раствора в течение суток. Затем добавляют 20 мкл конц. водного аммиака, диафильтруют на мембране ХМ-100 и концентрат лиофилизуют. Выход 7 мг с содержанием ОА 28 мас.

П р и м е р 8. Исследование биологических свойств конъюгата IУ не показало существенных отличий от свойств конъюгата III.

Для изучения иммуногенности конъюгатов ОА с ВМА-АКК использовали мышей самцов (СВА х С57ВI/6)FI гибридов весом 18-20 г, полученных из питомника АМН СССР "Столбовая". Животных иммунизировали трижды с интервалом 3 недели внутрибрюшинно в дозах по 0,5, 10 и 100 мкг/мышь. Для получения сыворотки забор крови осуществляли из ретроорбитального синуса на 10 день первичной иммунизации и в первую и третью недели вторичной и третичной иммунизации соответственно.

Исследование гуморального антительного ответа к ОА для определения гомоцитотропных lgE и суммарных lgG антител к ОА проводили с использованием методов пассивной кожной анафилаксии (ПКА) и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Реакцию ПКА проводили с пулированными сыворотками мышей различных групп, а ИФА проводили с индивидуальными сыворотками от каждой группы.

В доступной литературе, посвященной конъюгатам данного сополимера, не отмечалось свойства редуцировать индукцию lgE антител при введении в организм. Действительно конъюгат немодифицированного сополимера с ОА индуцируют lgE антителообразования в той же степени, что и нативный ОА. Существенное подавление продукции lgE наблюдается только при использовании сополимера модифицированного эпсилонаминокапроновой кислотой. Вместе с тем, способность белка индуцировать lgG антитела не только сохраняется, но даже усиливается при использовании высокой дозы (100 мкг).

Результаты биологических испытаний новых конъюгатов приведены в табл. 1-2. Как видно из представленных данных, уровни lgE антител к ОА при введении ОА удается зарегистрировать спустя неделю после вторичной иммунизации дозами по 0,5 и 10 мкг; доза в 100 мкг почти не вызывает образования lgE, что соответствует общепринятым представлениям. Четко выраженный lgE ответ к ОА 1 нед. после третичной иммунизации удается зарегистрировать при всех трех дозах ОА, а через 3 нед. он сохраняется только для дозы 0,5 мкг (табл.1). Там же представлены данные по образованию lgE антител для конъюгатов ОА с модифицированными сополимерами винилпирролидона и малеинового ангидрида. Способность к индукции lgE антител у последних значительно снижена только после третьей иммунизации выявляются lgE антитела на дозы 10 и 100 мкг. Тогда как более эффективная доза 0,5 мкг не вызывала lgE антителообразования. Препарат III не индуцировал lgE антитела при всех исследованных дозах в течение всех сроков наблюдения. Что касается суммарных антител lgG класса к ОА (табл.2), то наблюдалось дозозависимое усиление вторичного и третичного антителообразования при введении препаратов IIн и III по сравнению с контролем (введение ОА).

Накопление IgG антител к ОА, индуцированных препаратом IIр, имело сходную динамику с таковой, при накоплении lgG антител к ОА при иммунизации ОА.

Иммунизация мышей конъюгатом ОА с немодифицированным сополимером (I) или смесью ОА и модифицированного сополимера не давало эффекта угнетения образования lgE (табл.1), и продукция lgG была сходна с таковой в случае иммунизации только ОА (табл.2).

Таким образом, при иммунизации полимер-аллергенными конъюгатами ОА и модифицированного сополимера обнаружено их новое свойство не индуцировать образование lgE антител к присоединенному аллергену (белку) при сохранении (или даже усилении) способности индуцировать образование lgG антител. Это новое свойство открывает путь к созданию новых терапевтических препаратов, направленно подавляющих аллергическую реакцию к определенным распространенным аллергенам. Кроме того, возможно использование этого свойства для снижения аллергенности вакционных препаратов без подавления индукции протективных антител.

Изобретение относится к иммунобиотехнологии, а именно к способу получения модифицированных аллергенов. Цель изобретения - снижение аллергенности иммуногенов. Сущность изобретения: способ заключается в том, что проводят конъюгацию аллергена с сополимером N - винилпирролидона и малеинового ангидрида мол. м. 30 - 70 КДа. Модифицированным эпсилонаминокапроновой кислотой и активированным N - оксисукцинимидом при массовом соотношении аллерген: полимер от 2 : 5 до 3 : 2. Положительный эффект: в полученных новых полимер-белковых конъюгатах исходный белок теряет выраженные свойства индуцировать IgE антителообразование при сохранении способности к индукции антител класса IgG. Изобретение позволяет снизить аллергенность иммуногенов. 2 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АЛЛЕРГЕНОВ путем их коньюгации с полимером, отличающийся тем, что, с целью снижения аллергенности иммуногенов, в качестве полимера используют сополимер N винилпирролидона и малеинового ангидрида мол.м. 30 70 КДа, модифицированный эпсилонаминокапроновой кислотой и активированный N оксисукцинимидом, при этом коньюгацию проводят при массовом соотношении полимер-аллерген (5 2) (2 3).