Способ получения человеческого инсулина Советский патент 1993 года по МПК A61K37/26 

жащем на 1 моль предшественника человеческого инсулина приблизительно 0,1-10 моль одного или более иона металла из числа тех металлов, которые имеют порядковые номера 21-34, 39-52, 57-84 и 89-92.

Способ применяется к предшественникам человеческого инсулина вышеупомянутой формулы, наиболее предпочтительным из которых является сам человеческий инсулин.

Термин предшественник человеческого инсулина относится к молекуле, которая, во-первых, содержит А-цепь человеческого инсулина и В-цепь человеческого инсулина; во-вторых имеет по крайней мере три ди- сульфидн- е связи, представленные соединением серы каждой из частей Cys, расположенных в А- и В-цепях у (а) А-6 и А-11, (б) А-7 и В-7 и (в) А-20 и В-19 соответственно, и, в-третьих, имеет отщепляемую соединительную часть, которая присоединена к А-цепи человеческого инсулина у аминогруппы А-1 и к В-цепи человеческого инсулина у карбоксильной группы В-30.

Группа R представляет собой водород, аминокислотный остаток или пептидную часть, имеющую по крайней мере два аминокислотных остатка. В тех случаях, когда R представляет собой аминокислотный остаток или пептидную часть, R обозначает груп- пу, отщепляемую от продукта предшественника инсулина без потери целостности остаточной структуры инсулина. Из большого разнообразия аминокислотных остатков или пептидных частей любые квалифицируются в пределах определения группы R, Примерами расщепляемых аминокислотных остатков являются основные аминокислоты, такие, как аргинин (Arg) или лизин (Lys), а также пептидные части, заканчивающиеся у карбоксильной группы такими аминокислотными остатками. Они признаны как чувствительные к расщеплению при обработке протеолитическим ферментом трипсином, Другим примером расщепляемого аминокислотного остатка является метионин (Met), а также пептидная часть, имеющая Met у его карбоксильного окончания. Они могут отщепляться посредством обработки вианогенбромидом. Другим примером является триптофан (Тгр) или пептидная часть, содержащая Тгр у его карбоксильного окончания. Он отщепляется при обработке М-бромсукцинимидом.

Группа RI представляет собой гидро- ксил, аргинин, лизин или пептид, имеющий аргинин или лизин в его аминоконце. Когда RI представляет собой аргинин, лизин или пептид, имеющий любой из этих остатков в

его аминоконце, аминокислота или пептид будут отщепляться в условиях предлагаемого способа с образованием продукта, в котором RI представляет собой гидроксил.

Соединительной частью X предшественника инсулина может быть любая из широкого круга структур. Предпочтительно частью X является полипептид. Полипептид, как правило, содержит по крайней мере 2,

предпочтительно 2-35, наиболее предпочтительно 6-35 аминокислотных остатков. Часть X присоединена к А-цепи у аминогруппы положения А-1 и к В-цепи у карбоксильной группы положения В-30. Наиболее

предпочтительно, если соединительной частью X, когда это пептид, является природный соединительный пептид человеческого проинсулина, имеющий формулу

-Arg-Arg-Glu-Ala-Alu-Asp-Leu-Glr-V

al-Gle- Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro- Gly-Ala- Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala- Leu-Glu-Gly-Ser-Len-G n-l ys-Arg-.

Хотя предпочтительно использовать природную соединительную последова

тельность, приведенную выше, для соединительного пептида могут быть использованы более короткие пептидные последовательности. Единственным требованием является то, чтобы они имели доста0 точную длину для возможности образования правильной дисульфидной связи между А- и В-цепями и чтобы они были отщепляемыми от предшественника инсулина с сопровождающимся образованием

5 инсулина. Типичным дипептидом, который может быть использован, является -Arg- Arg-. Кроме того, могут быть использованы модификации вышеупомянутого дипептида, имеющие формулы -Arg-X 0 Arg-, где X представляет собой по крайней мере один аминокислотный остаток. Весьма предпочтительными соединительными пептидами являются -Arg-Arg-Lys- Arg-, а также пептиды с более длинной

5 цепью, имеющие структуру -Arg-Arg-X2- Lys-Hrg-, где X2 представляет собой по крайней мере один аминокислотный остаток, и предпочтительно, по крайней мере два аминокислотных остатка. Эти послед0 ние включают природный соединительный пептид. .

Способ осуществляют в водной среде. Термин водная среда подразумевает присутствие воды; однако он не исключает при5 сутствия органических растворителей, смешивающихся с водой, таких, как метанол, этанол, ацетон, N, N-диметилформамид и т.п. Предшественник человеческого инсулина присутствует в водной среде при концентрации приблизительно до 2 мМ.

Предпочтительно, если концентрация предшественника человеческого инсулина значительно ниже, приблизительно в пределах 0,1-10 мМ; более предпочтительная концентрация приблизительно 0,5-5 мМ; наиболее предпочтительна концентрация приблизительно 1-3 мМ.

Превращение осуществляют при любой температуре из широкого диапазона температур, как правило приблизительно при 0-40°С. Предпочтительно реакцию осуществляют при температуре приблизительно 4-25°С, наиболее, предпочтительно при температуре приблизительно 10-15°С.

рН реакционной смеси может варьироваться в диапазоне приблизительно 4-12. Лучшие результаты достигаются при тщательном контроле рН, так чтобы реакция осуществлялась при рН в диапазоне приблизительно 6-9, предпочтительно 7-8, при точном регулировании приблизительно 7,2- 7,6.

Регулирование рН, как правило, проводят с использованием буферного вещества. Может быть применен в любой из широкого круга типичных буферов. Примерами пригодных буферов являются TPI трис(гидро- кси мети л)амин омета н, этилен диамин, триэтаноламин, глицин, HEPES (N-2-гидро- ксиэтилпиперазин-М1-2-этанульфоновая кислота) и т.п.

Количество трипсина и карбоксипепти- дазы В, обычно используемое в способе, зависит от двух ферментов и от количества предшественника человеческого инсулина. Ферменты могут быть введены в реакционную смесь в растворе и, с использованием признанных методик, могут быть иммобили- зированы на пригодной подложке.

Карбоксипептидаза В, как правило, присутствует в количестве относительно предшественника человеческого инсулина приблизительно от 1:10 до 1:5000, предпочтительно от 1:500 до 1:3500 и наиболее предпочтительно от 1:1000 до 1:3000.

Трипсин, как правило, присутствует в количестве относительно предшественника человеческого инсулина приблизительно от 1:20 до 1:250000, предпочтительно приблизительно от 1:20 до 1:250000, предпочтительно приблизительно от 1:300 до 1:20000 и наиболее предпочтительно приблизительно от 1:5000 до 1:15000.

Отношение карбоксипептидазы В к трипсину в реакционной смеси также представляет собой важный параметр. Как правило, отношение карбоксипептидазы В к трипсину составляет приблизительно от 1:1 до 10:1 и предпочтительно от 2:1 до 5:1.

Установлено, что присутствие определенного количества одного иона металла или более из широкого круга ионов металла значительно уменьшает количество DesThr(B30)-h1, образующееся во время реакции.

Хотя чрезвычайно предпочтительны ионы определенных металлов, обнаружено, что пригоден широкий круг таких ионов.

0 Металлы ионы которых могут быть использованы, следующие: скандий, Sc, титан Ti, ванадий V, хром Сг, марганец Мп, железо Fe, кобальт Со, никель Ni, медь Си, цинк Zn, галлий Ga, германий Ge, мышьяк As, селен

5 Se, иттрий Y, цирконий Zr, ниобий Nb, молибден Мо, технеций Тс, рутений Ru, родий Rh, палладий Pd, серебро Ад, кадмий Cd, индий In, олово Sn, сурьма Sb, теллур Те, лантан La, церий Се, празеодим Рг, неодим

0 Nd, прометий Рт, самарий Sm, европий Ей, гадолиний Gd, тербий ТЬ, диспрозий Dy, гольмий Но, эрбий Ег, тулий Тт, иттербий Yb, лютеций Lu, гафний Hf, тантал Та, вольфрам W, рений Re, осмий Os, иридий Ir,

5 платина Pt, золото Аи, ртуть Нд, таллий TI, свинец РЬ, висмут Bi, полоний Ро,актиний Ас, торий Th, протактиний Ра и уран U.

Хотя ионы любого из вышеперечисленных металлов могут быть использованы в

0 предлагаемом способе, чрезвычайно предпочтительными подклассами сужающегося объема и потому повышенного предпочтительно являются следующие:

(1)хром, молибден, вольфрам, ртуть, 5 сурьма, висмут, никель, железо, кобальт,

цинк, кадмий, медь, олово, свинец, европий, уран, платина и марганец;

(2)никель, железо, кобальт, цинк, кадмий, медь, олово, свинец, европий, уран,

0 платина и марганец;

(3)никель, цинк, кобальт и кадмий;

(4)никель и цинк;

(5)никель.

В соответствии с настоящим способом 5 ионы одного или более вышеперечисленных металлов добавляют в реакционную смесь предшественника человеческого инсулина. Количество ионов из числа упомянутых металлов в совокупности, присутствующей в 0 реакционной смеси, составляет приблизительно 0,1-10 моль на моль предшественника человеческого инсулина. Используемое фактическое количество предпочтительно находится у нижней границы вышеприве- 5 денного интервала и, как правило, составляет приблизительно 0,1-2 моль на моль предшественника человеческого инсулина. Наиболее предпочтительное количество составляет приблизительно 0,3-1 моль на моль предшественника человеческого инсулина и идеально - приблизительно 0,33-0,6 моль на моль предшественника человеческого инсулина.

Реакцию конверсии обычно осуществляют в течение 2-48 ч, как правило 8-16 ч. Реакцию можно контролировать посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии; время реакции тщательно координируют с получением человеческою инсулина,

Неожиданным является то, что количество произведенного Des-Thr(B30)-h1 может быть уменьшено посредством введения в реакционную смесь одного или более ионов металла из другого класса металлов, Э: i дополнительное усовершенствование очевидно, в частности, когда количество первого иона металла составляет интервал приблизительно 0,1- 0,6 моль на моль предшественника человеческого инсулина, В высшей степени благоприятно добавлять ионы металла, выбранного из группы, состоящей из бериллия Be, магния Мд, кальция Са, стронция Sr, бария Ва, радия Ra, предпочтительно ионы кальция, бария, стронция или магния и наиболее предпочтительно ионы кальция.

Количество второго иона металла варьируется приблизительно от 0,5 - до 5 моль на моль предшественника человеческого инсулина, предпочтительно от 1 до 2 моль на моль предшественника человеческого инсулина.

Способ осуществляют путем растворения предшественника человеческого инсулина в водной среде. Конечная смесь как правило, имеет концентрацию приблизительно 1-3 мМ и рН около 8. Затем добавляют ион металла второго класса (если таковой используется). Обычно CaCIa добавляют до концентрации около 5 мМ, когда используется вышеприведенная концентрация предшественника человеческого инсулина. Ион металла первого класса, обычно Ni (II), затем прибавляют до концентрации около 0,5 моль на моль предшественника человеческого инсулина, рН смеси доводят до 7,3- 7,5 и добавляют карбоксипептидазу В (около 1:2500 от массы предшественника человеческого инсулина) с последующим добавлением трипсина (около 1:12500 от массы предшественника человеческого инсулина). Реакцию продолжают, поддерживая температуру смеси около 12°С. Продвижение реакции тщательно контролируют посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Человеческий проинсулин (hP1) растворяют в 20 мМ буферного раствора этилендиамина (ЭДА), рН 7,0, при концентрации 10,85 г/л. Смесь разделяют на

две порции. К первой порции прибавляют свиную панкреатическую карбоксипептидазу В (СрВ) до конечной концентрации 3,74 мг/л. Этот раствор разделяют на шесть од- номиллилитровых аликвот, после чего при0 бавляют бычий панкреатический трипсин, ранее обработанный тазилфенилаланилх- лорметилкетоном (трипсин-ТФХК), при кон- центрацях 1,0; 1,4; 1,8; 2,8; 3,6 и 5,4 мг/л соответственно. Каждый образец инкубиру5 ют в течение 8 ч при 23°С. Уровни Des- Phr(B30)-h1 (см.табл.1) определякг высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Вторую порцию раствора hP1 разделя0 ют на пять одномиллилитровых аликвот. СрВ прибавляют до концентрации 1,1; 1,5; 2,2; 3,7 и 5,4 мг/л соответственно. Затем к каждой аликвоте прибавляют трипсин- ТФХК до концентрации 2,71 мг/л. Каждый

5 образец инкубируют в течение 8 ч при 23°С. Результаты приведены в табл.2.

В табл.1, 2 количество DeS-Phr(BSO)- h1 выражено как процентное содержание hi, определенное высокоэффективной жид0 костной хроматографией. Как показываю1 данные, при заданных уровнях СрВ содер жание DeS-Thr(B30)-h1 снижается путем уменьшения уровней трипсина. Наоборот, при заданных уровнях трипсина повышение

5 СрВ приводит к пониженным уровням Des- Thr(B30)-h1.

Пример 2, hP1 (60 мг) растворяют в 20 мМ этилендиамина (6,0 мл), рН 7,5-8,0 Свиную карбоксипептидазу В и бычий трип

0 син-ТФХК прибавляют последовательно с получением с.оотношения субстрат (Р1):фер мент, равного 5000:1:1 по массе дл ЬР1:СрВ:трипсин-ТФХК. Двухмиллилитро- вые емкости инкубируют при температуре

5 12, 24 и 37°С в течение периодов времени необходимых для достижения максимального выхода h 1, как измерено высокоэффективной жидкостной хроматографией, т.е. 14 6 и 4 ч соответственно. Как показано Е

0 табл.3, более низкие температуры способствуют меньшему образованию Des- Thr(B30)-h1.

П р и м е р 3. hP1 (360 мг) растворяют в 20 мл 20 мМ глицина, рН 7,65. Раствор раз5 деляют на 10,0 мл аликвоты, и к одной аликвоте добавляют ион кальция при 5 мМ. Каждую аликвоту далее разделяют на три порции. Порцию из аликвоты, содержащей ион кальция, и порцию из аликвоты без содержания иона кальция обрабатывают еледующим образом. Для одной группы прибавляют ион цинка с получением относительно hP1 молярного отношения, равного 0,33. Для другой группы прибавляют ион никеля с получением относительно hP1 молярного отношения, равного 0,36. Ферменты прибавляют ко всем смесям с получением массовых соотношений лР1:СрВ:трипсин-ТФХК-13,500:5:1. рН каждой смеси доводят до 7,65-7,7, и смеси ин- кубируют при 12°С в течение 16 ч. Результаты, приведенные в табл.4, демонстрируют влияние никеля и цинка в снижении уровня образования Des-Thr(B30)-h1. Они также показывают усиление этого влияния кальцием.

Количественный анализ составляет менее обнаруживаемого предела, кдторый равен 0,20% М.

Пример 4. hP1 (245 мг) растворяют в 12,0 мл 50 мМ глицина, рН 7,4. Ион кальция прибавляют из 1 М основного раствора CaCl2 с получением конечной концентрации 5 мМ. Никель (II) из 0,11 М основного раствора NiCIa прибавляют к 2 мл аликвотам с получением одного образца с молярным отношением 0,24; 0,37; 0,44; 0,51 и 0,58. СрВ прибавляют к каждой пробирке с получением концентрации 7,4 мкг/мл (4,87 мг/мл основного раствора), после чего прибавляют трипсин-ТФХК с получением конечной концентрации 2,96 мкг/мл (1,6 мг/мл основного раствора). рН всех образцов доводят до 7,40, и каждый образец инкубируют при 12°С. Реакции прекращают через 12 ч и измеряют уровни содержания Des-Thr(B30)- Ы и hi. Результаты, приведенные в табл.5, показывают, что повышенные уровни никеля приводят к пониженному производству DeS-Thr(B30)-h1.

Пример 5. hP1 (936 мг) растворяют в 36 мл 5 мМ глицина и рН смеси доводят до 7,8-8,0. Ион кальция прибавляют как CaCl2 (1 М основной раствор) до концентрации 5 мМ. Извлекают аликвоты, каждая объемом 3 мл, и ионы различных металлов прибавляют при концентрации, приведенной в табл.6. После уравновешивания при 12°С прибавляют ферменты с получением массовых соотношений пР1:СрВ:трипсин-ТФХК- 13,500:5:1.

Образцы инкубируют при 12°С в течение 13 ч и осуществляют измерение на содержание hi и Des-Thr(B30)-h1. Результаты, приведенные в табл.6, показывают, как люиой из широкого круга ионов металла эффективен в снижении производства Des- Thr(B30)-p1.

Пример 6. hP1 (448,5 г), растворенный в 15 мМ буферном растворе глицина, рН 7,4

(33,0 л), охлаждают и сохраняют при 12°С. Кальций (II) прибавляют до концентрации 5 мМ в виде 1,0 М основного раствора CaCl2 (0,165 л). После перемешивания в течение

10 мин прибавляют никель (II) с получением молярного отношения Ni (II) : hP1, равного 0,44:1, путем прибавления твердого IMiCl2 6Н20 (5,0 г). Раствор осторожно перемешивают в течение 10 мин, и СрВ (36,8

мл, 179,4 мг) прибавляют из 4,87 мг/мл основного раствора. Затем прибавляют трипсин-ТФХК (35,9 мл, 35,9 мг) из 1,0 мг/мл основного раствора. Реакция достигает завершения через 10ч, как измеряется максимальным производством hi. При сборе смесь содержит около 0,29% Des- Tnr(B30)-h1, что приближается к пределу обнаружения данного соединения. Формула изобретения

1. Способ получения человеческого инсулина путем конверсии предшественника человеческого инсулина общей формупы

(А-1) Glu- I 3

(А-20)(А-21)

(А-6) Cus-S-S гi

(A-rnCyS--CyS--Cys-ASr -R1 S (A-11) S

(в-nss

R-HN-Phe-CysCys-Thr

(В--П(B-19)(B-30)

где R - водород, химически или фермента- тивно расщепляемый аминокислотный остаток, или химически или ферментативно расщепляемая пептидная часть, имеющая по крайней мере два аминокислотных остатка;

RI - ОН, Arg - Y, или Lys-Y, где Y - ОН,

аминокислотный остаток или пептидная часть, имеющая по крайней мере два аминокислотных остатка;

часть от А-1 до А-21 - А-цепь человеческого инсулина, часть от В-1 до В-30 и X часть, которая связана с А-цепью инсулина у аминогруппы А-1 и с В-цепью инсулина у карбоксильной группы В-30, причем, эта часть может ферментативно расщепляться без разрыва А-цепи и В-цепи,

с использованием трипсина и карбоксипеп- тидазы, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты целевого продукта, обрабатывают предшественник человеческого инсулина, находящийся в водной

среде в концентрации до 20 мМ, трипсином в количестве, составляющем в пересчете на вес предшественника человеческого инсулина от 1:2.000 до 1:15.000, и карбоксипеп- тидазой В в количестве, составляющем в пересчете на вес предшественника человеческого инсулина от 1.2.000 до 1:10.000, причем водная среда содержит на 1 моль предшественника человеческого инсулина на 0,1-10 моль ионов одного или нескольких металлов из группы, включающей Ni, Zn, Co iiCd.

2.Способ по 1,отличающийся тем, что предшественник человеческого инсулина присутствует в водной среде в концентрации 1-3 мМ.

3.Способ поп.1 илип.2,отлича ю- щ и и с я тем, что ион металла присутствует в количестве 0,33-0,6 моль на 1 моль предшественника человеческого инсулина.

4.Спогоб по пп. 1-3, отличающий- с я тем, что массовое соотношение карбок- сипептидазы В и трипсина составляет от 1:1

до 5:1.

5.Способ по пп. 1-4, отличающийс я тем, что ионом металла является ион

металла, выбираемый из группы, включающей никель и цинк.

6.Способ по п.5, отличающийся тем, что ионом металла является ион никеля.

7.Способ по пп. 1-6, отличающий- с я тем, что ионом второго металла является ион, выбираемый из группы, включающей кальций, барий, стронций и магний, добавляемый к смеси.

8.Способ по п.7, отличающийся тем, что ионам металла является ион кальция.

9.Способ по пп. 7и8, отличающий- с я тем, что ион металла присутствует в количестве около 5 моль на 1 моль предшественника человеческого инсулина.

10.Способ по пп. 1-9, отличающий- с я тем, что предшественником человеческого инсулина является человеческий про- инсулин.

Влияние повышения уровней трипсина на трансформацию hP1

Влияние повышения уровня СрВ на трансформацию hP1

Таблица 1

Таблица 2

Температурный эффект

Влияние металлов на трансформацию hP1

Влияние изменяющейся концентрации Ni(ll)

Влияние различных двухвалентных катионов

Таблица 3

Таблица 4

Таблица 5

Таблица 6

Продолжение табл. 6