В данном документе предусмотрены аналоги инсулина, содержащие по меньшей мере одну мутацию по сравнению с исходным инсулином, где аналоги инсулина содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Более чем 400 миллионов человек по всему миру страдают сахарным диабетом 1 типа или 2 типа. Сахарный диабет 1 типа лечат с помощью замещения инсулина. В отличие от сахарного диабета 1 типа, при сахарном диабете 2 типа по сути не наблюдается дефицит инсулина, но в целом ряде случаев, особенно на поздних стадиях, пациентов с сахарным диабетом 2 типа лечат инсулином.
У здорового человека высвобождение инсулина поджелудочной железой тесно связано с концентрацией глюкозы в крови. Повышенные уровни глюкозы в крови, как, например, появляющиеся после приема пищи, быстро компенсируются соответствующим увеличением секреции инсулина. В состоянии натощак уровень инсулина в плазме крови падает до базального значения, которое является достаточным для обеспечения непрерывного поступления глюкозы к чувствительным к инсулину органам и тканям и для поддержания продуцирования глюкозы в печени на низком уровне ночью. Зачастую замещение эндогенной секреции инсулина экзогенной, главным образом путем подкожного введения инсулина, не обеспечивает достижение качества физиологической регуляции уровня глюкозы в крови, описанной выше. Могут происходить отклонения уровней глюкозы в крови в сторону повышения или в сторону снижения, которые в их наиболее тяжелых формах могут представлять угрозу для жизни. Из этого следует, что улучшенная терапия сахарного диабета в первую очередь должна быть направлена на как можно более точное поддержание уровня глюкозы в крови в физиологическом диапазоне.
Человеческий инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, который разделен на 2 аминокислотные цепи: А-цепь, имеющую 21 аминокислоту, и B-цепь, имеющую 30 аминокислот. Цепи соединены между собой с помощью 2 дисульфидных мостиков. Третий дисульфидный мостик находится между остатками цистеина в положениях 6 и 11 A-цепи. Некоторые продукты, применяемые в настоящее время для лечения сахарного диабета, представляют собой аналоги инсулина, т.е. варианты инсулина, последовательность которых отличается от последовательности человеческого инсулина одной или несколькими аминокислотными заменами в А-цепи и/или в B-цепи.
Подобно многим другим пептидным гормонам, человеческий инсулин характеризуется коротким периодом полужизни in vivo. Таким образом его вводят часто, что связано с неудобствами для пациента. Следовательно, необходимы аналоги инсулина с увеличенным периодом полужизни in vivo и, таким образом, с пролонгированной продолжительностью действия.
В настоящее время существуют разные подходы к увеличению периода полужизни вариантов инсулина.
Один подход основан на разработке растворимого состава при низком pH, но со сниженной растворимостью по сравнению с нативным инсулином при физиологическом pH. Изоэлектрическая точка аналога инсулина увеличена благодаря добавлению двух остатков аргинина к С-концу B-цепи. Добавление двух остатков аргинина в комбинации с заменой на глицин в положении A21 (инсулин гларгин) обеспечивает получение инсулина с увеличенной продолжительностью действия. Аналог инсулина осаждается в присутствии цинка при инъекции в подкожные участки и медленно солюбилизируется, что приводит к постоянному присутствию инсулина гларгина.
В другом подходе группа длинноцепочечной жирной кислоты конъюгирована с эпсилон-аминогруппой LysB29 инсулина. Присутствие этой группы позволяет присоединять инсулин к сывороточному альбумину посредством нековалентного обратимого связывания. Как следствие, этот аналог инсулина характеризуется значительно пролонгированным временным профилем действия по сравнению с человеческим инсулином (см., например, Mayer et al., Inc. Biopolymers (Pept Sci) 88: 687-713, 2007; или WO 2009/115469).
В WO 2016/006963 раскрыты аналоги инсулина, характеризующиеся сниженной скоростью выведения, опосредованного рецепторами инсулина, по сравнению с человеческим инсулином.
В WO 2018/056764 раскрыты аналоги инсулина, характеризующиеся сниженной скоростью выведения, опосредованного рецепторами инсулина, по сравнению с человеческим инсулином.
В WO 2008/034881 раскрыты аналоги инсулина, стабилизированные по отношению к протеазам.
Для увеличения продолжительности действия лекарственного средства период полужизни играет большую роль. Период полужизни (t1/2) пропорционален объему распределения, деленному на клиренс. В случае с человеческим инсулином клиренс главным образом обусловлен связыванием с рецептором инсулина, интернализацией и последующим разрушением.
Соответственно, существует потребность в аналогах инсулина, которые характеризуются сниженной активностью связывания с рецепторами инсулина и, следовательно, сниженной скоростью выведения, опосредованного рецепторами, но которые характеризуются активностью передачи сигнала, позволяющей в достаточной степени снижать уровень глюкозы в крови in vivo.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
В данном документе предусмотрены аналоги инсулина длительного действия, характеризующиеся очень низкой аффинностью связывания (следовательно, более низкой скоростью выведения), при этом по-прежнему сохраняющие высокий уровень передачи сигнала.
Неожиданно в контексте исследований, лежащих в основе настоящего изобретения, было показано, что замена в положении B16 и/или B25 человеческого инсулина гидрофобной аминокислотой (такой как лейцин, изолейцин, валин, аланин и триптофан) приводила к уменьшению активности связывания с рецепторами инсулина (по сравнению с активностью связывания с рецепторами инсулина у исходного инсулина, см. "Примеры"). Наиболее сильные эффекты в отношении активности связывания с рецепторами инсулина наблюдались при заменах аминокислотами с разветвленной цепью (лейцином, изолейцином и валином). Интересно, что аналоги инсулина с такими заменами в этих положениях (как, например, в положении B25) демонстрировали усиление передачи сигнала вплоть до 6-кратного по сравнению с тем, что ожидалось, исходя из их значений аффинности связывания с изоформой B (IR-B) рецептора инсулина (см. "Примеры"). Кроме того, некоторые тестируемые аналоги инсулина демонстрировали улучшенную протеолитическую стабильность по отношению к α-химотрипсину, катепсину D и ферменту, разрушающему инсулин (см. "Примеры").
Соответственно, в данном документе предусмотрены аналоги инсулина, содержащие по меньшей мере одну мутацию по сравнению с исходным инсулином, где аналоги инсулина содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен аналог инсулина, содержащий по меньшей мере одну мутацию по сравнению с исходным инсулином, где аналог инсулина содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью.
Выражение "аналог инсулина", используемое в данном документе, относится к пептиду, имеющему молекулярную структуру, которая формально может быть получена из структуры встречающегося в природе инсулина (в данном документе также называемого "исходным инсулином", например, человеческого инсулина) посредством делеции и/или замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, содержащегося во встречающемся в природе инсулине, и/или добавления по меньшей мере одного аминокислотного остатка. Добавляемые и/или заменяющие аминокислотные остатки могут представлять собой кодируемые аминокислотные остатки либо другие встречающиеся в природе остатки или аминокислотные остатки, полученные исключительно синтетическим путем. Аналог, упоминаемый в данном документе, способен снижать уровни глюкозы в крови in vivo, как, например, у субъекта-человека.
В некоторых вариантах осуществления аналог инсулина, предусмотренный в данном документе, содержит две пептидные цепи - A-цепь и B-цепь. Как правило, две цепи соединены дисульфидными мостиками между остатками цистеина. Например, в некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат три дисульфидных мостика: один дисульфидный мостик между остатками цистеина в положениях A6 и A11, один дисульфидный мостик между цистеином в положении A7 A-цепи и цистеином в положении B7 B-цепи и один между цистеином в положении A20 A-цепи и цистеином в положении B19 B-цепи. Соответственно, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут содержать остатки цистеина в положениях A6, A7, A11, A20, B7 и B19.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотренных в данном документе, аналог инсулина представляет собой одноцепочечный инсулин. Одноцепочечный инсулин представляет собой одиночные полипептидные цепи, в которых B-цепь инсулина непрерывно связана с A-цепью инсулина посредством нерасщепляемого соединяющего пептида.
Мутации инсулина, т.е. мутации исходного инсулина, указаны в данном документе со ссылкой на цепь, т.е. на A-цепь либо на B-цепь аналога, положение мутантного аминокислотного остатка в A- или B-цепи (как, например, A14, B16 и B25) и трехбуквенный код аминокислоты, заменяющей нативную аминокислоту в исходном инсулине. Термин "desB30" относится к аналогу, который не имеет аминокислоты B30 из исходного инсулина (т.е. аминокислота в положении B30 отсутствует). Например, человеческий инсулин Glu(A14)Ile (B16)desB30 представляет собой аналог человеческого инсулина, в котором аминокислотный остаток в положении 14 А-цепи (A14) человеческого инсулина заменен глутаминовой кислотой, аминокислотный остаток в положении 16 B-цепи (B16) заменен изолейцином, и аминокислота в положении 30 B-цепи удалена (т.е. отсутствует).
Аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат по меньшей мере одну мутацию (замену, делецию или добавление аминокислоты) по сравнению с исходным инсулином. Используемый в данном документе термин "по меньшей мере один" означает один или более чем один, как, например, "по меньшей мере два", "по меньшей мере три", "по меньшей мере четыре", "по меньшей мере пять" и т.д. В некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат по меньшей мере одну мутацию в B-цепи и по меньшей мере одну мутацию в A-цепи. В дополнительном варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат по меньшей мере две мутации в B-цепи и по меньшей мере одну мутацию в A-цепи. Например, аналог инсулина может содержать замену в положении B16, делецию в положении B30 и замену в положении A14. В качестве альтернативы, аналог инсулина может содержать замену в положении B25, делецию в положении B30 и замену в положении A14. Кроме того, аналог инсулина может содержать замену в положении B16, замену в положении В25, делецию в положении B30 и замену в положении A14.
Аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут содержать мутации в дополнение к мутациям, указанным выше. В некоторых вариантах осуществления количество мутаций не превышает определенного количества. В некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина содержат менее двенадцати мутаций (т.е. делеций, замен, добавлений) по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее десяти мутаций по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее восьми мутаций по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее семи мутаций по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее шести мутаций по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее пяти мутаций по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее четырех мутаций по сравнению с исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналог содержит менее трех мутаций по сравнению с исходным инсулином.
Выражение "исходный инсулин", используемое в данном документе, относится к встречающемуся в природе инсулину, т.е. к немутантному инсулину дикого типа. В некоторых вариантах осуществления исходный инсулин представляет собой инсулин животного происхождения, такой как инсулин млекопитающих. Например, исходный инсулин может представлять собой человеческий инсулин, свиной инсулин или бычий инсулин.
В некоторых вариантах осуществления исходный инсулин представляет собой человеческий инсулин. Последовательность человеческого инсулина хорошо известна из уровня техники и показана в таблице 1 в разделе "Примеры". Человеческий инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 2 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT).
В другом варианте осуществления исходный инсулин представляет собой бычий инсулин. Последовательность бычьего инсулина хорошо известна из уровня техники. Бычий инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 81 (GIVEQCCASVCSLYQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 82 (FVNQHLCGSHLVEALYLVC-GERGFFYTPKA).
В другом варианте осуществления исходный инсулин представляет собой свиной инсулин. Последовательность свиного инсулина хорошо известна из уровня техники. Свиной инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 83 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 84 (FVNQHLCGSHLVEALYLVC GERGFFYTPKA).
Человеческий, бычий и свиной инсулины содержат три дисульфидных мостика: один дисульфидный мостик между остатками цистеина в положениях A6 и A11, один дисульфидный мостик между цистеином в положении A7 A-цепи и цистеином в положении B7 B-цепи и один между цистеином в положении A20 A-цепи и цистеином в положении B19 B-цепи.
Аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, характеризуются аффинностью связывания с рецепторами инсулина, сниженной по сравнению с аффинностью связывания с рецепторами инсулина у соответствующего исходного инсулина, например человеческого инсулина.
Рецептор инсулина может представлять собой любой рецептор инсулина млекопитающего, такой как рецептор бычьего, свиного или человеческого инсулина. В некоторых вариантах осуществления рецептор инсулина представляет собой рецептор человеческого инсулина, например изоформу A рецептора человеческого инсулина или изоформу B рецептора человеческого инсулина (которая использовалась в разделе "Примеры").
Аналоги человеческого инсулина, предусмотренные в данном документе, преимущественно характеризуются значительно сниженной аффинностью связывания с рецептором человеческого инсулина по сравнению с аффинностью связывания человеческого инсулина с рецептором человеческого инсулина (см. "Примеры"). Таким образом, аналоги инсулина характеризуются очень низкой скоростью выведения, т.е. очень низкой скоростью выведения, опосредованного рецепторами инсулина.
В некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина обладают, т.е. характеризуются, менее чем 20% аффинностью связывания с соответствующим рецептором инсулина по сравнению с их исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, обладают менее чем 10% аффинностью связывания с соответствующим рецептором инсулина по сравнению с их исходным инсулином. В другом варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, обладают менее чем 5% аффинностью связывания с соответствующим рецептором инсулина по сравнению с их исходным инсулином, как, например, менее чем 3% аффинностью связывания по сравнению с их исходным инсулином. Например, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут обладать от 0,1% до 10%, как, например, от 0,3% до 5%, аффинностью связывания с соответствующим рецептором инсулина по сравнению с их исходным инсулином. Также аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут обладать от 0,5% до 3%, как, например, от 0,5% до 2%, аффинностью связывания с соответствующим рецептором инсулина по сравнению с их исходным инсулином.
Способы определения аффинности связывания аналога инсулина с рецептором инсулина хорошо известны из уровня техники. Например, аффинность связывания с рецепторами инсулина может быть определена с помощью сцинтилляционного анализа сближения, который основан на оценке конкурентного связывания между исходным инсулином, меченным [125I], таким как человеческий инсулин, меченный [125I], и (немеченым) аналогом инсулина с рецептором инсулина. Рецептор инсулина может присутствовать в мембране клетки, например клетки СНО (яичника китайского хомячка), которая сверхэкспрессирует рекомбинантный рецептор инсулина. В варианте осуществления аффинность связывания с рецепторами инсулина определяют согласно описанному в разделе "Примеры".
Связывание встречающегося в природе инсулина или аналога инсулина с рецептором инсулина активирует сигнальный путь инсулина. Рецептор инсулина обладает тирозинкиназной активностью. Связывание инсулина с его рецептором индуцирует конформационное изменение, которое стимулирует аутофосфорилирование рецептора по остаткам тирозина. Аутофосфорилирование рецептора инсулина стимулирует тирозинкиназную активность рецептора в отношении внутриклеточных субстратов, участвующих в передаче сигнала. Аутофосфорилирование рецептора инсулина под действием аналога инсулина, таким образом, рассматривается как мера передачи сигнала, вызываемой указанным аналогом.
Аналоги инсулина из таблицы 1 раздела "Примеры" подвергали анализам аутофосфорилирования. Интересно, что аналоги инсулина с заменами алифатическими аминокислотами в положениях B16 и B25 обуславливали более высокий уровень аутофосфорилирования рецептора инсулина, чем ожидалось, исходя из их значений аффинности связывания с рецепторами инсулина. Таким образом, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, характеризуются низкой активностью связывания и, следовательно, более низкой скоростью выведения, опосредованного рецепторами, но, тем не менее, способны обуславливать относительно высокий уровень передачи сигнала. Следовательно, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут применяться в качестве вариантов инсулина длительного действия. В некоторых вариантах осуществления аналог инсулина, предусмотренный в данном документе, способен индуцировать аутофосфорилирование рецепторов инсулина на уровне от 1 до 10%, как, например, от 2 до 8%, по сравнению с исходным инсулином (таким как человеческий инсулин). Кроме того, в некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, способны индуцировать аутофосфорилирование рецепторов инсулина на уровне от 3 до 7%, как, например, от 5 до 7%, по сравнению с исходным инсулином (таким как человеческий инсулин). Аутофосфорилирование рецепторов инсулина по сравнению с исходным инсулином может быть определено согласно описанному в разделе "Примеры".
Аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, подвергали анализам стабильности к протеазам. Как показано в таблице 3, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, характеризовались более высокой стабильностью по отношению к по меньшей мере некоторым из тестируемых протеаз по сравнению с человеческим инсулином. Улучшенная протеолитическая стабильность наблюдалась по отношению к α-химотрипсину, катепсину D и ферменту, разрушающему инсулин (IDE). Соответственно, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, как правило, являются протеолитически стабильными аналогами инсулина. Таким образом, они медленнее разрушаются протеазами по сравнению с исходным инсулином. В некоторых вариантах осуществления аналог инсулина, предусмотренный в данном документе, является стабилизированным к разрушению α-химотрипсином, катепсином D и ферментом, разрушающим инсулин (IDE), по сравнению с исходным инсулином.
Как изложено выше, аналог инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с исходным инсулином.
В некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой. Таким образом, аминокислота в положении B16 (тирозин в человеческом, бычьем и свином инсулине) замещена гидрофобной аминокислотой.
В другом варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой. Таким образом, аминокислота в положении B25 (фенилаланин в человеческом, бычьем и свином инсулине) замещена гидрофобной аминокислотой.
В другом варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой.
Гидрофобная аминокислота может представлять собой любую гидрофобную аминокислоту. Например, гидрофобная аминокислота может представлять собой алифатическую аминокислоту, такую как аминокислота с разветвленной цепью.
В некоторых вариантах осуществления аналогов инсулина, предусмотренных в данном документе, гидрофобная аминокислота, используемая для замены в положении B16 и/или B25, представляет собой изолейцин, валин, лейцин, аланин, триптофан, метионин, пролин, глицин, фенилаланин или тирозин (или производное вышеперечисленных аминокислот).
Некоторые варианты исходного инсулина, такие как человеческий, бычий и свиной инсулин, содержат тирозин в положении B16 и фенилаланин в положении B25. Таким образом, аминокислота в положении B16 исходного инсулина может быть заменена изолейцином, валином, лейцином, аланином, триптофаном, метионином, пролином, глицином или фенилаланином (или производным вышеперечисленных аминокислот). Кроме того, аминокислота в положении B25 исходного инсулина может быть заменена изолейцином, валином, лейцином, аланином, триптофаном, метионином, пролином, глицином или тирозином (или производным вышеперечисленных аминокислот).
Производные вышеперечисленных аминокислот известны из уровня техники.
Производные лейцина включают без ограничения гомолейцин и трет-лейцин. Таким образом, аминокислота в положении B16 и/или B25 может быть заменена гомолейцином или трет-лейцином.
Производное валина представляет собой, например, 3-этилнорвалин. Таким образом, аминокислота в положении B16 и/или B25 может быть заменена 3-этилнорвалином.
Производные глицина включают без ограничения циклогексилглицин, циклопропилглицин и трифторэтилглицин.
Производные аланина включают без ограничения бета-трет-бутилаланин, циклобутилаланин, циклопропилаланин и гомоциклогексилаланин.
В некоторых вариантах осуществления гидрофобная аминокислота, используемая для замены в положении B16 и/или B25, представляет собой изолейцин, валин, лейцин, аланин или триптофан.
В некоторых вариантах осуществления алифатическая аминокислота не представляет собой аланин. Соответственно, гидрофобная аминокислота, используемая для замены в положении B16 и/или B25, может представлять собой изолейцин, валин, лейцин или триптофан.
В некоторых вариантах осуществления гидрофобная аминокислота, используемая для замены в положении B16 и/или B25, представляет собой изолейцин, валин или лейцин.
В некоторых вариантах осуществления аминокислоты, упоминаемые в данном документе, представляют собой L-аминокислоты (такие как L-изолейцин, L-валин или L-лейцин). Соответственно, аминокислоты (или их производные), используемые, например, для замены в положениях B16, B25 и/или A14, как правило, являются L-аминокислотами.
В некоторых вариантах осуществления гидрофобная аминокислота представляет собой алифатическую аминокислоту. Соответственно, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену алифатической аминокислотой, и мутацию в положении B25, которая представляет собой замену алифатической аминокислотой (и необязательно дополнительные мутации, в том числе без ограничения Des(B30) и Glu(A14)).
Алифатические аминокислоты представляют собой неполярные и гидрофобные аминокислоты, содержащие функциональную группу алифатической боковой цепи. Гидрофобность увеличивается с увеличением числа атомов углерода в углеводородной цепи. Мерой гидрофобности алифатической структуры является индекс гидропатичности согласно шкале Кайта-Дулиттла, который, например, может быть определен согласно описанному в Kyte J. et al. Journal of Molecular Biology. 1982, 157 (1): 105-32. В некоторых вариантах осуществления алифатическая аминокислота представляет собой алифатическую аминокислоту, имеющую индекс гидропатичности (согласно шкале Кайта-Дулиттла) больше 2,0, как, например, больше 3,0 или больше 3,5.
Алифатические аминокислоты включают без ограничения изолейцин, валин, лейцин, аланин и глицин. Например, алифатическая аминокислота может представлять собой аминокислоту, выбранную из изолейцина, валина, лейцина и глицина, такую как аминокислота, выбранная из изолейцина, валина и лейцина.
Изолейцин, валин и лейцин представляют собой аминокислоты с разветвленной цепью (сокращенно BCAA). Таким образом, алифатическая аминокислота может представлять собой аминокислоту с разветвленной цепью. В некоторых вариантах осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и мутацию в положении B25, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью (и необязательно дополнительные мутации, в том числе без ограничения Des(B30) и Glu(A14)).
BCAA представляют собой аминокислоты, такие как изолейцин, валин и лейцин, которые являются аминокислотами с алифатическими боковыми цепями, которые являются нелинейными, т.е. аминокислоты с разветвленной цепью представляют собой аминокислоты, имеющие алифатическую боковую цепь с разветвлением (центральный атом углерода связан с тремя или более атомами углерода).
Аминокислота с разветвленной цепью может представлять собой протеиногенную BCAA, т.е. аминокислоту, которая путем биосинтеза включается в состав белков в ходе трансляции, или непротеиногенную BCAA, т.е. аминокислоту, которая не кодируется в естественных условиях или не обнаруживается в генетическом коде какого-либо из организмов. Например, протеиногенными BCAA являются лейцин, изолейцин и валин. Таким образом, гидрофобная/алифатическая аминокислота с разветвленной цепью может представлять собой лейцин, изолейцин или валин (или производное лейцина, изолейцина или валина, такое как производное лейцина или валина, как изложено выше).
В некоторых вариантах осуществления аминокислота с разветвленной цепью представляет собой изолейцин.
В некоторых вариантах осуществления аминокислота с разветвленной цепью представляет собой валин.
В некоторых вариантах осуществления аминокислота с разветвленной цепью представляет собой лейцин.
В дополнение к мутации в положении B16 и/или мутации в положении B25, описанным выше, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут содержать дополнительные мутации по сравнению с исходным инсулином.
Например, аналог инсулина может дополнительно содержать мутацию в положении A14. Известно, что такие мутации увеличивают стабильность к протеазам (см., например, WO 2008/034881). В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении A14 заменена глутаминовой кислотой (Glu). В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении A14 заменена аспарагиновой кислотой (Asp). В некоторых вариантах осуществления аминокислота в положении A14 заменена гистидином (His).
Кроме того, аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, могут содержать мутацию в положении B30. В некоторых вариантах осуществления мутация в положении B30 представляет собой делецию треонина в положении B30 исходного инсулина (также называемую мутацией Des(B30)).
Кроме того, аналог инсулина по настоящему изобретению может дополнительно содержать мутацию в положении B3, которая представляет собой замену глутаминовой кислотой (Glu), и/или мутацию в положении A21, которая представляет собой замену глицином (Gly).
В варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 22 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 24 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 50 (FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 58 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 60 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 64 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 66 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 70 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 80 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK), или состоит из нее.
B-цепи, обобщенно представленные выше, содержат мутацию Des(B30). Соответственно, аминокислота, которая присутствует в положении B30 исходного инсулина (треонин в человеческом инсулине и аланин в свином и бычьем инсулине), удалена, т.е. отсутствует.Однако предусматривается также, что B-цепи аналогов по настоящему изобретению не содержат эту мутацию, т.е. содержат треонин в положении 30. Соответственно, B-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID NO: 85),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 86),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 87),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 88),
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 89),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 90),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 91),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 92),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 93),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 94),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 95),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 96),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 97), или состоять из нее.
В варианте осуществления А-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 1 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления А-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), или состоит из нее.
В другом варианте осуществления А-цепь аналога инсулина по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 45 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG), или состоит из нее.
Как правило, аналог инсулина по настоящему изобретению содержит А-цепь и В-цепь, как изложено выше.
Например, аналог инсулина по настоящему изобретению выбран из группы, состоящей из:
Leu(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина, т.е. человеческого Leu(B16)-инсулина),
Val(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина, т.е. человеческого Val(B16)-инсулина),
Ile(В16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Leu(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Val(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Ile(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Leu(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Leu(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Leu(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Leu(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина) и
Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина).
В другом варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, выбраны из группы, состоящей из:
Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина, т.е. человеческого Asp(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина),
Asp(A14)Ile(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Leu(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Leu(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Leu(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Ile(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
Asp(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина) и
Asp(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина).
В другом варианте осуществления аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе, выбраны из группы, состоящей из:
His(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B16)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Leu(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B16)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Leu(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Leu(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Ile(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B16)Ile(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина),
His(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина) и
His(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина (например, человеческого инсулина).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Leu(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Leu(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 11). Например, Leu(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 21 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 22 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 12). Например, Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 23 (GIVEQCCTSICSLYQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 24 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 22). Например, Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 24). Например, Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 25). Например, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 49 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 50 (FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 29). Например, Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 57 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 58 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 30). Например, Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 56 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 60 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 32). Например, Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 63 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 64 (FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 33). Например, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 65 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 66 (FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 35). Например, Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 69 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 70 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 38). Например, Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 75 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 76 (FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 39). Например, Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
В другом варианте осуществления аналог инсулина представляет собой Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин (такой как человеческий Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин). Последовательность этого аналога, например, показана в таблице 1 раздела "Примеры" (см. аналог 40). Например, Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулин содержит А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 79 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCG), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 80 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
Аналог инсулина можно получить любым способом, считающимся подходящим. Например, аналог инсулина можно получить рекомбинантными способами или посредством твердофазного синтеза.
Определения и пояснения, приведенные в данном документе выше, применимы с учетом соответствующих изменений к нижеследующему.
В данном документе предусмотрены B-цепи инсулина, т.е. пептиды B-цепи инсулина, определенные в данном документе выше применительно к B-цепи аналога инсулина, предусмотренного в данном документе. Соответственно, в данном документе предусмотрены B-цепи инсулина, которые содержат по меньшей мере одну мутацию по сравнению с B-цепью инсулина в исходном инсулине, где B-цепи содержат мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой. B-цепь инсулина может содержать дополнительные мутации, описанные в данном документе выше, такие как делеция des(B30).
Также в данном документе предусмотрены варианты проинсулина, содержащие А-цепь инсулина и/или В-цепь инсулина из аналогов инсулина, предусмотренных в данном документе. B-цепь может представлять собой любую B-цепь, определенную в данном документе выше для аналогов инсулина, предусмотренных в данном документе. Например, в данном документе предусмотрены варианты проинсулина, содержащие А-цепь инсулина и B-цепь инсулина, где указанная B-цепь содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с B-цепью исходного инсулина, где мутация находится в положении B16, при этом она представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутация находится в положении B25, при этом она представляет собой замену гидрофобной аминокислотой. B-цепь инсулина может содержать дополнительные мутации, описанные в данном документе выше для B-цепи.
А-цепь, содержащаяся в проинсулине, предусмотренном в данном документе, может представлять собой любую А-цепь, определенную в данном документе выше для аналогов инсулина, предусмотренных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления A-цепь указанного проинсулина содержит мутацию в положении A14, которая представляет собой замену аминокислотой, выбранной из глутаминовой кислоты (Glu), аспарагиновой кислоты (Asp) и гистидина (His).
В дополнение к А-цепи инсулина и/или B-цепи инсулина, варианты проинсулина, предусмотренные в данном документе, могут содержать дополнительные элементы, такие как лидерные последовательности или C-пептид. В некоторых вариантах осуществления проинсулин может дополнительно содержать C-пептид, который расположен между B-цепью инсулина и A-цепью инсулина. C-пептид может иметь длину 4-10 аминокислот, как, например, длину 4-9 аминокислот.Ориентация может быть следующей (от N-конца к C-концу): В-цепь, C-пептид, А-цепь.
В данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие аналоги инсулина, B-цепи инсулина и варианты проинсулина, предусмотренные в данном документе. Указанный полинуклеотид может быть функционально связан с промотором, который обеспечивает экспрессию указанного полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления промотор является гетерологичным по отношению к указанному полинуклеотиду. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой конститутивный промотор. В другом варианте осуществления промотор представляет собой индуцируемый промотор.
Кроме того, в данном документе предусмотрены векторы, содержащие полинуклеотид, кодирующий аналоги инсулина, предусмотренные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления указанный вектор представляет собой вектор экспрессии.
В данном документе предусмотрены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие аналоги инсулина, B-цепи инсулина и варианты проинсулина, полинуклеотиды и/или векторы, предусмотренные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку, такую как клетка, принадлежащая к роду Escherichia, например клетка E.coli. В другом варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку, такую как клетка Pichia pastoris или клетка Kluyveromyces lactis.
В данном документе предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически эффективное количество аналога инсулина, предусмотренного в данном документе, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
В данном документе предусмотрены способы лечения заболевания, включающие введение субъекту фармацевтически эффективного количества одного или нескольких аналогов инсулина, предусмотренных в данном документе, или фармацевтической композиции на их основе.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой сахарный диабет, такой как сахарный диабет II типа.
В данном документе предусмотрены аналоги инсулина или фармацевтическая композиция на их основе для применения в медицине.
В данном документе предусмотрены аналоги инсулина или фармацевтическая композиция на их основе для применения в лечении сахарного диабета, такого как сахарный диабет II типа.
Наконец, в данном документе предусмотрены пути применения аналогов инсулина, предусмотренных в данном документе, или фармацевтических композиций на их основе для получения лекарственного препарата или лекарственного средства для лечения сахарного диабета, такого как сахарный диабет II типа.
Аналоги инсулина, B-цепи инсулина, варианты проинсулина и их пути применения дополнительно проиллюстрированы следующими вариантами осуществления и комбинациями вариантов осуществления, указанными с помощью соответствующих зависимостей и обратных ссылок. Определения и пояснения, приведенные в данном документе выше, применимы с учетом соответствующих изменений к нижеследующим вариантам осуществления.
1. Аналог инсулина, содержащий по меньшей мере одну мутацию по сравнению с исходным инсулином, где аналог инсулина содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой.
2. Аналог инсулина согласно варианту осуществления 1, где исходный инсулин представляет собой человеческий инсулин, свиной инсулин или бычий инсулин.
3. Аналог инсулина согласно вариантам осуществления 1 и 2, где гидрофобная аминокислота в положении B16 и/или положении B25 представляет собой алифатическую аминокислоту.
4. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-3, где указанная алифатическая аминокислота в положении B16 и/или положении B25 представляет собой аминокислоту с разветвленной цепью, такую как аминокислота с разветвленной цепью, выбранная из группы, состоящей из валина (Val), изолейцина (Ile) и лейцина (Leu).
5. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-3, где указанный аналог инсулина дополнительно содержит мутацию в положении A14, которая представляет собой замену аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты (Glu), аспарагиновой кислоты (Asp) и гистидина (His).
6. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-5, где указанный аналог инсулина дополнительно содержит мутацию в положении B30, например, где мутация в положении B30 представляет собой делецию аминокислоты в положении B30 исходного инсулина (мутацию Des(B30)).
7. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-6, где указанный аналог инсулина дополнительно содержит мутацию в положении B3, которая представляет собой замену глутаминовой кислотой (Glu).
8. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-7, где указанный инсулин дополнительно содержит мутацию в положении A21, которая представляет собой замену глицином (Gly).
9. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-8, где B-цепь аналога инсулина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK (SEQ ID NO: 22),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 44),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 48),
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 50),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 58),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 60),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 64),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 66),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 70),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 76),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 78),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 80),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID NO: 85),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 86),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 87),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 88),
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 89),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 90),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 91),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 92),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 93),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 94),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 95),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 96) и
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 97), или состоит из нее.
10. Аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-9, содержащий:
А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK),
А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), или
А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
11. Аналог инсулина, выбранный из группы, состоящей из:
человеческого Leu(B16)-инсулина,
человеческого Val(B16)-инсулина,
человеческого Ile(B16)-инсулина,
человеческого Leu(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Val(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Ile(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Leu(B25)-инсулина,
человеческого Val(B25)-инсулина,
человеческого Ile(B25)-инсулина,
человеческого Leu(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина и
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина.
12. B-цепь инсулина, содержащая по меньшей мере одну мутацию по сравнению с B-цепью исходного инсулина, где B-цепь содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой.
13. B-цепь инсулина согласно варианту осуществления 12, где исходный инсулин представляет собой человеческий инсулин, свиной инсулин или бычий инсулин.
14. B-цепь инсулина согласно вариантам осуществления 12 и 13, где гидрофобная аминокислота в положении B16 и/или положении B25 представляет собой алифатическую аминокислоту.
15. B-цепь инсулина согласно любому из вариантов осуществления 12-14, где указанная алифатическая аминокислота представляет собой аминокислоту с разветвленной цепью, такую как аминокислота с разветвленной цепью, выбранная из группы, состоящей из валина (Val), изолейцина (Ile) и лейцина (Leu).
16. B-цепь инсулина согласно любому из вариантов осуществления 12-15, где указанная В-цепь инсулина дополнительно содержит мутацию в положении B3, которая представляет собой замену глутаминовой кислотой (Glu).
17. B-цепь инсулина согласно любому из вариантов осуществления 12-16, где указанная В-цепь инсулина дополнительно содержит мутацию в положении B30, где мутация в положении B30 представляет собой делецию аминокислоты в положении B30 исходного инсулина (мутацию Des(B30)).
18. Проинсулин, содержащий А-цепь инсулина и В-цепь инсулина, где В-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с B-цепью исходного инсулина, где B-цепь содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену гидрофобной аминокислотой.
19. Проинсулин согласно варианту осуществления 18, где A-цепь инсулина в указанном проинсулине содержит мутацию в положении A14, которая представляет собой замену аминокислотой, выбранной из глутаминовой кислоты (Glu), аспарагиновой кислоты (Asp) и гистидина (His).
20. Проинсулин согласно вариантам осуществления 18 и 19, где исходный инсулин представляет собой человеческий инсулин, свиной инсулин или бычий инсулин.
21. Проинсулин согласно любому из вариантов осуществления 18-20, где гидрофобная аминокислота в положении B16 и/или положении B25 представляет собой алифатическую аминокислоту.
22. Проинсулин согласно любому из вариантов осуществления 18-21, где указанная алифатическая аминокислота представляет собой аминокислоту с разветвленной цепью, такую как аминокислота с разветвленной цепью, выбранная из группы, состоящей из валина (Val), изолейцина (Ile) и лейцина (Leu).
23. Проинсулин согласно любому из вариантов осуществления 18-22, где указанный проинсулин дополнительно содержит мутацию в положении B3, которая представляет собой замену глутаминовой кислотой (Glu).
24. Проинсулин согласно любому из вариантов осуществления 18-23, где указанный проинсулин дополнительно содержит мутацию в положении B30, где мутация в положении B30 представляет собой делецию аминокислоты в положении B30 исходного инсулина (мутацию Des(B30)).
25. Полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-11, В-цепь инсулина согласно любому из вариантов осуществления 12-17 и/или проинсулин согласно любому из вариантов осуществления 18-24.
26. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид согласно варианту осуществления 25.
27. Клетка-хозяин, содержащая аналог инсулина согласно любому из вариантов осуществления 1-11, В-цепь инсулина согласно любому из вариантов осуществления 12-17, проинсулин согласно любому из вариантов осуществления 18-24, полинуклеотид согласно варианту осуществления 25 и/или вектор экспрессии согласно варианту осуществления 26.
28. Способ лечения пациента, у которого имеется сахарный диабет, включающий введение пациенту одного или нескольких аналогов инсулина, указанных в любом из вариантов осуществления 1-11.
29. Аналог инсулина, указанный в любом из вариантов осуществления 1-11, для применения в лечении сахарного диабета.
Все литературные источники, цитируемые в настоящем описании, включены в данный документ посредством ссылки в отношении полного содержания их раскрытия и содержания раскрытия, конкретно упомянутого в настоящем описании.
Пример 1. Получение человеческого инсулина и аналогов инсулина
Человеческий инсулин, а также аналоги инсулина получали рекомбинантным путем. Полинуклеотиды, кодирующие препроинсулин, заказывали у GeneArt®. Сконструированные полинуклеотиды были оптимизированы для экспрессии в дрожжах. Их вставляли в вектор экспрессии с помощью классического рестрикционного клонирования, обеспечивающего функциональную экспрессию и секрецию в Kluyveromyces lactis K. В качестве лидерной последовательности секреции ген был слит на С-конце с последовательностью ДНК, кодирующей сигнальный альфа-фактор спаривания Saccharomyces cerevisiae. Экспрессию рекомбинантного гена контролировали с помощью индуцируемого лактозой промотора K. lactis.
Человеческий инсулин, а также аналоги инсулина производили в виде препроинсулина. Генетически слитую N-концевую препоследовательность использовали для улучшения значений выхода экспрессии и секреции и для стабилизации пептида в культуральном бульоне. Для этой цели можно использовать широкое разнообразие последовательностей, которые тестировали в отношении эффективности. Сам проинсулин состоит из B-цепи, слитой с C-пептидом, за которой следует C-концевая A-цепь. В качестве C-пептида описаны разнообразные комбинации аминокислот.Было показано, что короткие пептиды длиной 1-10 аминокислот хорошо подходят в качестве C-последовательностей. Для дальнейшего процессинга инсулина важны сайты распознавания для специфических протеаз, которые фланкируют C-пептид для обеспечения возможности его вырезания.
Клетки K. lactis были сделаны компетентными с помощью химических средств. Затем клетки трансформировали плазмидой экспрессии, кодирующей соответствующий препроинсулин. После вставки плазмиды, клетки высевали на чашки с селективным агаром, содержащим генетицин. Выращенные колонии выделяли и тестировали в отношении экспрессии рекомбинантных генов. Клетки выращивали до достаточно высоких значений плотности клеток в декстрозо-пептонной среде для роста дрожжей, дополненной генетицином. После начальной фазы роста к культурам добавляли забуференную солью среду на основе дрожжевого экстракта с генетицином, дополненную лактозой, для индукции экспрессии рекомбинантного гена. Культуры выращивали несколько дней, и образцы надосадочной жидкости собирали посредством центрифугирования.
Очистку функционального инсулина или аналогов инсулина начинали с помощью процедуры фильтрации. Первоначальную процедуру хроматографического захвата проводили с использованием ионообменной смолы. Расщепление препроинсулина до инсулина выполняли с помощью высокоспецифичной протеазы. Истощение по белку клетки-хозяина, препоследовательности и сопутствующим продуктам осуществляли с помощью каскада из двух дополнительных хроматографических стадий. Наряду с хроматографией гидрофобных взаимодействий для достижения этой цели применяли другую процедуру ионного обмена. Заключительную глубокую очистку осуществляли посредством обращенно-фазовой хроматографии. Фильтрацию, осаждение и сублимационную сушку использовали для завершения процесса получения молекулы инсулина.
После реакций сочетания с активированным производным карбоновой кислоты раствор с конъюгированными молекулами инсулина фильтровали. Заключительную очистку осуществляли посредством обращенно-фазовой хроматографии. Фильтрацию, осаждение и сублимационную сушку использовали для завершения синтеза целевой молекулы.
Были получены различные аналоги вариантов инсулина с мутациями, например, в положениях B16, B25 и/или A14. В таблице 1 представлен обзор полученных вариантов инсулина.
Таблица 1. Полученные аналоги человеческого инсулина
LYQLENYCN
YLVCGERGFFYTPKT
LEQLENYCN
YLVCGERGFFYTPK
LYQLENYCN
LLVCGERGFFYTPK
LYQLENYCG
WLVCGERGFFYTPK
LYQLENYCN
HLVCGERGFFYTPK
LYQLENYCN
VLVCGERGFFYTPK
LYQLENYCN
YLVCGERGFAYTPKT
LYQLENYCN
YLVCGERGFAYTPK
LYQLENYCN
YLVCGERGFEYTPK
LYQLENYCN
YLVCGERGFHYTPK
LYQLENYCN
YLVCGERGFLYTPK
LYQLENYCN
YLVCGERGFVYTPK
LYQLENYCN
HLVCGERGFHYTPK
LYQLENYCG
WLVCGERGFHYTPK
LYQLENYCG
WLVCGERGFWYTPK
LEQLENYCN
HLVCGERGFFYTPK
LEQLENYCG
WLVCGERGFFYTPK
LEQLENYCN
ILVCGERGFFYTPK
LEQLENYCN
LVLVCGERGFFYTPK
LEQLENYCN
LVLVCGERGFFYTPK
LEQLENYCN
LYLVCGERGFHYTPK
LEQLENYCN
LYLVCGERGFIYTPK
LEQLENYCG
LYLVCGERGFWYTPK
LEQLENYCN
LYLVCGERGFVYTPK
SLEQLENYCG
LYLVCGERGFVYTPK
SLEQLENYCN
LELVCGERGFHYTPK
SLEQLENYCN
LHLVCGERGFAYTPK
SLEQLENYCN
LHLVCGERGFHYTPK
SLEQLENYCN
LILVCGERGFIYTPK
SLEQLENYCN
LILVCGERGFIYTPK
SLEQLENYCG
LILVCGERGFWYTPK
SLEQLENYCN
LILVCGERGFVYTPK
SLEQLENYCG
LILVCGERGFVYTPK
SLEQLENYCN
LLLVCGERGFAYTPK
SLEQLENYCN
LVLVCGERGFIYTPK
SLEQLENYCG
LVLVCGERGFWYTPK
SLEQLENYCG
VLVCGERGFWYTPK
SLEQLENYCN
VLVCGERGFVYTPK
SLEQLENYCN
VLVCGERGFVYTPK
SLEQLENYCG
VLVCGERGFVYTPK
Пример 2. Анализы аффинности связывания с рецепторами инсулина/анализы аутофосфорилирования рецепторов инсулина
Связывание инсулина и передачу сигнала с помощью различных полученных аналогов инсулина определяли с помощью анализа связывания и анализа аутофосфорилирования рецепторов.
А) Анализ аффинности связывания с рецепторами инсулина
Аффинность связывания с рецепторами инсулина для аналогов, перечисленных в таблице 1, определяли согласно описанному в Hartmann et al. (Effect of the long-acting insulin analogs glargine and degludec on cardiomyocyte cell signaling and function. Cardiovasc Diabetol. 2016;15:96). Выделение рецепторов инсулина, встроенных в плазматические мембраны (M-IR), и эксперименты по конкурентному связыванию выполняли, как описано ранее (Sommerfeld et al., PLoS One. 2010; 5(3): e9540). Вкратце, клетки СНО, сверхэкспрессирующие IR, собирали и ресуспендировали в охлажденном на льду буфере 2,25 STM (2,25 М сахароза, 5 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 5 мМ MgCl2, ингибитор протеаз cOmplete) и разрушали с помощью гомогенизатора Даунса с последующей обработкой ультразвуком. Гомогенат покрывали буфером 0,8 STM (0,8 М сахароза, 5 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 5 мМ MgCl2, ингибитор протеаз cOmplete) и подвергали ультрацентрифугированию в течение 90 мин. при 100000 g. Плазматические мембраны на границе раздела фаз собирали и дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Конечный осадок ресуспендировали в буфере для разведения (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 5 мМ MgCl2, ингибитор протеаз cOmplete) и снова гомогенизировали с помощью гомогенизатора Даунса. Эксперименты по конкурентному связыванию выполняли в буфере для связывания (50 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% BSA, ингибитор протеаз cOmplete, доведенный до pH 7,8) в 96-луночных микропланшетах. В каждой лунке 2 мкг выделенных мембран инкубировали с 0,25 мг поливинилтолуоловых и полиэтилениминовых гранул для сцинтилляционного анализа сближения (SPA), покрытых агглютинином из зародышей пшеницы. Человеческий инсулин, меченный [125I], в постоянных концентрациях (100 пМ) и соответствующий немеченый инсулин в различных концентрациях (0,001-1000 нМ) добавляли в течение 12 ч. при комнатной температуре (23°C). Радиоактивность измеряли в равновесном состоянии на сцинтилляционном счетчике для микропланшетов (Wallac MicroBeta, Фрайбург, Германия).
Результаты анализов аффинности связывания с рецепторами инсулина для тестируемых аналогов по сравнению с человеческим инсулином показаны в таблице 2.
B) Анализы аутофосфорилирования рецепторов инсулина (в качестве меры передачи сигнала)
Чтобы определить передачу сигнала при связывании аналога инсулина с рецептором инсулина B, уровень аутофосфорилирования измеряли in vitro.
Клетки СНО, экспрессирующие изоформу В рецептора человеческого инсулина (IR-B), использовали для анализов аутофосфорилирования IR с использованием технологии In-Cell Western, описанной ранее (Sommerfeld et al., PLoS One. 2010; 5(3): e9540). Для анализа аутофосфорилирования IGF1R рецептор сверхэкспрессировали в клеточной линии фибробластов 3T3 Tet-off эмбриона мыши (BD Bioscience, Гейдельберг, Германия), которая была стабильно трансфицирована плазмидой экспрессии IGF1R, регулируемой тетрациклином. Для определения уровня фосфорилирования тирозина рецептора клетки высевали на 96-луночные планшеты и выращивали в течение 44 ч. Клетки подвергали сывороточному голоданию в бессывороточной среде Хэма F12 (Life Technologies, Дармштадт, Германия) в течение 2 ч. Затем клетки обрабатывали человеческим инсулином либо аналогом инсулина в возрастающих концентрациях в течение 20 мин. при 37°C. После инкубирования среду сливали, и клетки фиксировали в свежеприготовленном 3,75% параформальдегиде в течение 20 мин. Клетки пермеабилизировали с помощью 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 20 мин. Блокирование выполняли с помощью блокирующего буфера Odyssey (LICOR, Бад-Хомбург, Германия) в течение 1 часа при комнатной температуре. Антитело к pTyr 4G10 (Millipore, Швальбах, Германия) инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. После инкубирования первичного антитела клетки промывали с помощью PBS+0,1% Tween 20 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Вторичное антитело к IgG мыши 800-CW (LICOR, Бад-Хомбург, Германия) инкубировали в течение 1 ч. Результаты нормализовали посредством количественного определения ДНК с помощью красителя TO-PRO3 (Invitrogen, Карлсруэ, Германия). Данные получали в виде относительных единиц (RU).
Результаты анализов аутофосфорилирования рецепторов инсулина для тестируемых аналогов по сравнению с человеческим инсулином показаны в таблице 2.
Таблица 2. Относительные значения аффинности связывания с рецепторами инсулина и активности аутофосфорилирования для тестируемых аналогов человеческого инсулина (последовательности см. в таблице 1).
* по сравнению с человеческим инсулином, nd: не определено
** значение 0 означает, что аффинность связывания была ниже предела обнаружения
C) Выводы
Как можно видеть из таблицы 2, были протестированы различные замены в положениях B16 и/или B25 гидрофобными аминокислотами (триптофаном, аланином, валином, лейцином и изолейцином). Хотя и в различной степени, все тестируемые аналоги инсулина с заменами гидрофобными аминокислотами в этих положениях показали уменьшение активности связывания с рецепторами инсулина. По сравнению с заменами на Trp (см., например, аналоги 4, 15 и 23) замены алифатическими аминокислотами, такими как аланин, валин, лейцин и изолейцин, оказали более сильное влияние на активность связывания с рецепторами инсулина. Наиболее сильные эффекты наблюдались для валина, лейцина и изолейцина, которые являются аминокислотами с разветвленной цепью. Замены изолейцином, валином и лейцином приводили к значительному уменьшению активности связывания с рецепторами инсулина. Интересно, что аналоги инсулина с такими заменами в положении B25 (такими как замена валином, лейцином или изолейцином в B25, аналоги 11, 12, 22, 24, 25, 29, 30, 32, 33, 35, 38, 39, 40) демонстрировали усиление передачи сигнала вплоть до 6-кратного по сравнению с тем, что ожидалось, исходя из их значений аффинности связывания с IR-B. В частности, Leu(B25)Des(B30)-инсулин и Val(B25)Des(B30)-инсулин (аналоги 11 и 12 соответственно) демонстрировали только 1% связывание с рецептором инсулина B и 6% аутофосфорилирование по сравнению с человеческим инсулином. Аналогичным образом, одиночная замена лейцином в положении B16 (аналог 3) также демонстрировала аналогичное усиление передачи сигнала, хотя и в несколько меньшей степени. Для сравнения, аналоги, содержащие замену гистидином в B25 (аналоги 10, 13, 14, 21, 28), за исключением аналога 26, также демонстрировали сниженное связывание с рецепторами, но при этом и сопутствующее снижение аутофосфорилирования.
В некоторых случаях (аналоги 30, 32, 35, 38, 39) связывание с рецепторами инсулина составляло 0%, при этом по-прежнему проявлялась активность в анализе аутофосфорилирования. Все эти аналоги имеют комбинации замен валином и/или изолейцином в положениях B16 и B25 совместно, что позволяет предположить, что комбинация отвечает за дополнительное снижение связывания с рецепторами инсулина. Варианты инсулина без замены в положении B25, но с заменами в положении B16 характеризовались немного более высокими значениями аффинности связывания по сравнению с их значениями аутофосфорилирования (аналоги 3, 4, 16, 17, 18, 19, 20).
Аланин в положении B25 демонстрирует эффекты, аналогичные замене валином, лейцином или изолейцином (аналоги 11, 12, 22), хотя и в меньшей степени. Аффинность связывания с рецепторами и активность аутофосфорилирования у аналогов с заменой валином, лейцином или изолейцином является более низкой, чем у аналогов с заменой аланином.
Пример 3. Определение стабильности in vitro в различных рекомбинантных протеазах и искусственном желудочном соке
Аналоги инсулина тестировали в отношении протеолитической стабильности (к α-химотрипсину, катепсину D, ферменту, разрушающему инсулин (IDE), и искусственному желудочному соку).
А) Условия анализа
B) Получение искусственного желудочного сока
Два грамма хлорида натрия и 3,2 г очищенного пепсина (из слизистой оболочки желудка свиньи с активностью от 800 до 2500 единиц на мг белка) растворяли в 7,0 мл хлористоводородной кислоты. Объем доводили водой до 1000 мл. Полученный раствор перемешивали и доводили с помощью 0,2 н. гидроксида натрия либо 0,2 н. хлористоводородной кислоты до pH 1,2±0,1.
C) Общая процедура анализа
Определение стабильности проводили с использованием соответствующих моментов времени (для SIF и SGF 15, 30, 60, 120 и 240 минут; для протеаз 15, 30, 60 и 120 минут). Инкубирование проводили при 37°C, и % оставшегося исходного соединения рассчитывали относительно момента времени T0.
Для определения исходного соединения использовали соответствующий биоаналитический способ LC-MS/MS или LC-HRMS, используя надосадочную жидкость после осаждения белка этанолом (1 экв. об./об.) и стадии центрифугирования.
D) Получение образцов
Соединения растворяли в разбавленной хлористоводородной кислоте до конечной концентрации 40 мкМ. Концентрация соединения в анализе составляла 2 мкМ. Разведение рабочего раствора 1:20 осуществляли в буфере для протеазы, и затем образцы инкубировали при 37°C при перемешивании. В соответствующий момент времени после взятия аликвоты реакционную смесь гасили этанолом (1 экв. об./об.), затем центрифугировали. Надосадочную жидкость анализировали.
E) Выводы
В частности, были исследованы замены липофильными аминокислотами, такими как валин и изолейцин, в положениях 16 и 25 в B-цепи. У тестируемых аналогов (2, 7, 11, 12, 14, 16, 19, 22, 23, 24 и 38) наблюдались лишь незначительные различия в стабильности по отношению к протеазам трипсину, карбоксипептидазе A и карбоксипептидазе B по сравнению с человеческим инсулином (данные не показаны). В целом, все аналоги, содержащие замену в положениях A14 и B25 (аналоги 22, 24, 38), демонстрировали улучшенную протеолитическую стабильность по отношению к α-химотрипсину, катепсину D и ферменту, разрушающему инсулин (IDE). Например, в случае с α-химотрипсином человеческий инсулин полностью разрушался в течение 2 часов, тогда как аналог 22 был почти полностью устойчивым. Аналогичным образом, все тестируемые аналоги с заменой в B25 демонстрировали улучшенную стабильность по отношению к катепсину D, хотя аналог 38 (вариант B16/B25) демонстрировал более высокую стабильность по сравнению с другими вариантами B25.
Одно заметное исключение наблюдалось в случае c IDE, где аналог 19 с заменами в A14/B16 демонстрировал улучшенные функциональные характеристики по сравнению с вариантами B25. Однако данные позволяют предположить, что замена глутаминовой кислотой в A14, тестируемая в этом случае, важна для увеличения стабильности. Было показано, что другие замены также полезны для увеличения стабильности: такие как замены в положении B16 и в положении B25. Например, у аналога 7 замена аминокислоты в положении B25 приводит к увеличению нестабильности.
Таблица 3. Процент оставшегося аналога инсулина после инкубирования различных аналогов инсулина в течение 30 или 120 минут с четырьмя различными протеазами (последовательности тестируемых аналогов см. в таблице 1).
(30 минут) [%]
(30 минут) [%]
nd: не определено
ПУНКТЫ ОПИСАНИЯ
Следующие пункты являются частью описания.
1. Аналог инсулина, содержащий по меньшей мере одну мутацию по сравнению с исходным инсулином, где аналог инсулина содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью.
2. Аналог инсулина согласно пункту 1, где исходный инсулин представляет собой человеческий инсулин, свиной инсулин или бычий инсулин.
3. Аналог инсулина согласно пунктам 1 и 2, где аминокислота с разветвленной цепью выбрана из группы, состоящей из валина (Val), изолейцина (Ile) и лейцина (Leu).
4. Аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-3, где указанный аналог инсулина дополнительно содержит мутацию в положении A14, которая представляет собой замену аминокислотой, выбранной из группы, состоящей из глутаминовой кислоты (Glu), аспарагиновой кислоты (Asp) и гистидина (His).
5. Аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-4, где указанный аналог инсулина дополнительно содержит мутацию в положении B30.
6. Аналог инсулина согласно пункту 5, где мутация в положении B30 представляет собой делецию аминокислоты в положении B30 исходного инсулина (мутацию Des(B30)).
7. Аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-6, где указанный аналог инсулина дополнительно содержит мутацию в положении B3, которая представляет собой замену глутаминовой кислотой (Glu).
8. Аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-7, где указанный инсулин дополнительно содержит мутацию в положении A21, которая представляет собой замену глицином (Gly).
9. Аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-8, где B-цепь аналога инсулина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPK (SEQ ID NO: 22),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 44),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 48),
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 50),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 58),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 60),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 64),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 66),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPK (SEQ ID NO: 70),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 76),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 78),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK (SEQ ID NO: 80),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFLYTPKT (SEQ ID NO: 85),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 86),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 87),
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 88),
FVEQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 89),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 90),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 91),
FVNQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 92),
FVEQHLCGSHLVEALILVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 93),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFIYTPKT (SEQ ID NO: 94),
FVNQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 95),
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 96) и
FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPKT (SEQ ID NO: 97), или состоит из нее.
10. Аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-9, содержащий:
А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK),
А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), или
А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
11. Аналог инсулина, выбранный из группы, состоящей из:
человеческого Leu(B16)-инсулина,
человеческого Val(B16)-инсулина,
человеческого Ile(B16)-инсулина,
человеческого Leu(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Val(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Ile(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Leu(B25)-инсулина,
человеческого Val(B25)-инсулина,
человеческого Ile(B25)-инсулина,
человеческого Leu(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина и
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина.
12. B-цепь инсулина, содержащая по меньшей мере одну мутацию по сравнению с B-цепью исходного инсулина, где B-цепь содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и где указанная B-цепь инсулина необязательно дополнительно содержит мутацию в положении B30, где мутация в положении B30 представляет собой делецию треонина в положении B30 исходного инсулина (мутацию Des(B30)).
13. Проинсулин, содержащий A-цепь инсулина и B-цепь инсулина, где B-цепь инсулина содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с B-цепью исходного инсулина, где B-цепь содержит мутацию в положении B16, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и/или мутацию в положении B25, которая представляет собой замену аминокислотой с разветвленной цепью, и где A-цепь инсулина в указанном проинсулине необязательно содержит мутацию в положении A14, которая представляет собой замену аминокислотой, выбранной из глутаминовой кислоты (Glu), аспарагиновой кислоты (Asp) и гистидина (His).
14. Полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-11, B-цепь инсулина согласно пункту 12 и/или проинсулин согласно пункту 13.
15. Клетка-хозяин, содержащая аналог инсулина согласно любому из пунктов 1-11, В-цепь инсулина согласно пункту 12, проинсулин согласно пункту 13 и/или полинуклеотид согласно пункту 14.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Sanofi
<120> Аналоги инсулина, характеризующиеся сниженной аффинностью
связывания с рецепторами инсулина
<130> DE2018/059
<150> EP 18 306 657.0
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 658.8
<151> 2018-12-11
<150> EP 18 306 659.6
<151> 2018-12-11
<160> 97
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Цепь A
<400> 1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 2
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Цепь B
<400> 2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 3
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 3
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 4
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 5
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 5
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 6
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 6
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 7
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 7
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 8
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 8
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 9
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 9
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 10
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 10
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 11
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 11
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 12
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 12
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 13
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 13
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 14
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 14
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 15
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 15
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 16
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 16
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 17
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 17
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 18
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 18
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Glu Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 19
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 19
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 20
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 20
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 21
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 21
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 22
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 22
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Leu Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 23
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 23
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 24
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 24
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 25
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 25
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 26
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 26
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 27
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 27
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 28
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 28
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 29
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 29
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 30
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 30
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 31
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 31
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 32
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 32
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 33
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 33
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 34
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 34
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Trp
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 35
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 35
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 36
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 36
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 37
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 37
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 38
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 38
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 39
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 39
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 40
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 40
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 41
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 41
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 42
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 42
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 43
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 43
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 44
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 44
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 45
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 45
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 46
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 46
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 47
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 47
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 48
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 48
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 49
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 49
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 50
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 50
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 51
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 51
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 52
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 52
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Glu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 53
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 53
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 54
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 54
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 55
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 55
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 56
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 56
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu His
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe His Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 57
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 57
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 58
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 58
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 59
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 59
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 60
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 60
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 61
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 61
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 62
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 62
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 63
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 63
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 64
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 64
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 65
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 65
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 66
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 66
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 67
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 67
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 68
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 68
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Leu
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ala Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 69
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 69
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 70
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 70
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 71
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 71
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 72
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 72
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 73
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 73
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 74
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 74
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 75
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 75
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 76
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 76
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 77
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 77
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 78
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 78
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 79
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь A
<400> 79
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Glu Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210> 80
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 80
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 81
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Bos
<220>
<223> Цепь A
<400> 81
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Ala Ser Val Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 82
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Bos
<220>
<223> Цепь B
<400> 82
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
20 25 30
<210> 83
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Sus
<220>
<223> Цепь A
<400> 83
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 84
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Sus
<220>
<223> Цепь B
<400> 84
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Ala
20 25 30
<210> 85
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 85
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Leu Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 86
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 86
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 87
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 87
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 88
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 88
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 89
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 89
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 90
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 90
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 91
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 91
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 92
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 92
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 93
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 93
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 94
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 94
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Ile Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 95
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 95
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 96
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 96
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<210> 97
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Цепь B
<400> 97
Phe Val Glu Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Val
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Val Tyr Thr Pro Lys
20 25
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОНЪЮГАТЫ ИНСУЛИНА | 2019 |
|
RU2809189C2 |
| ИНСУЛИН И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ С ПОВЫШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ЦИНК | 1997 |
|
RU2176646C2 |
| НОВЫЕ АНАЛОГИ ИНСУЛИНА С ПОВЫШЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ ЦИНКА | 1999 |
|
RU2225723C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ИЛИ ПРОИЗВОДНЫХ ИНСУЛИНА С ПРАВИЛЬНО СОЕДИНЕННЫМИ ЦИСТИНОВЫМИ МОСТИКАМИ | 2002 |
|
RU2302882C2 |
| УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА С ПРАВИЛЬНО СОЕДИНЕННЫМИ ЦИСТИНОВЫМИ МОСТИКАМИ | 1998 |
|
RU2205836C2 |
| Аналоги инсулина | 2017 |
|
RU2769476C2 |
| Аналоги инсулина с пониженной аффинностью к рецептору инсулина и их применение | 2017 |
|
RU2764197C1 |
| ИНСУЛИН, СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ ГАЛОГЕНОМ | 2009 |
|
RU2555557C2 |
| АНАЛОГИ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, РАСТВОР ДЛЯ ИНЪЕКЦИЙ | 1986 |
|
RU2104305C1 |
| КОНЪЮГАТЫ ИНСУЛИН-ИНКРЕТИН | 2014 |
|
RU2678134C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению аналогов инсулина, и может быть использовано для рекомбинантного получения проинсулина и инсулина человека с заменой Glu(A14) в комбинации с дополнительными модификациями, включающими замену в положении B16 и/или B25 на аминокислоту с разветвленной цепью. Изобретение обеспечивает получение аналога человеческого проинсулина и инсулина, имеющего сниженную аффинность связывания с рецепторами инсулина. 9 н.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.
1. Аналог инсулина, имеющий сниженную аффинность связывания с рецепторами инсулина, содержащий
(а) А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 43 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 44 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFIYTPK),
(b) А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 47 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 48 (FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFVYTPK), или
(c) А-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 77 (GIVEQCCTSICSLEQLENYCN), и B-цепь, имеющую аминокислотную последовательность, показанную под SEQ ID NO: 78 (FVEQHLCGSHLVEALVLVCGERGFVYTPK).
2. Аналог инсулина, имеющий сниженную аффинность связывания с рецепторами инсулина, где указанный аналог выбран из группы, состоящей из:
человеческого Glu(A14)Leu(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Leu(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)Des(B30)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Ile(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Ile(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Ile(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Ile(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Val(B16)Val(B25)-инсулина,
человеческого Glu(A14)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина и
человеческого Glu(A14)Gly(A21)Glu(B3)Val(B16)Val(B25)-инсулина.
3. Проинсулин для получения аналога инсулина по п. 1 или 2, где указанный проинсулин содержит A-цепь и B-цепь аналога инсулина по п. 1 или 2.
4. Полинуклеотид для получения аналога инсулина по любому из пп. 1, 2, где указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аналог инсулина по любому из пп. 1, 2.
5. Полинуклеотид для получения проинсулина по п. 3, где указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую проинсулин по п. 3.
6. Полинуклеотид для получения аналога инсулина по любому из пп. 1, 2 и проинсулина по п. 3, где указанный полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аналог инсулина по любому из пп. 1, 2 и проинсулин по п. 3.
7. Клетка-хозяин для получения аналога инсулина по любому из пп. 1, 2, где указанная клетка содержит экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 4.
8. Клетка-хозяин для получения проинсулина по п. 3, где указанная клетка содержит экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 5.
9. Клетка-хозяин для получения аналога инсулина по любому из пп. 1, 2 и проинсулина по п. 3, где указанная клетка содержит экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 6.
| GLENDORF T | |||
| ET AL | |||
| Importance of the solvent-exposed residues of the insulin B chain alpha-helix for receptor binding, BIOCHEMISTRY, 2008, v | |||
| Способ очищения сернокислого глинозема от железа | 1920 |
|
SU47A1 |
| Устройство для электрической сигнализации | 1918 |
|
SU16A1 |
| Устройство для устранения перемагничивания полюсов компаунд-машин с самовозбуждением | 1926 |
|
SU4743A1 |
| XU BIN ET AL | |||
| Diabetes-associated mutations in insulin: Consecutive residues in the B chain contact distinct domains of the insulin receptor, BIOCHEMISTRY, 2004, v | |||
| Зубчатое колесо со сменным зубчатым ободом | 1922 |
|
SU43A1 |
| Прибор для получения стереоскопических впечатлений от двух изображений различного масштаба | 1917 |
|
SU26A1 |
