ШТАММ BRUCELLA ABORTUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 1999 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и представляет собой новый штамм бактерий Brucella abortus, используемый для изготовления диагностических и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза животных.

Бруцеллез животных широко распространен во многих странах мира, наносит большой экономический ущерб животноводству и представляет значительную опасность здоровью людей. Заболевание животных и людей вызывают бруцеллы в S-форме, имеющие поверхностные A- и M-антигены, стимулирующие в организме больного животного синтез антител, улавливаемых единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК (карпускулярный антиген из бруцелл в гладкой S-форме), предназначенным для диагностики бруцеллеза, и бруцеллы в R-форме (ovis, canis, диссоциированные формы abortus, melitensis, suis), не имеющие поверхностных A- и M-антигенов и не вызывающие образование соответствующих антител в крови больных животных. Для диагностики и профилактики бруцеллеза, вызываемого R-формами бруцелл, готовят соответствующие препараты из шероховатых культур штаммов бруцелл.

Известны штаммы Brucella abortus N 16/4 и Brucella melitensis N K-24(1), рекомендованные для изготовления диагностических и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза. Недостатком известных штаммов является их недостаточная стабильность, наличие остаточных количеств поверхностных S антигенов и отсутствие маркеров, позволяющих дифференцировать их от полевых (вирулентных) штаммов бруцелл в R-форме.

Целью изобретения является получение штамма бруцелл, используемого при изготовлении биопрепаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза животных, вызываемого R-формами бруцелл, способного стабильно репродуцироваться на питательных средах без синтеза поверхностных A- и M-антигенов, авирулентного для животных и человека.

Штамм бактерий Brucella abortus получен в результате целенаправленной селекции по культуральным, морфологическим, биохимическим, агглютинабельным и антигенным свойствам из вакцинного штамма Brucella abortus N 104M.

Штамм бактерий Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно- исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) и имеет регистрационный номер KB 17/100 ДЕП.

Штамм Brucella abortus ВГНКИ N KB 17/100 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Бруцеллы штамма - короткие грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные изолированно, попарно реже в виде коротких цепочек, без спор и капсулы. Размер 1,3-1,5 мкм, шириной 0,6-0,8 мкм.

Культуральные свойства.

Культура штамма хорошо растет в аэробных условиях на плотных и жидких питательных средах: мясопептонном печеночном глюкозоглицериновом агаре (МППГГА), МППГГА с добавлением перевара Хоттингера, мясопептонном печеночном глюкозоглицериновом бульоне (МППГГБ), и других средах, предназначенных для культивирования бруцелл.

На МППГГА, МППГГА с переваром Хоттингера и других плотных питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл (4-5 сутки инкубирования при 37-38^oC) растет в виде круглых, плоских, шероховатых, с нечетко контурированным краем, матовых колоний с диаметром 2,5-3,0 мм. При окрашивании раствором кристаллического фиолетового 1/2000 (по Уайт-Вилсону) 100% колоний окрашивается как R-форма: фиолетовый центр и светло-фиолетовый широкий ободок.

На МППГГБ и других жидких питательных средах, предназначенных для культивирования бруцелл, на 4-5 сутки инкубирования при 37-38^oC рост бактерий характеризуется легкой опалесценцией среды и тонким пристеночным кольцом голубоватого цвета.

Биохимические свойства.

Культура штамма растет на дифференциальных питательных средах (на основе МППГГА и других плотных питательных сред), содержащих фукцин, тионин в концентрации 1: 50 000, бис-трифенилангидрокарбинола оксалат в концентрации 1: 100 000 (маркер), пенициллин 5 ЕД/см³, эритритол 1 мг/см³ и не растет на средах, содержащих 5 мкг/см³ стрептомицина сульфат.

Продуцирует H₂S (6-8 мм).

Лизируется фагом Тб.

Агглютинабельные свойства.

Культура штамма агглютинируется R-антибруцеллезной сывороткой и не агглютинируется S-антибруцеллезной сывороткой. Штамм не обладает типоспецифической агглютинабельностью и не агглютинируется A и M монорецепторными сыворотками. При введении морским свинкам в дозе 2•10⁹ микробных клеток и телкам в дозе 100•10⁹ титр R-антител в сыворотке крови животных в реакции агглютинации 1: 100-1:200. Реакция агглютинации с единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК (S-бруцеллезный антиген) отрицательная.

Антигенные свойства.

При введении морским свинкам в дозе 2•10⁹ микробных клеток и кроликам в дозе 7•10⁹ микробных клеток у животных вырабатываются только R-антитела в титрах в РА от 1:160 до 1:3200.

Сыворотка крови животных не дает положительной реакции с S-бруцеллезными антигенами.

Безвредность.

Штамм KB 17/100 безвреден. При введении мышам 250 млн. микробных клеток и морским свинкам 2 млрд. микробных клеток не вызывает патолого-анатомических изменений, характерных для бруцеллеза. Бруцеллы штамма не мигрируют от вакцинированных животных к интактным, не проникают через плацентарный барьер и не вызывают аборты.

Вирулентность.

Остаточная вирулентность штамма KB 17/100 ниже чем у исходного вакцинного штамма B.abortus 104M. ИД₅₀ для мышей линии C₅₇Блек/6 составляет 5500 микробных клеток.

Иммуногенные свойства.

Культура штамма, введенная морским свинкам под кожу в дозе 3•10⁹ микробных клеток, защищает от эспериментального заражения вирулентным штаммом бруцелл в дозе 10-15 ИД₅₀ 50% иммунизированных морских свинок.

Стабильность основных свойств штамма при пассировании.

Штамм стабилен в антигенном отношении на протяжении 10 пассажей на плотных и жидких питательных средах и 5 пассажей на морских свинках (срок наблюдения).

Штамм B.abortus ВГНКИ KB 17/100 используют при изготовлении биопрепаратов для диагностики и профилактики бруцеллеза животных.

Пример 1. Из агаровых культур штаммов B.abortus N KB 17/100, B.abortus N 16/4 и B. melitensis N К-24 готовят антигены для реакции агглютинации по принятой методике. Полученные антигены испытывают в РА на стекле с R- и S-антибруцеллезными сыворотками, разведенными карболизированным (0,5%) физиологическим раствором хлорида натрия 1:10, 1:20 и 1:50.

Результаты исследований приведены в табл. 1.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности и активности антигена из штамма B.abortus N KB 17/100 и достоверно иллюстрируют его преимущества перед антигенами из известных штаммов.

Пример 2. Антигены из штаммов B.abortus N KB 17/100, B.abortus N 16/4, B. melitensis N K-24, полученные из агаровых культур по принятой методике, испытывают в реакции иммунофлуоресценции с R-антибруцеллезной сывороткой (антибруцелла овис, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи), разведенной 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64.

Результаты испытаний приведены в табл. 2.

Полученные результаты показывают, что антиген для РИФ из штамма B.abortus N KB 17/100 высокоактивен в отличие от антигенов, изготовленных из штаммов B.abortus N 16/4 и B/melitensis N K-24.

Пример 3. Испытывают агглютиногенные свойства антигена из предлагаемого штамма B. abortus N KB 17/100 в сравнении с антигеном из штамма B.abortus N 16/4. Культуры штаммов выращивают на плотной питательной среде, смывают физиологическим раствором хлорида натрия, инактивируют прогреванием и вводят полученные антигены морским свинкам в дозе 3•10⁹ микробных клеток под кожу в область паха. Спустя 20 дней после иммунизации у животных берут кровь и исследуют сыворотки в РА с R-антигеном и единым бруцеллезным антигеном для РА, РСК и РДСК (S-антиген). Средний титр R-антител в крови морских свинок, иммунизированных культурой штамма B. abortus N KB 17/100 составил 1:160. Реакция агглютинации с единым бруцеллезным антигеном у всех животных отрицательная.

В группе морских свинок, иммунизированных антигеном из штамма B.abortus N 16/4, титр R-антител был 1:80. Количество S-антител равнялось 48,6 ME.

Пример 4. Получают по принятой методике гипериммунные кроличьи сыворотки на штаммы B.abortus KB N 17/100, B.abortus N 16/4, B.melitensis N K-24 (R-форма), B. abortus N 544 (референтный штамм, S-форма), B.canis N RM 6/66 (референтный вирулентный штамм, R-форма). Антисыворотки каждого штамма проверяют в иммуноблоттинге на наличие антител к A и M антигенам.

Гипериммунная сыворотка на штамм B.abortus N KB 17/100 и B.canis N RM 6/66 не содержит антител к A и M бруцеллезным антигенам, характерным для S-форм бруцелл, сыворотки на остальные штаммы содержат то или иное количество указанных антигенов.

Пример 5. Морских свинок массой 350-400 иммунизируют живыми вакцинами из штаммов B. abortus N KB 17/100 и B.abortus N 16/4, полученными по общепринятой методике. Препараты вводят в дозе 2•10⁹ в объеме 1 см³ под кожу в область паха. Каждой вакциной иммунизируют 20 морских свинок. Через 30 дней у животных берут кровь и исследуют сыворотки в РА с единым бруцеллезным антигеном. Морские свинки, привитые вакциной из штамма B.abortus N KB 17/100, не реагируют на бруцеллез, а из штамма B.abortus N 16/4 - дают положительную реакцию. Спустя 60 дней после вакцинации животных заражают культурой вирулентного штамма B.abortus N 54M/ВГНКИ 75 микробных клеток (15 ИД₅₀). Культуру вирулентного штамма вводят в область паха, противоположную месту введения вакцины, под кожу, в объеме 1 см³. Через 32-35 дней животных убивают и проводят бактериологическое исследование лимфатических узлов и внутренних органов (по принятой методике 10 объектов). Критерием заражения иммунизированных морских свинок считают наличие бруцелл вирулентного штамма в организме животных. В группе животных, иммунизированных вакциной из штамма B.abortus N 16/4, заразилось 16 морских свинок, а вакциной из штамма B.abortus N KB 17/100 - 10.

Таким образом, вакцина из штамма Brucella abortus ВГНКИ N KB 17/100 защищает от заражения высоковирулентной культурой бруцелл 50% иммунизированных животных, в то время как аналогичный препарат из штамма B.abortus N 16/4 только 20%.

Использование культуры штамма бактерий Brucella abortus ВГНКИ N KB 17/100 в биологической промышленности позволит получить высокоэффективные биопрепараты для диагностики и профилактики бруцеллеза животных.

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии. Штамм Brucella abortus N КВ 17/100 не имеет поверхностных A- и M-антигенов, характерных для бруцелл в S-форме. Обладает низкой остаточной вирулентностью, стабильностью свойств при культивировании на питательных средах и тем самым повышает специфичность и активность диагностических и профилактических препаратов против бруцеллеза животных. Штамм Brucella abortus депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветеринарных препаратов с регистрационным N КВ 17/100-ДЕП. Полученный из штамма B. abortus ВГНКИ N КВ 17/100 диагностический антиген является высокоспецифичным и высокоактивным биопрепаратом, а изготовленная вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью. 2 табл.

Штамм бактерий Brucella abortus ВГНКИ N КВ 17/100-ДЕП, используемый для изготовления диагностических и профилактических биопрепаратов против бруцеллеза животных.