Способ определения эндогенной интоксикации Советский патент 1993 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к биохимии и медицине, касается определения эндогенной интоксикации и может быть использова- но при проведении биохимических анализов в лабораторной медицинской практике.

Целью настоящего изобретения является упрощение способа и повышение чувствительности и специфичности.

Способ осуществляют следующим образом.

Забирают 1,5 мл крови из вены больного в пробирку, содержащую в качестве антикоагулянта гепарин (2000 ед/мл) и отделяют плазму путем центрифугирования в течение 15 минут при 3000 об/мин. Отделенную плазму крови (концентрация 10 М) помещают в две пробирки по 300 мкл в каждую. В первую пробирку добавляют 2,7 мл водного раствора тиазолидин в молярном соотношении плазма крови:тиазолидин 1:2. Во вторую пробирку к плазме крови (300 мкл) добавляют 2,7 мл дистиллированной воды, доводя общий объем разбавленной водой плазмы до 3 мл. При смешивании плазмы крови с тиазолидином, последний, связываясь с сывороточным альбумином, находящимся в плазме, образует продукт, имеющий желтую окраску. Окраска развивается практически мгновенно. Затем определяют оптическую плотность смеси плазмы крови с водным раствором тиазолидина, находящейся в первой пробирке, в единицах оптической плотности (Д) колориметрическим методом, например, при помощи спектрофотометра в интервале длин волн 400-450 нм, фиксируя максимум пика на длине волны 425 нм. В качестве кюветы сравнения использовали раствор плазмы разбавленной воды. Оптическую плотность разбавленной водой плазмы крови, находящейся во второй пробирке дополнительно измеряют на длине волны 280 нм, так как оптическая плотность (Д28о) на длине волны 280 нм пропорциональна концентрации белков плазмы, в том числе и главного по весу белка плазмы - сывороточного альбумина. Количественную оценку интенсивности поглощения тиазолидина, связавшегося с сывороточным альбумином плазмы крови с образованием продукта желтой окраски, отнесенное к единице оптической плотности на 280 нм, выражают в условных единицах отношением Д425/Д280, где Д425 - оптичеЁ

00

1ЧЭ

о

CJ

Јь

екая плотность смеси плазмы крови с тиазо- лидином на длине волны 425 нм (максимум поглощения); Даво - оптическая плотность разбавленной водой плазмы крови на длине волны 280 нм. Значения Д425/Д280 сравнивают с такими же значениями (Д425/Д280) для здоровых людей и по результатам сравнения определяют эндогенную интоксикацию, учитывая, что по данным авторов между тяжестью эндотоксикоза по клиническим про- явлениям и интенсивностью окраски плазмы крови в смеси с тиазолидином существует обратно пропорциональная зависимость. При тяжелом эндотоксикозе интенсивность окраски смеси плазмы крови с тиазолидином снижается в несколько раз, т.е. оптическая плотность плазмы крови больных лиц с наличием эндогенной интоксикации в смеси с тиазолидином ниже этого же показателя для здоровых лиц (доноров) (см.табл. 1-4).

В предлагаемом способе определения эндогенной интоксикации на этапе отработки оптимальных его параметров было установлено, что наилучший эффект от использования заявляемого способа регистрировался при добавлении к плазме крови тиазолидина в молярном соотношении плазма крови : тиазолидин 1:2 и при измерении оптической плотности на длине волны 400-450 нм. Избытки тиазолидина меньше 2-кратного по отношению к белку плазмы в смеси плазма крови - тиазолидин ведут к снижению интенсивности окраски смеси, что отрицательно влияет на чувствительность способа. А избытки тиазолидина больше 2-кратного по отношению к белку плазмы в смеси плазма крови - тиазолидин не приводят к увеличению окраски смеси и ведут к частичному осаждению тиазолидина в связи с ограничением его растворимости.

Измерения оптической плотности смеси на длине волны ниже 400 нм и выше 450 нм ведут к недостаточной интенсивности поглощения. Ввиду того, что интервал длин волн интенсивности поглощения невелик и возможность проведения измерения оптической плотности смеси плазма крови - тиазолидин при его граничных значениях очевидна, авторы приводят два примера осуществления способа с наиболее оптимальным параметром длины волны интенсивности поглощения, именно 425 (максимум поглощения).

Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения с получе- нием положительного эффекта при использовании всей совокупности существенных признаков изобретения, указанной в его формуле.

Пример 1. Больной Р., 44 года поступил на стационарное лечение в Грод ненскую областную клиническую больниц1 с диагнозом: САХАРНЫЙ ДИАБЕТ, КЕТОА

ЦИДОЗ.

Наряду с общеклиническими исследо ваниями проводят исследование на наличие эндогенной интоксикации. Из вены больного забирают 1,5 мл крови и путем центрифу

гирования в течение 15 мин при ЗООС об/мин отделяют плазму. Отделенную плазму (концентрация М) помещают в две пробирки по 300 мкл в каждую. В первук: пробирку, добавляя 2,7 мл водного растворе

тиазолидина (концентрация 2-10 М), получают молярное соотношение плазма крови : тиазолидин 1:2. Во вторую пробирку к плазме крови (300 мкл) добавляют 2,7 мл дистиллированной воды, доводя общий объем разбавленной водой плазмы до 3 мл. После смешивания плазмы крови с тиазолидином (первая пробирка) и разбавления плазмы крови водой (вторая пробирка) определяют оптические плотности смеси плазМа крови - тиазолидин и разбавленной водой плазмы крови на спектрофотометре. Для смеси плазма крови - тиазолидин (первая пробирка) получают показатель оптической плотности, зафиксировав максимум

пика поглощения для дифференцированного спектра на длине волны 425 нм, равный Д425 0,163. А для разбавленной водой плазмы крови (вторая пробирка) показатель оптической плотности на длине волны 280

нм, равен Д280 5,82. Находят отношение Д425/Д280, равное 0,163:5,82 0,028, характеризующее интенсивность поглощения ти- азолидина, отнесенного к единице оптической плотности на длине волны 280

нм. У здоровых лиц отношение показателя оптической плотности смеси плазма крови- тиазолидин на длине волны 425 нм к показателю оптической плотности разбавленной водой плазмы крови на длине волны 280 нм

характеризуется следующим значением Д425/Д280 0,039 ± 0,0055 (см.табл.2, в которой представлены показатели оптической плотности плазмы крови здоровых людей - доноров).

Полученные данные свидетельствуют о наличии эндогенной интоксикации.

Пример 2. Больной Б., 38 лет, поступил на стационарное лечение в Гродненскую областную клиническую больницу с

диагнозом: ХРОНИЧЕСКИЙ ПОЛИНЕВРИТ. САХАРНЫЙ ДИАБЕТ.

Наряду с общеклиническими исследованиями проводят исследование на наличие эндогенной интоксикации. Забор крови, выделение плазмы, добавление к плазме крови тиазолидина в молярном соотношении плазма крови : тиазолидин 1:2, на длине волны 425 нм, на которой фиксируется максимум пика поглощения, и сравнение ре- зультатов с нормой проводят способом идентичным способу, описанному в примере 1. Показатель оптической плотности смеси плазма крови - тиазолидин на длине волны 425 нм равен Д425 0,12. Для разбав ления водой плазмы крови показатель оптической плотности на длине волны 280 нм равен Да80 6,22. Отношение Д425/Д280 равно 0,12:6,22 0,019. Сравнивая полученные данные (0,019), характеризующие интенсив- ность поглощения тиазолидина, отнесенного к единице оптической плотности на длине волны 280 нм с аналогичными данными для здоровых людей (Д425/Д280 0,039± ± 0,0055),свидетельствуем о наличии выра- женной эндогенной интоксикации.

Предлагаемый способ определения эндогенной интоксикации применен у 37 больных с различными заболеваниями (см.табл.1). У всех больных отмечается сни- жение показателя оптической плотности плазмы крови с тиазолидином, зафиксированного на 425 нм, по сравнению с этим же показателем для здоровых людей, что свидетельствует о высокой специфичности это- го способа. Ни у одного донора (см.табл.2) показатель оптической плотности Д425 смеси плазма крови - тиазолидин не лежит в

области 0,1 Д, в которой фиксируются фоновые поглощения веществ, присутствующие в плазме, что свидетельствует о высокой чувствительности способа.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять эндогенную интоксикацию, исключив влияние на результаты исследования среднемолекулярной массы ряда гормонов, фосфолипидов, ферментов, витаминов, антибиотиков и др., повышение продукции которых при заболеваниях, травмах и т.д. является жизненной необходимостью, что повышает специфичность способа. Кроме того, предлагаемый способ значительно быстрее известного за счет отсутствия операции фракционирования методом гель-фильтрации для выделения высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций, что упрощает способ и расширяет возможности его применения для экспресс- определения эндогенной интоксикации. Формула изобретения Способ определения эндогенной интоксикации, включающий взятие пробы крови, получение плазмы с последующей спектро- фотометрией, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения чувствительности способа к плазме добавляют тиазолидин в конечной концентрации 2 М, а оптическую плотность измеряют при 425 нм, и при снижении этого показателя по сравнению с контролем определяют эндогенную интоксикацию.

Таблица I.

Таблица2

Использование: медицина, биохимия. Цель - упрощение, повышение чувствительности способа. Сущность изобретения: из вены больного берут пробу крови, отделяют плазму, добавляют к плазме 2 -КГ4 М водный раствор триазолидина в соотношении 1:2 с последующей спектрофотометрией в интервале длин волн 400-500 нм с максимумом пика при 425 нм и при снижении оптической плотности в сравнении с контролем определяют эндогенную интоксикацию. 4 табл.

Д425/Д280 38,9± 5,5 10

ТаблицаЗ

Среднее значение М 0,013 ±0,004

,-11

М 0,56 ±0,10 Уровень значимости Р 0,0025

Коэффициент корреляции между значениями гр. 5 и гр.6N -0,66

Р 0,026

Продолжение табл.3

±0,

,-11

11

Т а б л иц а 4