ИНСУЛИН И ЕГО ПРОИЗВОДНЫЕ С ПОВЫШЕННОЙ СПОСОБНОСТЬЮ СВЯЗЫВАТЬ ЦИНК Российский патент 2001 года по МПК C07K14/62 A61K38/28 A61P5/50 

Изобретение относится к инсулину и его производным с повышенной способностью связывать цинк.

Фармакинекокинетика введенного подкожно инсулина зависит от его ассоциативного поведения. Инсулин образует в нейтральном водном растворе гексамеры. Если инсулин хочет проникнуть из ткани в поток крови и попасть к месту, где он оказывает воздействие, то инсулин должен сначала миновать стенки капиллярных сосудов. Предполагают, что это возможно только для мономерного и для димерного инсулина - и невозможно или лишь слегка возможно для гексамерных инсулинов и высокомолекулярных ассоциатов (Brange et al., Diabetes Care: 13 (1990), страницы 923-954; Kang et al., Diabetes Care: 14 (1991), страницы 942-948). Поэтому диссоциация изомера является предпосылкой для быстрого перехода из подкожной ткани в поток крови.

Ассоциативное и агрегатное поведение инсулина находится под влиянием цинка⁺⁺, который приводит к стабилизации гексамера и при значениях pH вокруг нейтральной точки к образованию высокомолекулярных агрегатов вплоть до преципитации. Цинк⁺⁺ в качестве добавки к незабуференному раствору инсулина человека (pH 4) оказывает лишь незначительное влияние на профиль действия. Несмотря на то что такой раствор после инъекции в подкожном слое ткани быстро нейтрализуется и образуются инсулиноцинковые комплексы, естественной способностью связывать цинк, которой обладает человеческий инсулин, недостаточно для того, чтобы стабилизировать гексамеры и высшие агрегаты. Поэтому благодаря добавке цинка⁺⁺ освобождение человеческого инсулина замедляется незначительно и не достигается сильного эффекта продленного действия. Известные гексамеры инсулина показывают содержание около 2 моль цинка⁺⁺ на моль гексамера инсулина (Blundell et al., Adv. Protein Chem.: 26 (1972), страницы 323-328). Два иона цинка на гексамер инсулина прочно связаны с гексамером инсулина и не могут быть удалены с помощью обычного диализа. Были описаны именно так называемые 4-цинк-инсулиновые кристаллы, однако эти кристаллы содержат в средстве только менее чем три моля цинка⁺⁺ на моль гексамера (G.D. Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA: 81, страницы 7093-7097).

Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы найти производные инсулина, которые обладают повышенной способностью связывать цинк, образуют стабильный комплекс, содержащий гексамер инсулина и цинк⁺⁺ и имеют замедленный профиль действия при подкожных инъекциях по сравнению с инсулином человека.

Итак, были найдены инсулины формулы 1

и/или физиологически совместимые соли инсулинов формулы I, которые выполняют названные выше критерии и отличаются тем, что
R¹ представляет фенилаланиловый остаток или атом водорода,
R³ представляет генетически кодируемый остаток аминокислоты,
Y представляет генетически кодируемый остаток аминокислоты,
Z означает а) остаток аминокислоты His или б) пептид с 2-35 генетически способными к кодированию остатками аминокислот, содержащими 1-5 гистидиновых остатка,
а остатки А2-А20 соответствуют последовательности аминокислот А-цепи инсулина человека, животного инсулина или производному инсулина,
а остатки B2-B29 соответствуют последовательности аминокислот B-цепи инсулина человека, животного инсулина или производному инсулина.

В частности, предпочтительным является инсулин формулы I, где
R¹ означает фенилаланиновый остаток,
R³ означает остаток аминокислоты из группы Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu и Gln,
Y означает остаток аминокислоты из группы Ala, Thr, Ser и His,
Z означает а) остаток аминокислоты His или б) пептид с 4-7 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина.

Далее, предпочтительным является инсулин формулы I, где
R¹ означает фенилаланиновый остаток,
R³ означает остаток аминокислоты из группы Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu и Gln,
Y означает остаток аминокислоты из группы Ala, Thr, Ser и His,
Z означает а) остаток аминокислоты His или б) пептид с 4-7 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина.

Особенно предпочтительными является инсулин 1, где
Z представляет пептид с 1-5 остатками аминокислоты, содержащими 1-2 остатка гистидина.

В частности, предпочтительным является инсулин формулы I, где
R¹ означает фенилаланиновый остаток,
R³ означает остаток аминокислоты из группы Asn и Gly,
Y означает остаток аминокислоты из группы Thr и His,
a Z означает пептид с 1-5 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина.

Далее, предпочтительным является инсулин формулы I, где
R¹ означает остаток фенилаланина, R³ представляет остаток глицина, Y означает остаток треонина, а Z представляет пептид с 1-5 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина.

Совсем особенно предпочтительным является инсулин формулы I, где
Z означает пептид с последовательностью His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg или Ala Ala His His.

Последовательность аминокислоты пептидов и протеинов обозначается, начиная с N-терминального конца цепи аминокислоты. Данные, приведенные в формуле I в скобках, например A1, A6, A7, A11, A20, B1, B7, B19 или B30, соответствуют позиции остатков аминокислоты в цепи A или B инсулина.

Понятие "генетически кодируемый остаток аминокислоты" представляет остатки аминокислот Cly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro и селеноцистеина.

Под понятиями "остатки A2-A20" и "остатки B2-B29" животного инсулина понимают, например, последовательности аминокислот инсулина из крупного рогатого скота, свиней и кур.

Понятие остатки A2-A20 и B2-B29 производных инсулина представляет соответствующие последовательности аминокислот инсулина человека, которые образуются заменой аминокислот другими генетически кодируемыми аминокислотами.

Цепь А инсулина человека имеет следующую последовательность (Seq Id N 1):
Gly, Ile, Val, Glu, Gln, Cys, Cys, Thr, Ser, Ile, Cys, Ser, Leu, Tyr, Gln, Leu, Glu, Asn, Tyr, Cys, Asn.

Цепь B инсулина человека имеет следующую последовательность (Seq Id N 2):
Phe, Val, Asn, Gin, His, Leu, Cys, Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu, Ala, Leu, Tyr, Leu, Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr, Thr, Pro, Lys, Thr.

Производное инсулина формулы I может быть образовано с помощью множества генно-инженерных конструктов в микроорганизмах (ЕР 0489780, ЕР 0347781, ЕР 0368187, EP 0453969). Генно-инженерные конструкты экспримируются в такие микроорганизмы, как Escherichia coli или Streptomyceten во время ферментации. Образованные протеины откладываются внутри микроорганизмов (ЕР 0489780) или выделяются в ферментационный раствор.

Примерами инсулинов формулы I являются:
Gly(A21)-Humaninsulin-His(B31)-His(B32)-OH
Gly(A21)-Humaninsulin-His(B31)-His(B32)-Arg(B33)-OH
Gly(A21)-Humaninsulin-Ala(B31)-His(B32)-His(B33)-OH
Gly(A21)-Humaninsulin-Ala(B31) -His(B32)-His(B33) -Arg(B34)-OH
Gly(A21)-Humaninsulin-Ala(B31) -Ala(B32)-His(B33) -His(B34)-OH
Gly(A21)-Humaninsulin-Ala(B31) -Ala(B32)-His(B33) -His(B34)-Arg(B35)-OH
Получение производных инсулина 1 осуществляется в основном генно-инженерным способом с помощью сайт-направленного мутагенеза по стандартной методике. Для этого конструируется генная структура, осуществляющая кодирование для желаемого производного формулы I и помещается в клетку хозяина - предпочтительным образом в бактерию, такую как E.coli или дрожжи, в частности Saccharomyces cerevisiae, - для экспрессии и, если структура гена осуществляет кодирование для слитого протеина, то производное инсулина формулы I освобождается из слитого протеина, аналогичные методы описаны в EP-A-0211299, EP-A-0227938, EP-A-0229998, EP 286956 и в заявке ФРГ на выдачу патента P 3821159.

Отщепление фракции слитого протеина осуществляется после вскрытия клетки либо химическим путем с помощью галогенциана - смотри EP-A-0180920 - или ферментативным путем с помощью лизостафина - смотри DE-A-3739347.

Затем предшественник инсулина подвергается окислительному сульфитолизу в соответствии с методикой, описанной, например, в R.C. Marshall и A.S. Inglis in "Practical Protein Chemistry - A Handbook" (Издатель A. Darbre) 1986, страницы 49-53, а затем в присутствии тиола при образовании корректных дисульфидных мостиков ренатурируется, например, в соответствии с методикой, описанной G.H. Dixon и A.C. Wardlow in Nature (1960), на страницах 721-724.

Предшественники инсулина могут, однако, также прямо складываться (EP-A-0600372; EP-A-0668292).

Пептид "С" U - в случае наличия - предпоследовательность (R² в формуле II) удаляется с помощью триптического отщепления - например, в соответствии с методикой Kemmler и др. J.B.C. (1971), страницы 6786-6791, а производное инсулина формулы I с помощью известных технологий, как например хроматография - EP-A-0305760 - и кристаллизация.

Далее, изобретение касается комплексов, содержащих гексамер инсулина и приблизительно 5-9 молей цинка на гексамер инсулина, предпочтительным образом 5-7 молей цинка⁺⁺ на гексамер инсулина, причем гексамер инсулина состоит из шести молекул инсулина формулы I.

Связь цинка с гексамером инсулина настолько прочна, что 5-9 молей цинка⁺⁺ на моль гексамера инсулина не могут быть удалены вследствие 40 часов проведения обычного диализа, например с помощью водного 10 мМ Tris/HCl-буфера, pH 7,4.

Инсулин формулы I показан в виде подкожного введения, в основном в составе, не содержащем цинка (pH 4), очень малое замедление действия по сравнению с инсулином человека. После добавления приблизительно 20 мг Zink²⁺ на/мл состава после подкожного введения наблюдается более позднее наступление действия. Замедление действия наблюдается предпочтительным образом при 40 μg Zink²⁺/мл. Более высокие концентрации цинка усиливают этот эффект.

Далее, изобретение касается препроинсулина формулы II,
R²R¹B2-B29-Y-Z-Cly-A2-A20-R³
причем R³ и Y, определены в формуле I согласно одному или нескольким пунктам 1-6 формулы изобретения, а
R¹ представляет фенилаланиловый остаток или ковалентную связь, а
R² представляет а) генетически кодируемый остаток аминокислот или б) пептид с 2-45 остатками аминокислот, а остатки A2-А20 и B2-B29 соответствуют последовательностям аминокислот в цепях А и В инсулина человека, животного инсулина или производному инсулина и при этом
Z означает пептид с 2-40 генетически кодируемыми эфирами аминокислот c 1-5 гистидин(His)-остатками.

Проинсулин формулы II пригоден в качестве промежуточного соединения при изготовлении инсулинов формулы I.

Предпочтительными являются проинсулины формулы II, при этом
R² представляет пептид с 2-25 остатками аминокислоты.

В частности, предпочтительными являются проинсулины формулы II, причем
R² означает пептид с 2-15 остатками аминокислоты, в котором на конце карбоксила находится остаток аминокислоты из группы Met, Lys и Arg.

Производные инсулина формулы I по изобретению и/или комплексы, содержащие гексамер инсулина и 5-9 моль цинка⁺⁺ на гексамер и/или их физиологически совместимые соли (например, соли щелочных металлов или аммония), применяются в основном как биологически активные вещества фармацевтического препарата для лечения диабета, в частности диабета mellitus.

Фармацевтический препарат - это предпочтительным образом раствор или суспензия для целей инъекции; она характеризуется содержанием по меньшей мере одного производного инсулина формулы I, и/или комплекса по изобретению, и/или по меньшей мере одной из их физиологически совместимых солей в растворенной, аморфной и/или кристаллической - предпочтительным образом в растворенной - форме.

Препарат имеет предпочтительным образом значение pH, равное приблизительно от 2,5 до 8,5, в частности приблизительно от 4,0 до 8,5, содержит соответствующее изотоническое средство, соответствующее консервирующее средство и при необходимости соответствующий буфер, а также предпочтительным образом также определенную концентрацию ионов цинка, все это, разумеется, в стерильном водном растворе. Совокупность компонентов препарата кроме активного биологического вещества образует раствор-носитель препарата.

Препараты, содержащие растворы инсулина формулы I, имеют значение pH от 2,5 до 4,5, в частности от 3,5 до 4,5, предпочтительным образом 4,0.

Препараты, содержащие суспензии инсулина формулы I, имеют значение pH, равное 6,5-8,5, в частности 7,0-8,0, предпочтительным образом 7,4.

Подходящими изотоническими средствами являются, например, глицерин, глюкоза, маннит, NaCl, соединения кальция и магния, как например CaCl₂ или MgCl₂.

Путем выбора изотонического средства и/или консервирующего вещества оказывают влияние на растворимость производного инсулина и его физиологически совместимой соли со слабо кислыми значениями pH.

Соответствующими консервирующими средствами являются, например, фенол, м-крезол, бензиловый спирт и/или сложный эфир п-гидроксибензойной кислоты.

В качестве буферных веществ, в частности, для установления значения pH между приблизительно 4,0 и 8,5 могут, например, использоваться ацетат натрия, цитрат натрия или фосфат натрия. В остальном для установления значения pH пригодны также физиологически приемлемые разбавленные кислоты (типичный случай HCl) или щелочные растворы (типичный случай NaOH).

Если препарат содержит цинк, то это содержание составляет от 1 мкг до 2 мг цинка⁺⁺/мл, в частности от 5 до 200 мкг цинка/мл.

С целью получения вариантов профиля действия препарата по изобретению можно примешивать также перемодифицированный инсулин, предпочтительным образом инсулин крупного рогатого скота, свиней или человека, в частности инсулин человека, или модифицированные инсулины, например мономерные инсулины, быстродействующие инсулины или инсулин человека Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32).

Предпочтительные концентрации активного вещества соответствуют приблизительно 1-1500, далее предпочтительным образом приблизительно 40-400 международных единиц/мл.

ПРИМЕР 1
Получение Gly(A21)-инсулин человека-His(B31)- His(B32)-ОН
Получение экспрессионной системы осуществлялось, в основном, в соответствии с патентом США 5358857. Там описываются также векторы p1NT 90d и p1NT 91d (смотри пример 17) и PCR Primer TIR Insull. Эти четыре компонента служат, кроме всего прочего, в качестве исходного материала для векторных конструкций, которые описываются ниже.

Прежде всего в мини-проинсулин-кодирующую последовательность вводится кодон для Gly (A21). Для этого используется p1NT 91d в качестве модели и реакция PCR проводится с праймерами TIR и Insu31
Insu31 (Seq Id N 10):
5'TTT TTT GTC GAC СТА TTA GCA GTA GTT CTC CAG CTG 3'
Цикл PCR осуществляется следующим образом: 1) минута 94^oC, 2) минута 55^oC, 3) минута 72^oC. Этот цикл повторяется 25 раз, затем 7 минут производится инкубирование при 72^oC, а затем инкубируют в течение ночи при 4^oC.

Полученный фрагмент PCR выделяют для очистки в этаноле, сушат, а затем в рестрикционном буфере в соответствии с данными изготовителей переваривают с рестрикционными энзимами Nc01 Sail. Затем реакционную смесь разделяют гельэлектрофорезом, а фрагмент Nc01-Prae-проинсулин-Sall изолируют. DNA плазмиды plNT 90d также расщепляют с помощью Nc01 и Sall, а фрагмент проинсулина обезьяны таким же образом освобождают от остаточной плазмиды p1NT. Оба фрагмента разделяют с помощью гелевого электрофореза, а остаточную плазмиду DNA изолируют. Эту DNA вводят в реакцию лигазы с фрагментом Nc01-Sall-PCR. Таким образом, получают плазмиду plNT 150d, которая после трансформации в E.coli размножается там, а затем изолируется.

DNA плазмиды plNT 150d служат в качестве исходного материала для плазмиды plNT 302, которая позволяет получать желаемый вариант инсулина.

Для конструирования этой плазмиды идут путем, описанным в патенте США 5358857 (смотри пример 6). Для этого проводят две независимые друг от друга реакции PCR, для которых в качестве модели служит DNA плазмиды plNT 150d. Одна реакция проводится с помощью пары праймеров TIR и plNT B5 (Seq Id N 11):
5'GAT GCC GCG GGT CTT GGG TGT GTAG 3'
а другая реакция - с помощью пары праймеров Insu11 и plNT В6 (Seq Id N 12):
5' A CCC AAG ACC CGC GGC TC GTG GAG 3'
Возникающие фрагменты PCR являются частично комплементарными, так что они в третьей реакции PRC ведут к фрагменту, который производит кодировку для микроинсулина Gly (A21), удлиненного на позицию B31 и B32. Этот фрагмент расщепляют с помощью Nc01 и Sall, а затем вводят в реакцию лигазы с DNA описанной остаточной плазмиды plNT90d с получением плазмиды plNT 302. Трансформированный этой плазмидой E. coli K12 W3110 далее ферментируется, как представлено в примере 4 патента США US 5227293, и перерабатывается.

Полученное в качестве промежуточного продукта производное препроинсулина перед расщеплением трипсина имеет следующую последовательность аминокислот:
Препроинсулин I (Seq Id N 3):
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Туг Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Туг Thr Pro Lys Thr
His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Препроинсулин 1 соответствует формуле II, при этом
R² означает пептид с 11 остатками аминокислот,
R¹ Phe (B1),
Y Thr (B30),
Z His His Arg (B31-B33),
R³ Gly (A21) и
A2-A20 является последовательностью цепи А инсулина человека (остатки аминокислоты 2-20), а B2-B29 являются последовательностью цепи В человеческого инсулина (остатки аминокислот 2-29).

Расщепляют препроинсулин 1 так, как это описано в патенте США US 5227293 согласно примеру 4, с помощью трипсина. Затем полученный продукт вводят в реакцию с карбоксипептидазой В в соответствии с примером 11 с получением инсулина 1. Инсулин 1 соответствует формуле I, при этом
R¹ означает Phe (B1),
Y означает Thr (B30),
Z His His Arg (B31-B32),
R³ - Gly (A21) и
A2-A20 представляют собой последовательность аминокислот цепи А человеческого инсулина (остатки аминокислоты 2-20), а B2-B29 являются последовательностью цепи B человеческого инсулина (остатки аминокислот 2-29).

Инсулин 1 имеет следующую последовательность аминокислот:
Insulin 1 (Seq Id N 4):
Цепь В: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr His His
Цепь A: Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
(Дисульфидные мостики, как представлено в формуле I).

ПРИМЕР 2
Получение Gly (A21)-инсулин человека-Ala(B31)- His(B32)-His(B33)- Arg(B34)-OH
Вектор экспрессии конструируется в соответствии с примером 1.

Плазмида plNT 150d служит в качестве модели для двух независимых друг от друга реакций PCR с парами праймеров TIR и plNT B7 (Seq Id N 13):
5' GAT GCC GCG GGT CTT GGG TGT GTAG 3'
или соответственно Insull и plNT B8 (Seq Ind N 14):
5' ACCC AAG ACC CGC GGC ATC GTG GAG 3'
Фрагменты PCR, к возникновению которых ведут обе реакции, являются частично дополнительными, и дают в третьей реакции PRC комплектную последовательность, которая производит кодировку для желаемого варианта. Фрагмент реакции обрабатывается энзимами с помощью Nc01 und Sall, а затем лигируется в остаточную плазмиду, открытую Nc01/Sall, plNT90d DNA. Возникает плазмида plNT303, которая после трансформации E.coli K12 W3110 сkужит основой для экспрессии желаемого пре-минипроинсулина. Ферментация и переработка происходит так, как это описано в примере 1, причем реакция В карбоксипептидазы отпадает.

Полученное производное препроинсулина имеет следующую последовательность аминокислот:
Препроинсулин 2 (Seq Id N 5):
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Препроинсулин 2 соответствует формуле II, при этом
R¹ означает Phe (B1),
R² означает пептид с 11 остатками аминокислот,
Y означает Thr (B30),
Z - Ala His His Arg (B31-B34),
R³ Gly (A21) и
A2-A20 являются последовательностью аминокислот цепи А инсулина человека (остатки аминокислоты 2-20), а B2-B29 являются последовательностью аминокислот цепи В инсулина человека (остатки аминокислоты 2-29).

Препроинсулин затем вступает в реакцию взаимодействия с трипсином с образованием инсулина 2. Инсулин 2 соответствует формуле II, при этом
R¹ означает Phe (Bl),
Y означает Thr (B30),
Z - Ala His His Arg (B31-B34),
R³ Gly(A21) и
A2-A20 являются последовательностью аминокислот цепи А инсулина человека (остатки аминокислоты 2-20), а B2-B29 являются последовательностью аминокислот цепи В человеческого инсулина (остатки аминокислоты 2-29).

Инсулин 2 имеет следующую последовательность аминокислот:
Инсулин 2 (Seq Ind N 6):
Цепь В: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Туг Thr Pro Lys Thr Ala His His Arg
Цепь A: Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
(Дисульфидные мостики, как представлено в формуле I).

ПРИМЕР 3
Получение Gly(A21)-инсулин человека-Ala(B31)- Ala(B32)-His(B33)-His(B34)-OH
Вектор экспрессии конструируется в соответствии с примером 1.

Плазмида p1NT l50d служит в качестве модели для двух независимых друг от друга реакций PCR с парами праймеров TIR и p1NT B7 (Seq Inb N 15):
5' GAT GCC GCG ATG ATG CGC CGC GGT CTT GGG TGT GTA G 3'
или же соответственно Insu11 и p1NT 316b (Seq Ind N 16):
5' A CCC AAG ACC GCG GCG CAT CAT CGC GGC ATC GTG GAG 3'
Фрагменты PCR, к возникновению которых ведут обе реакции, являются частично дополнительными, и дают в третьей реакции PRC комплектную последовательность, которая производит кодировку для желаемого варианта. Фрагмент реакции обрабатывается энзимами с помощью Nc01 und Sall, а затем лигируется в остаточную плазмиду, открытую Nc01/Sall, plNT 90d DNA. Возникает плазмида plNT 316, которая после трансформации E.coli K12 W3110 служит основой для экспрессии желаемого пре-минипроинсулина. Ферментация и переработка происходит так, как это описано в примере 1, причем реакция В карбоксипептидазы отпадает.

Полученный пепроинсулин 3 имеет следующую последовательность аминокислот:
Препроинсулин 3 (Seq Id N 7):
Met Ala Thr Thr Ser Thr Gly Asn Ser Ala Arg
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu
Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
Ala Ala His His Arg
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser
Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
Препроинсулин 3 соответствует формуле II, при этом
R¹ Phe (B1),
R² означает пептид с 11 остатками аминокислот,
Y - Thr (B30),
Z - Ala Ala His His Arg (B31-B35),
R³ Gly (A21) и
A2-A20 являются последовательностью аминокислот цепи А инсулина человека (остатки аминокислоты 2-20), а B2-B29 являются последовательностью аминокислот цепи В инсулина человека (остатки аминокислот 2-29).

Препроинсулин 3 затем вступает во взаимодействие с трипсином и с карбоксипептидазой В, как и в примере 11, с образованием инсулина 3. Инсулин 3 соответствует формуле I, при этом
R¹ означает Phe (B1),
Y означает Thr (B30),
Z - Ala Ala His His (B31-B34),
R³ Gly(A21) и
A2-A20 являются последовательностью аминокислот цепи А инсулина человека (остатки аминокислоты 2-20), а B2-B29 являются последовательностью аминокислот цепи В человеческого инсулина (остатки аминокислоты 2-29).

Инсулин 3 имеет следующую последовательность аминокислот:
Инсулин 3 (Seq Ind N 8):
Цепь В: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala Ala His His
Цепь A: Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
(Дисульфидные мостики, как представлено в формуле I).

ПРИМЕР 4
Инсулин 2, полученный по примеру 2, вступает во взаимодействие с карбоксипептидазой В согласно примеру 11 с получением инсулина 4.

Инсулин 4 соответствует формуле I, при этом
R¹ означает Phe (B1),
Y означает Thr (B30),
Z означает Ala His His (B31-B33),
R³ означает Gly (A21) и
A2-A20 являются последовательностью аминокислот цепи А инсулина человека (остатки аминокислот 2-20), а B2-B29 являются последовательностью аминокислот цепи В инсулина человека (остатки аминокислот 2-29).

Инсулин 4 имеет следующую последовательность аминокислот:
Инсулин 4 (Seq Ind N 9):
Цепь В: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala His His
Цепь A: Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
(Дисульфидные мостики, как представлено в формуле I).

ПРИМЕР 5
Цинк-связывание производных инсулина
Препарат инсулина (0,243 mM инсулина человека, 0,13 М NaCl, 0,1% фенола, 80 мкг/мл (1.22 мМ) цинка⁺⁺, 10 мМ Tris/HCl, pH 7,4) подвергают диализу при 15^oC против 10 mM Tris/HCl, pH 7,4, в общей сложности 40 часов (смена буфера происходит после 16 часов и 24 часов). После этого диализаты подкисляют, концентрации инсулина определяют с помощью HPLC и цинка путем спектрографии атомопоглощения. Значения цинка корректируют с помощью содержания цинка контрольной исходной смеси, не содержащей инсулина (см. табл. 1).

ПРИМЕР 6
Цинковая зависимость профиля действия инсулина человека в опытах на собаке
Введение: подкожное.

Доза: 0,3 IE (межд.ед.)/кг: pH композиции 4,0.

Количество собак (n) на опыт составляет 6.

Табл. 2 показывает глюкозу в крови в % от исходного значения.

ПРИМЕР 7
Профиль действия Gly (A21) Ala (B31), His (B32), His (B33), Arg (B34)-инсулина человека в опытах на собаке (инсулин 2)
Инсулин 2, изготовленный по примеру 2, используется в следующей формулировке приготовления:
Глицерин 20 мг/мл, м-крезол 2,7 мг/мл, инсулин 2 40 IE (международных единиц)/мл.

IE представляет международные единицы и соответствует приблизительно 6 ммоль инсулина, например, инсулина человека или инсулина формулы I. Значение pH устанавливается с помощью NaOH или HCl.

Введение: подкожно, доза: 0,3 IE/кг;
число протестированных собак составляет 6; pH препарата - 4,0.

Табл. 3 показывает глюкозу в крови в % от исходной величины.

ПРИМЕР 8
Профиль действия Gly(A21) Ala(B31) His(B32), His(B33), Arg(B34)-инсулина человека в опытах на собаке (инсулин 4)
Инсулин 4, изготовленный по примеру 4, формулируется и используется как в примере 7.

Введение: подкожно, доза: 0,3 IE/кг;
n = 6; pH препарата - 4,0.

Табл. 4 показывает глюкозу в крови в % от исходной величины.

ПРИМЕР 9
Профиль действия Gly(A21) His(B31), His(B32)-инсулина человека в опытах на собаке (инсулин 1)
Инсулин 1, полученный по примеру 1, формулируется и используется как в примере 7.

Введение: подкожно, доза: 0,3 IЕ/кг;
n = 6; pH композиции - 4,0.

Табл. 5 показывает глюкозу в крови в % от исходной величины.

ПРИМЕР 10
Профиль действия Gly(A21) Ala(B31) Ala(B32) His(B33), His(B34)-инсулина человека в опытах на собаке (инсулин 3)
Инсулин 3, изготовленный по примеру 1, формулируется и используется как в примере 7.

Введение: подкожно, доза: 0,3 IE/кг;
n = 6; pH композиции - 4,0.

Табл. 6 показывает глюкозу в крови в % от исходной величины.

ПРИМЕР 11
Получение инсулина 1 из препроинсулина 1
200 мг инсулина с Arg на Carboxy-конце цепи В, полученного по примеру 1, растворяют в 95 мл 10 мМ HCl. После добавления 5 мл 1 М трис/HCl (трис(гидроксиметил)аминометан) - pH 8, устанавливают значение pH с помощью HCl или NaOH на отметке 8.

Добавляют 0,1 мг карбоксипептидазы В. Спустя 90 мин полностью происходит отщепление аргинина. Значение pH исходной смеси за счет добавления HCl устанавливают на 3,5 и перекачивают на колонку Reserved Phase (PLRP-S RP 300 10 мкм 2,5х30 см, Polymer Laboratories Amherst, MA, USA). Мобильная фаза A - это вода с 0,1% трифторуксусной кислоты. Фаза В состоит из ацетонитрила с 0,09% трифторуксусной кислоты. Колонка работает с потоком, составляющим 5 мл/мин. После нанесения колонка промывается 150 мл фазы А. Фракционированное вымывание происходит путем прикладывания линейного градиента в размере от 22,5 до 40% В за 400 минут. Фракции анализируют по отдельности с помощью аналитической Reverved Phase HPCl, а те из них, которые содержат Des-Arg-инсулин достаточной чистоты, объединяют. Значение pH устанавливают с помощью NaOH равным 3,5, а ацетонитрил удаляют в ротационном испарителе. Затем Des-Arg-инсулин выводят в осадок путем установления значения pH, равного 6,5. Преципитат отцентрифугируют, два раза промывают каждый раз 50 мл воды, а затем сушат вымораживанием.

Выход составляет 60-80% инсулина 1.

В предлагаемом изобретении описываются производные инсулина с повышенной способностью связывать цинк общей формулы I, где Z означает остаток гистидина или пептид с 2-35 генетически кодируемыми остатками аминокислот, содержащими 1-5 гистидиновых остатка, пригодные для производства фармацевтических композиций при лечении диабета. Инсулины формулы I образуют с цинком комплексы, содержащие гексамер инсулина и приблизительно 5-9 молей цинка на гексамер. 4 с. и 12 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Инсулин формулы I,

и/или физиологически совместимые соли инсулинов формулы I,
где R¹ - остаток фенилаланина или атом водорода;
R³ - генетически кодируемый остаток аминокислоты;
Y - генетически кодируемый остаток аминокислоты;
Z означает а) остаток гистидина His или б) пептид с 2-35 генетически кодируемыми остатками аминокислот, содержащими 1-5 гистидиновых остатка;
остатки А2-А20 соответствуют аминокислотной последовательности А-цепи инсулина человека, животного инсулина или производного инсулина,
остатки В2-В29 соответствуют аминокислотной последовательности В-цепи инсулина человека, животного инсулина или производного инсулина. 2. Инсулин формулы I по п.1, где R¹ означает остаток фенилаланина, R³ означает остаток аминокислоты из группы Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu и Gln, Y означает остаток аминокислоты из группы Ala, Thr, Ser, His, Z означает а) остаток гистидина б) пептид с 4-7 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина. 3. Инсулин формулы I, по п.1, где R¹ означает остаток фенилаланина, R³ означает остаток аминокислоты из группы Asn, Gly, Ser, Thr, Ala, Asp, Glu и Gin, Y означает остаток аминокислоты из группы Ala, Thr, Ser, His, Z означает а) остаток гистидина или б) пептид с 2-7 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина. 4. Инсулин формулы I по п.3, где Z представляет собой пептид с 1-5 остатками аминокислоты, содержащими 1-2 остатка гистидина. 5. Инсулин формулы I по одному или нескольким пп.1-4, где R¹ означает остаток фенилаланина, R³ означает остаток аминокислоты из группы Asn и Gly, Y означает остаток аминокислоты из группы Thr и His, Z означает пептид с 1-5 остатками аминокислоты, содержащими 1 или 2 остатка гистидина. 6. Инсулин формулы I по п.1, где R¹ означает остаток фенилаланина, R³ представляет остаток глицина, Y означает остаток треонина, Z означает а) остаток гистидина His или б) пептид с 2-35 генетически кодируемыми остатками аминокислот, содержащими 1-5 гистидиновых остатка. 7. Инсулин формулы I по п.6, где Z означает пептид с последовательностью His His, His His Arg, Ala His His, Ala His His Arg, Ala Ala His His Arg или Ala Ala His His. 8. Комплексы, содержащие гексамер инсулина и 5-9 молей цинка на гексамер инсулина, в частности 5-7 молей цинка на гексамер инсулина, причем гексамер инсулина состоит из шести молекул инсулина формулы I по одному или нескольким пп.1-7. 9. Фармацевтическая композиция, обладающая антидиабетической активностью, отличающаяся тем, что содержит эффективное количество, по крайней мере, инсулина формулы I и/или, по меньшей мере, одну физиологически приемлемую соль инсулина формулы I, по одному или нескольким пп.1-8, в растворенной, аморфной и/или кристаллической форме. 10. Фармацевтическая композиция по п. 9, отличающаяся дополнительным содержанием от 1 мкг до 2 мг, предпочтительно от 5 мкг до 200 мкг цинка/мл. 11. Фармацевтическая композиция по п.9 или 10, отличающаяся значением рН от 2,5 до 8,5. 12. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким пп.9-11, отличающаяся значением рН от 2,5 до 4,5. 13. Фармацевтическая композиция по одному или нескольким пп. 9-12, отличающаяся дополнительным содержанием немодифицированного инсулина, предпочтительно немодифицированного инсулина человека или модифицированного инсулина, предпочтительно Gly(A21)-Arg(B31)-Arg(B32)-инсулина человека. 14. Проинсулин формулы II
R²R¹B2^-B29-Y-Z-Gly-A2-A20-R³, (II)
где R³ и Y имеют значения, указанные в формуле I согласно одному или нескольким пп.1-7,
R¹ - остаток фенилаланина или ковалентную связь;
R² - а) генетически кодируемый остаток аминокислоты или б) пептид с 2-45 остатками аминокислот;
остатки А2-А20 и В2-В29 соответствуют последовательностям аминокислоты цепей А и В инсулина человека, животного инсулина или производного инсулина;
Z означает пептид с 2-40 генетически кодируемыми остатками аминокислот с 1-5 остатками гистидина. 15. Проинсулин формулы II по п. 14, где R² представляет собой пептид с 2-25 остатками аминокислоты. 16. Проинсулин формулы II по п. 14 или 15, где R² означает пептид с 2-15 остатками аминокислоты, в которой на конце карбоксила находится остаток аминокислот из группы Met, Lys и Arg.