Антиген для диагностики сапа Советский патент 1993 года по МПК A61K39/02 G01N33/531 

Антиген предназначен для применения в пластинчатой реакции агглютинации для выявления противосапных агглютининов в сыворотке крови животных и таким образом иммунодиагностики сапа.

Штамм Pseudomonas mallei №5584 применяется для изготовления противосапных диагностикумов (Инструкция по изготовлению и контролю антигена сапного для реакции связывания комплемента, утв. ГУВ МСХ СССР 17.08.84).

Пример 1. Для изготовления антигена культуру возбудителя сапа штамма Pseudomonas mallei № 5584 выращивают на синтетической питательной среде Сотона, инактивируют прогреванием при температуре 90-100°С в течение 1 ч. Бактерийную массу отделяют центрифугированием, осадок промывают дистиллированной водой, центрифугируют и суспендируют в физиологическом растворе с 0,5% фенола.

Определяют концентрацию клеток во взеси в международных единицах мутности (MEM) по стеклянному единому стандарту мутности для бактерийных взвесей, подсчитывают количество клеток в 1 мл из расчета, что 10 MEM составляют 1,65 млрд/мл.

Для окрашивания, клеток используют раствор органического красителя на дистиллированной воде. Количество красителя, необходимое для окрашивания полученной массы клеток, определяют титрованием. Взвесь клеток возбудителя Pseudomonas mallei с установленным количеством красителя выдерживают при температуре 20-25°С, затем отделяют жидкость центрифугированием, осадок ресуспендируют в буферном растворе следующих образцов:

рН 3,0-4,0 (120,0-350,0 г молочной кислоты, 18,0-22,0 г гидроокиси натрия, 4,5-5,5 г фенола, 8,0-9,0 хлорида натрия, дистиллированной воды до 1л).

Образцы испытаны в РА с позитивной сапной сывороткой из расчета содержания в 1 мл 50-170 млрд микробных клеток.

Получают следующие серии антигена:

Продолжение таблицы

0

0

5

0

Пример 2. Для диагностики сапа одну :саплю сыворотки крови животного смешивают с одной каплей антигена на белой эма- лированной пластинке с лунками и учитывают реакцию в течение 4 мин. При наличии противосапных агглютининов в те- 5 чение 0,5-4 мин в лунке происходит образование окрашенных хлопьев агглютинина различной окраски в зависимости от используемого красителя, жидкость просветляется. Окрашенные образцы антигенов испытывают в пластинчатой РА с позитивной сапной сывороткой. Во всех случаях наблюдался крупный агглютинат, соответствующего цвета с полным просветлением жидкости в лунке. При испытании образцов с негативной сывороткой реакции не наблюдалось.

Пример 3. Проводят проверку видовой специфичности антигена I, II и III серий испытанием его с сывороткой крови 420 лошадей благополучных по сапу хозяйств разных районов страны, а также с гипериммунными поливалентными сыворотками разных серогрупп и вариантов: О- и Н-саль- монеллезными, лептоспирозными, 0-коли 5 сыворотками, сибиреязвенной, листери- озной, противорожистой, псевдомоноз- ной, бруцеллезной,туберкулезной,овисной и др.

Во всех случаях при наблюдении за реакцией в течение 4 мин получены отрицательные результаты, указывающие на высокую степень видовой специфичности антигена, Слабые признаки агглютинации проявляются при выдерживании смеси антигена с некоторыми сыворотками более 4 мин.

Положительный результат получен при испытании антигена с мелиоидозной сывороткой в течение 0,5-4 мин, что объясняется очень близкой антигенной структурой возбудителя сапа и мелиоидоза.

Пример 4. Чувствительность реакции агглютинации с цветным сапным антигеном определяют при исследовании 2535 проб сыворотки крови лошадей в стране, неблагополучной по сапу. Животных одновременно обследуют на сап двукратной внутрикожной маллеиновой пробой и клиническим осмотром, кровь исследуют в РСК с сапным антигеном для РСК.

0

5

0

5

Результаты исследования представлены в таблице.

Из полученных данных следует, что РА с заработанным антигеном в сравнении с PC К выявляет вдвое большее количество ло иэдей, зараженных возбудителем сапа (ее ответственно, 4.6 и 2,2% к числу обследо- шых), а также определенное количество животных, которые по результатам приме- няощихся методов исследования считают- ся здоровыми.

Пример 5. Проводят проверку актив- ноЬти антигена испытанием его с гиперим- м иными сапными сыворотками при температуре 4-6 и 20-25°С. В течение 0,5-

пин появились практически равноценные положительные реакции при обеих темпера гурах во всех разведениях сывороток, что

го ти сорых температурах.

Использование пластинчатой реакции

орит о возможности использования ан- ена для постановки РА при любых плю-

аг в

лютинации с цветным сапным антигеном етеринарной практике позволяет првыСУТЬ эффективность экспресс-диагностики бслезни, расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, пригодных к использованию в лабораторных и полевых условиях.

Формула изобретения

Антиген для диагностики сапа, содержащий клетки возбудителя Pseudomonas mallei в разбавителе, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и специфичности, из клеток возбудителя он содержит окрашенные клетки штамма Pseudomonas mallei № 5584, а в качестве разбавителя - буферный раствор, включающий молочную кислоту, гидроокись натрия, хлорид натрия и фенол в дистиллированной воде, с рН 3,0-4,0 при следующем соотношении компонентов:

Окрашенные клетки штамма .

Pseudomonas mallei

tvfe 5584

Молочная кислота Гидроокись натрия Хлорид натрия Фенол

(50-170)х хЮ9 кл/мл 120-350 г 18-22 г 8,0-9,0 г 4,5т5,5 г

Дистиллированная вода До 1 л.

Использование: ветеринарная иммунология, антиген, обнаружение агглютининов в сыворотке крови садзараженных животных. Сущность изобретения: антиген для диагностики сапа представляет собой гомогенную взвесь в буферном растворе инактивиро- ванной автоклавированием культуры штамма Pseudomonus mallei № 5584, выращенной на синтетической питательной среде и окрашенной органическим красителем. Антиген предназначается для экспресс-метода исследования сыво отки крови лошадей на сап в пластинчатой реакции агглютинации. Комиссионные проверки пластинчатой РА с цветным сапным антигеном при исследовании здоровых и больных сапом лошадей показали ее эффективность и пригодность для практического применения в лабораторных и полевых условиях, возможность выявления лошадей в ранней стадии заражения, до появления состояния повышенной чувствительности к маллеину, и при хроническом течении болезни. 1 табл. качестве разбавителя - Ьуферный раствор, включающий молочную кислоту, гидроокись натрия, хлорид натрия, фенол в дистиллированной воде с рН 3,0-4,0 при следующем соотношении компонентов: Окрашенные клетки штамма Pseudomonas mallei № 5584 Молочная кислота Гидроокись натрия Хлорид натрия Фенол