Способ оценки эндогенной интоксикации у животных Российский патент 2024 года по МПК G01N33/52 G01N33/96 G01N33/49 

Изобретение относится к ветеринарии и может применяться для определения величины эндогенной интоксикации у животных.

Известен способ диагностики степени эндотоксикоза [Степанова И.П., Дмитриева Л.М., Патюков А.Г., Высокогорский В.Е., Атавина О.В. Способ оценки эндотоксикоза организма// Патент на изобретение RU 2257576 C2, 27.07.2005. Заявка № 2003122548/15 от 18.07.2003.], включающий исследование плазмы крови на содержание ВНСММ и общей концентрации альбуминов, при этом дополнительно определяют содержание ВНСММ в эритроцитах крови, ЛИИ и рассчитывают индекс интоксикации (ИИ) по формуле:

где S238-298(плазма), S238-298(эритроциты) - содержание ВНСММ плазмы и эритроцитов крови соответственно, усл. ед.;

ОКА - общая концентрация альбуминов плазмы крови, г/л;

ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации, усл. ед.,

К недостаткам способа можно отнести необходимость разделения плазмы крови и эритроцитарной массы, определения концентрации альбуминов в плазме, лейкоцитарного индекса интоксикации, который устанавливают путем рутинного подсчета лейкоцитарной формулы. К тому же, лейкоцитарный профиль у разных видов животных не одинаков, что может существенным образом влиять на показатели эндотоксикоза, поэтому данный подход не может быть универсальным для всех видов животных.

Известен способ определения эндогенной интоксикации по содержанию в крови веществ низкой и средней молекулярной массы [Рубцов Г.К., Безручко Н.В., Генгин М.Т., Васильков В.Г., Борисова Е.Ю., Анопин К.Д., Васильева А.Д., Садовникова Д.Г., Козлова Г.А., Кручинина А.Д., Гамзин С.С. Способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче// Патент на изобретение RU 2525437 C1, 10.08.2014. Заявка № 2012153044/15 от 07.12.2012.], в котором плазму крови освобождают от высокомолекулярных белков кипячением с последующим центрифугированием, затем выполняют спектрофотометрирование водного раствора супернатанта в диапазоне длин волн от 200 до 330 нм.

Недостатком способа можно считать так же необходимость разделения плазмы и эритроцитарной массы, потребность в кипячении проб, вследствие чего происходит разрушение некоторых высокомолекулярных соединений, что искажает истинную концентрацию ВНСММ.

Известен способ оценки степени эндотоксикоза [Гаврилов В.Б., Бидула М.М., Фурманчук Д.А., Конев С.В., Алейникова О.В. Оценка интоксикации организма по нарушению баланса между накоплением и связыванием токсинов в плазме крови// Клиническая лабораторная диагностика - 1999. - №2. - С.13-17] с использованием данных о содержании в плазме крови ВНСММ и общей концентрации альбуминов, по которым рассчитывают критерии интоксикации (КИ) по формулам:

KH1=1000* (D254/OKA)

КИ2=1000* (D280/OKA),

где D254, D280- содержание ВНСММ, определяемое по показателям оптической плотности плазмы при длинах волн 254 и 280 нм (усл. ед.);

ОКА - общая концентрация альбуминов плазмы крови (г/л).

К недостаткам метода можно отнести необходимость получения плазмы крови, определении в ней альбуминов и отсутствие учета абсорбции ВНСММ эритроцитами.

Существует способ определения уровня эндогенной интоксикации (прототип) [Малахова М. Я. Метод регистрации эндогенной интоксикации: Пособие для врачей. СПб, 1995. С. 34.], путем определения концентрации ВНСММ в плазме и эритроцитарной массе после осаждения высокомолекулярных соединений 15% раствором трихлоруксусной кислоты, спектрометрии полученного супернатанта в спектре длин волн 310…238 нм и вычислении площади под кривой.

К недостаткам метода можно отнести необходимость разделения крови на плазму и эритроцитарную массу. Так же, при оценке содержания ВНСММ в эритроцитарном осадке не учитывается концентрация форменных элементов крови, что существенно может влиять на содержание ВНСММ в супернатанте и приводит к получению не достоверных данных.

Технический результат состоит в упрощении способа оценки за счет отсутствия этапа разделения крови на плазму и эритроцитарную массу, а также в повышении эффективности оценки за счет исключения погрешности, связанной с вариабельностью плотности эритроцитарной массы при ее получении.

Технический результат достигается тем, что способ оценки эндогенной интоксикации у животных, включающий определение концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы, расчёт критериев и суждение о наличии эндотоксикоза, согласно изобретения, в качестве исследуемого материала используют цельную кровь, при этом в ней предварительно устанавливают концентрацию эритроцитов и показатель гематокрита, после чего крупномолекулярные соединения коагулируют 15% раствором ТХУ, центрифугируют и получают супернатант, в отделенном супернатанте определяют оптическую плотность при ультрафиолетовом спектре длин волн и определяют концентрацию ВНСММ в цельной крови, полученные цифровые значения по содержанию ВНСММ в цельной крови пересчитывают с учетом концентрации эритроцитов и показателя гематокрита, определяют насыщенность эритроцитов и процентный объем эритроцитов ВНСММ, с использованием следующих формул:

,

где ВНСММОЭ - вещества низкой и средней молекулярной массы в процентном объеме эритроцитов, усл.ед., ГК - показатель гематокрита, %.

,

где ВНСММЭ - вещества низкой и средней молекулярной массы в пересчете на 10 млрд. эритроцитов, усл.ед., RBC - концентрация эритроцитов на литр крови 10¹²,

при повышении значений более чем на 10% по отношению к показателям здоровых животных судят о наличии патологии и интоксикации организма животного.

Способ осуществляется следующим образом.

Сущность изобретения состоит в том, что выраженность метаболической интоксикации устанавливают по концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ) в цельной крови, которые главным образом абсорбируются на эритроцитарных белках. По отношению к прототипу используется схожий подход - определение концентрации ВНСММ в крови после осаждения крупномолекулярных соединений раствором ТХУ. Существенным отличием является то, что кровь не разделяют на плазму и эритроцитарную массу, при этом предварительно изучают гематологические показатели крови, а цифровые значения оптической плотности полученного супернатанта пересчитывают с учетом гематокрита и концентрации эритроцитов.

Технически предложенный способ включает следующие этапы:

1) в пробе стабилизированной крови с использованием автоматического гематологического анализатора определяют концентрацию эритроцитов и показатель гематокрита;

2) в пробирку Эппендорфа объемом 2 мл набирают 0,6 мл крови, 0,6 мл физиологического раствора или дистиллированной воды и добавляют 0,6 мл 15% раствора ТХУ (то есть в соотношении 1:1:1), смесь гомогенизируют в ультразвуковой ванне или на вортекс-шейкере в течение 5-10 минут, затем центрифугируют при 10 тыс. об. в течение 10 минут;

3) после осаждения преципитата, отсасывают 0,6 мл супернатанта и в стеклянных пробирках разводят 5,4 мл дистиллированной воды (разведение 1:9);

4) с использованием кварцевых кювет на спектрофотометре проводят определение оптической плотности полученного раствора в диапазоне длин волн 298…238 нм с шагом 4 нм (возможны и другие варианты шага: 2, 6, 8, 10 нм). В качестве контроля, по отношению к которому оценивают изменение оптической плотности, используют 1,5% раствор ТХУ на дистиллированной воде (15% раствор ТХУ разводят дистиллированной водой 1:9);

5) показатели оптической плотности при разных длинах волн суммируют и умножают на величину шага, высчитывая площадь под кривой. Полученный цифровой результат отражает концентрацию ВНСММ в цельной крови (ВНСММК) условных единиц (усл.ед.);

6) определяют насыщенность эритроцитов и процентного объема эритроцитов ВНСММ, с использованием следующих формул:

,

где ВНСММОЭ - вещества низкой и средней молекулярной массы в процентном объеме эритроцитов, усл.ед., ГК - показатель гематокрита, %.

,

где ВНСММЭ - вещества низкой и средней молекулярной массы в пересчете на 10 млрд. эритроцитов, усл.ед., RBC - концентрация эритроцитов на литр крови 10¹².

В отличие от указанных аналогов, разработанный метод имеет следующие преимущества и отличия:

1. В качестве исследуемого материала используют цельную кровь, т.е. отсутствует этап разделения крови на плазму и эритроцитарную массу;

2. Перед осаждением крупномолекулярных соединений в стабилизированной крови с использованием гематологического анализатора устанавливают концентрацию эритроцитов и показатель гематокрита;

3. Полученные цифровые значения по содержанию ВНСММ в цельной крови пересчитывают с учетом концентрации эритроцитов и показателя гематокрита, что исключает погрешности, связанные с вариабельность плотности эритроцитарной массы при ее получении.

Пример 1.

Была проведена оценка уровня эндогенной интоксикации у коров с признаками кетонемии путем определения ВНСММ в эритроцитарной массе по М.Я. Малаховой и в цельной крови разработанным способом. Для этого получили кровь от клинически здоровых (n=10) и с признаками кетоза (содержание β-оксимаслянной кислоты более 1,2 ммоль/л) животных. Как известно, кетонемия у коров сопровождается выраженными метаболическими нарушениями, интоксикацией и накоплением в крови низкомолекулярных соединений. Результаты исследований показаны в таблице 1.

Таблица 1. Концентрация ВНСММ в крови у здоровых и больных кетозом коров, усл. ед. Показатель Здоровые (n=10) Больные (n=10) По М.Я. Малаховой ВНСММЭМ 22,8±0,7 26,2±0,7^** Разработанный способ ВНСММК 8,6±0,4 10,5±0,3^** ВНСММОЭ 23,2±0,7 38,4±5,4^** ВНСММЭ 128,1±5,6 165,5±5,5^*** **P≤0,01; ***P≤0,001 достоверно по отношению к здоровым животным

Установлено, что концентрация ВНСММ в эритроцитарной массе (ВНСММЭМ) у больных коров была выше на 14,9% (P≤0,01) по сравнению с клинически здоровыми животными (табл. 1). Концентрация ВНСММ в цельной крови (ВНСММК) у больных животных была выше на 22,1% (P≤0,01), в пересчете на процентный объем эритроцитов (ВНСММОЭ) на 65,5% (P≤0,01), а на 10 млрд. эритроцитов (ВНСММЭ) на 29,2% (P≤0,001).

Пример 2.

Была проведена сравнительная оценка уровня эндогенной интоксикации у коров с нормальным течением послеродового периода (n=10), острым гнойно-катаральным эндометритом (n=10) и метритом, возникшим на фоне задержания последа (n=10). Результаты исследований показаны в таблице 2.

Таблица 2. Показатели эндотоксикоза у коров с нормальным течением послеродового периода и с акушерской патологией, усл.ед. Показатель С нормальным течением (n=10) Эндометрит (n=10) Метрит после задержание последа (n=10) По М.Я. Малаховой ВНСММЭМ 32,3±1,0 37,8±1,3^** 43,3±1,0^*** Разработанный способ ВНСММК 11,1±0,4 13,8±0,3^*** 17,1±1,4^*** ВНСММОЭ 35,1±0,9 47,3±1,6^*** 49,2±1,6^*** ВНСММЭ 197,0±5,4 227,0±4,7^*** 254,3±8,2^*** **P≤0,01; ***P≤0,001 достоверно по отношению к здоровым животным

Концентрация ВНСММЭМ у коров с послеродовым гнойно-катаральным эндометритом после нормального течения родового процесса определенная по методике М.Я. Малаховой (табл. 3) была выше на 17,0% (P≤0,01), тогда как предложенный метод характеризовался более высокими различиями. Так концентрация ВНСММК была выше на 23,4% (P≤0,001), ВНСММОЭ на 34,8% (P≤0,001), ВНСММЭ на 15,2% (P≤0,001) по сравнению с животными, которые не имели акушерской патологии. Уровень эндотоксикоза у коров с признаками воспаления матки, возникшими на фоне задержания последа, характеризовался увеличением ВНСММ в эритроцитарной массе на 34,1% (P≤0,001), ВНСММК на 54,1% (P≤0,001), ВНСММОЭ на 40,2% (P≤0,001), ВНСММЭ на 29,1% (P≤0,001).

Пример 3.

Третья серия экспериментов включала кровь от клинически здоровых северных оленей (n=10) и с интенсивной эдемагенозной инвазией (n=10). Результаты анализа показаны в таблице 3.

Таблица 3. Концентрация ВНСММ (усл.ед.) в крови, определенная традиционным и разработанным способом у здоровых северных оленей и с оводовой инвазией. Показатель Здоровые (n=10) Больные (n=10) По М.Я. Малаховой ВНСММЭМ 36,4±1,7 40,3±0,8^* Разработанный способ ВНСММК 13,7±0,5 15,6±0,4^* ВНСММОЭ 25,1±0,6 29,6±0,9^*** ВНСММЭ 132,6±5,6 154,6±4,4^** *P≤0,05; **P≤0,01; ***P≤0,001 достоверно по отношению к здоровым животным

Установлено, что при оводовой инвазии концентрация ВНСММЭМ характеризовалось увеличением показателя на 10,7% (P≤0,05), а концентрации ВНСММ в цельной крови на 14,6% (P≤0,05). При пересчете показателя с учетом гематокрита крови, различия между здоровыми и инвазированными оленями составили 17,9% (P≤0,001), а в пересчете на единицу эритроцитов - 16,6% (P≤0,01).

Таким образом, можно заключить, что предложенный способ позволяет эффективно определять величину эндогенной интоксикации у животных. Изобретение является более чувствительным способом оценки уровня эндотоксикоза, что подтверждается более значимой разницей показателей между больными и здоровыми животными. Повышение значений более чем на 10% по отношению к показателям здоровых животных свидетельствуют о наличии патологии и интоксикации организма.

Изобретение относится к медицине, а именно к ветеринарии, и может быть использовано для оценки эндогенной интоксикации у животных. В качестве исследуемого материала используют цельную кровь, при этом в ней предварительно устанавливают концентрацию эритроцитов и показатель гематокрита, после чего крупномолекулярные соединения коагулируют 15% раствором ТХУ, центрифугируют и получают супернатант. В супернатанте определяют оптическую плотность и концентрацию веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ). Полученные цифровые значения по содержанию ВНСММ в цельной крови пересчитывают с учетом концентрации эритроцитов и показателя гематокрита. Определяют ВНСММ в процентном объеме эритроцитов и в пересчете на 10 млрд. эритроцитов, и при повышении их значений более чем на 10% по отношению к показателям здоровых животных судят о наличии патологии и интоксикации организма животного. Способ обеспечивает упрощение и повышение эффективности оценки эндогенной интоксикации у животных за счет отсутствия этапа разделения крови на плазму и эритроцитарную массу и исключения погрешности, связанной с вариабельностью плотности эритроцитарной массы при ее получении. 3 табл., 3 пр.

Способ оценки эндогенной интоксикации у животных, включающий определение концентрации веществ низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ), расчёт критериев и суждение о наличии эндотоксикоза, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют цельную кровь, которую не разделяют на плазму и эритроцитарную массу, при этом в ней предварительно устанавливают концентрацию эритроцитов и показатель гематокрита, после чего крупномолекулярные соединения коагулируют 15% раствором ТХУ, центрифугируют и получают супернатант, в отделенном супернатанте определяют оптическую плотность при ультрафиолетовом спектре длин волн и определяют концентрацию ВНСММ в цельной крови (ВНСММК), полученные цифровые значения по содержанию ВНСММ в цельной крови пересчитывают с учетом концентрации эритроцитов и показателя гематокрита, определяют насыщенность эритроцитов и процентный объем эритроцитов ВНСММ, с использованием следующих формул:

,

где ВНСММОЭ - вещества низкой и средней молекулярной массы в процентном объеме эритроцитов, усл.ед., ГК - показатель гематокрита, %,

,

где ВНСММЭ - вещества низкой и средней молекулярной массы в пересчете на 10 млрд. эритроцитов, усл.ед., RBC - концентрация эритроцитов на литр крови 10¹²,

при повышении значений более чем на 10% по отношению к показателям здоровых животных судят о наличии патологии и интоксикации организма животного.