Способ извлечения эстрогенов Советский патент 1993 года по МПК A61K35/10 

ел С

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и касается способа извлечения эстрогенов. Целью изобретения является повышение эффективности извлечения. Сущность изобретения заключается в том, что подвергают кислотному гидролизу соляной кислотой воздушно-сухой сапропель при соотношении 1:1, оставляют на сутки, затем нагревают в течение часа на водяной бане и затем трижды экстрагируют спирто-эфирной смесью при соотношении 1:1, затем экстракт обезвоживают сульфатом натрия, выпаривают досуха и растворяют в этиловом спирте, а разделение проводят на незакрепленном слое окиси алюминия в системе хлороформ - этанол в соотношении 9:1. Положительный эффект заключается в том, что предлагаемый способ позволяет четко получить индивидуапь- ные эстрогены.

Изобретение относится к лекарственным препаратам и может быть использовано для извлечения экстрогенов из сапропеля.

Цель изобретения - повышение эффективности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе извлечения эстрогенов из лечебных грязей, заключающемся в том, что исходный продукт подвергают экстракции, для чего его смешивают с экстрагирующим веществом, а после экстракции производят разделение и идентификацию эстрогенов, в качестве исходного продукта используют воздушно-сухой сапропель, который перед экстракцией подвергают кислотному гидролизу, для чего заливают его концентрированной соляной кислотой при соотношении масс 1:1, тщательно перемешивают и оставляют на сутки, после чего нагревают в течение часа на водлной бане, после остывания полученную массу трижды экстрагируют спирто-эфирной смесью при отношении масс экстрагируемого вещества и спирто- эфирной смеси 1:1, затем полученный экстракт обезвоживают и выпаривают досуха, после чего производят разделение и идентификацию эстрогенов. При этом, разделение и идентификацию эстрогенов производят методом тонкослойной хроматографии, для этого полученный сухой остаток растворяют в этиловом спирте. Хроматографию проводят следующим образом: стеклянные пластинки покрывают незакрепленным слоем окиси алюминия, затем на этот слой микрошприцем наносят стандартные растворы экстрогенов и исследуемый раствор, после чего проводят двукратную разгонку в системе хлороформ - этанол с соотношением масс 9:1 соответст00

К)

о ю о

со

ы

венно, затем пластины опрыскивают реактивом Фолина-Чиокалтеу и выдерживают э парах аммиака до появления на них темно- синих пятен, по которым и определяют наличие эстрогенов.

Положительный эффект достигается благодаря тому, что в качестве исходного продукта в предлагаемом способе извлечения эстрогенов используют сапропель, который на порядок больше содержит органических веществ, чем минеральные лечебные грязи, а именно, в 100 г минеральной грязи содержится 3,0% органических соединения, в то время как в 100 г. сапропеля содержится 80% органических соединений. Это уже заранее обеспечивает повышенную концентрацию эстрогенов в конечном продукте способа, что повышает его эффективность.

Уменьшение количества примесей в сапропеле достигается благодаря тому, что сапропель перед экстракцией подвергают кислотному гидролизу, для чего заливают его концентрированной соляной кислотой, тщательно перемешивают и оставляют на сутки, после чего нагревают в течение 1 часа в водяной бане. Причем, в качестве исходного продукта берут воздушно-сухой сапропель, для того, чтобы не снизить концентрацию кислрты.

В результате происходит разрушение карбонатов, содержащихся в сапропеле. Благодаря тому, что в качестве экстрагирующего вещества в предлагаемом способе используют спирто-эфирную смесь, в которой хорошо растворяются эстрогены, это позволяет произвести практически полное извлечение эстрогенов из сапропеля, взятого в качестве исходного продукта. Полученный экстракт обезвоживают сульфатом натрия и выпаривают досуха. Для разделения полученных эстрогенов и их идентификации в предлагаемом способе используют метод хроматографии .в тонком слое. Для этого сухой конечный продукт растворяют в этиловом спирте, так как он хорошо испаряется. Хроматографию проводят на стеклянных пластинах, покрытых незакрепленным слоем окиси алюминия. Для индентифика- ции полученных эстрогенов на пластинки наносят стандартные эстрогены. Система хлороформ - этанол, с массовым соотношением 9:1 соответственно, как показали эксперименты, позволяет достичь лучшего разделения трех классических эстрогенов. Двукратная разгонка обеспечивает более четкое разделение эстрогенов.

Способ используют следующим образом.

В качестве исходного продукта для извлечения эстрогенов в предлагаемом способе используют воздушно-сухой сапропель, что позволяет исключить примеси, содержащиеся в отстойных водах, которые присутствуют в жидком сапропеле. Кроме того, использование воздушно-сухого сапропеля

позволяет уменьшить расход реактивов для осуществления способа. Перед экстракцией

воздушно-сухой сапропель подвергают кислотному гидролизу, для чего заливают его концентрированной соляной кислотой при соотношении масс 1:1. Тщательно перемешивают и оставляют на сутки. После этого

нагревают в течение 1 ч на водяной бане. После остывания полученную массу экстрагируют трижды спиртно-эфирной смесью при соотношении масс экстрагирующего вещества и спирто-эфирной смеси 1:1. Полученный экстракт обезвоживают сульфатом натрия и выпаривают досуха, после чего производят разделение и индентификацию эстрогенов методом тонкослойной хроматографии. Для этого полученный сухой остаток растворяют в этиловом спирте, стеклянные пластинки покрывают незакрепленным слоем окиси алюминия. На этот слой наносят микрошприцем стандартные растворы эстрогенов и исследуемый раствор. После этого производят двукратную разгонку в системе хлороформэтанол с соотношением масс 9:1, соответственно. Затем пластины опрыскивают реактивом Фолина-Чиокалтеу и выдерживают в парах

аммиака до появления на них темно-синих пятен, по которым и определяют наличие эстрогенов. Для кислотного гидролиза воздушно-сухой сапропель помещают в емкость из кислотостойкого материала и

заливают его концентрированной соляной кислотой. Тщательно перемешивают до образования однородной массы и оставляют на сутки при комнатной температуре для постепенного удаления СОа при разложении карбонатов. Через сутки емкость со смесью ставят на водяную баню и нагревают в течение 1 ч. В результате карбонаты, всегда присутствующие в сапропеле, разрушаются, что способствует дополнительной

очистке исходного продукта от примесей. После остывания полученную массу экстрагируют спирто-эфирной смесью. Для этого полученную массу смешивают со спирто- эфирной смесью в массовом соотношении

1:1. Тщательно перемешивают и отстаивают. После того, как четко обозначится граница отстоя, верхний слой сливают. Оставшийся осадок еще раз смешивают со спирто-эфирной смесью и процедуру повторяют. Экстракцию спирто-эфирной смесью

проводят трижды, что позволяет наиболее полно выделить эстрогены из исходного продукта. Полученный экстракт обезвоживают сульфатом натрия и выпаривают досу- ха.

После этого полученный сухой продукт разделяют на конкретные эстрогены. Для этого используют метод тонкослойной хро- матографии. Для проведения хроматографии полученный сухой продукт растворяют в этиловом спирте. Хроматографию проводят на стеклянных пластинках, покрытых незакрепленным слоем окиси алюминия. С помощью микрошприца на пластинки наносят стандартные эстрогены и исследуемый раствор. Стандартные эстрогены позволяют идентифицировать эстрогены, содержащиеся в исследуемом растворе, Как показали опыты, разделение трех классических эстрогенов лучшие всего достигается в системе хлороформ - этанол в массовом соотношении 9:1 соответственно. Для более четкого разделения эстрогенов применяют двукратную разгонку. Для обнаружения стероидов пластину опрыскивают реактивом Фолина-Чиокалтеу и выдерживают в парах аммиака до появления на пластине темно- синих пятен. Темно-синие пятна указывают на наличие эстрогенов, которые проявляются в виде темно-синих пятен.

При проявлении хроматограм обнаружено четкое пятно, имеющее такую же константу передвижения, как и эстрои стандартного раствора. Расстояние между стартовой линией фронта составило 15,0 см, Пятно исследуемого раствора находилось в зоне 10,5-10,7 см (Рт 0,70).

Из 100 г воздушно-сухого сапропеля бы- ло выделено с помощью предлагаемого способа 25 мГ эстрогенов. Биологическая активность полученных эстрогенов была проверена на белых мышах. Сравнение проводилось с фолликулином, который в весо- вом количестве равнялся также 25 мГ. Опыты показали, что биологическая активность выделенных эстрогенов превышает биологическую активность фоликулина.

По сравнению с прототипом, предлага- емый способ извлечения эстрогенов из лечебных грязей является более эффективным. Прежде всего эффективность способа повышается благодаря тому, что в качестве исходного продукта для извлече- ния эстрогенов используют сапропель, который на порядок больше содержит органических веществ, чем минеральные грязи, а именно в 100 г минеральной грязи содержится 3,0 % органических веществ, в то

время как в 100 г сапропеля - 80% органических веществ. Это уже заранее обуславливает повышенную концентрацию эстрогенов в конечном продукте способа, что повышает его эффективность, по сравнению с прототипом, Кроме того, благодаря тому, что сапропеле- используют воздушно- сухой, исключаются примеси, содержащиеся в отстойных ведях, к присутствуют в жидком сапропеле.

Уменьшение примесей в воздушно-сухом сапропеле достигается и благодаря iO- му, что перед э -тракцпей сапропепь подвергают кис/ют ному гидролизу, что приводит к разрушению карбочатсз, содержащихся з сапропеле, Наиболеа пол но извлечь эстрогенные ве ества из гидролиговгнного сапропеля, по сравнению с прототипом, позволяет использование для экстракции спирто-эфирной смеси, так как зсгрогены хорошо растворяются з эфире, что также повышает эффективность способа, по сравнению с прототипом. Благодаря тому, что при разделении эстрогенов методом хроматографии в предлагаемом способе используют двукратную разгонку s системе хлороформ - зтаноп при их массовом соотношении 9:1 соответственно, удается достичь более четкого разделения трех классических эстрогенов, что также повышает эффективность предлагаемого способа, по сравнению с прототмпом.

Таким обризом, по сравнению с прототипом, предлагаемый способ извлечения эстрогенов является Ьолее эффективным. Формула изобретения Способ извлечения эстрогенов путем экстракции лечебных грязей органическим растворителем, разделения методом тонкослойной хромЈ .ографии и идентификации экстрогенов, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности разделения, в качестве лечебной грязи, используют воздушно-сухой сапропель, перед экстракцией его подвергают кислотному гидролизу соляной кислотой при соотношении 1:1, тщательно перемешивают и оставляют на сутки, после чего нагревают в течение 1 ч на аодяной бане, после остывания полученную массу трижды экстрагируют спирто-эфирной смесью при соотношении 1:1, затем полученный экстракт обезвоживают сульфатом натрия, выпаривают досуха и растворяют в этиловом спирте, а разделение проводят на незакрепленном слое окиси алюминия двукратно в системе хлороформ-зтанол 8 соотношении 9:1.