нако с пониженной жизнеспособностью клеток. Все исследования, приведенные выше по бактериям в гомогенной фазе, проводились в ограниченном числе наиболее распространенных органических растворителей; сырая нефть и другие существующие в природе масла не упоминались до сих пор.
Целью изобретения является улучшение способа, приведенного выше, и получение стабильных, однофазных растворов микроэмульсий вода в масле, содержащих микроорганизмы и/или части микроорганизмов.
Основная характеристика изобретения состоит в найденных условиях, в которых бактерии, дрожжевые клетки и другие микроорганизмы могут быть солюбилизирова- ны в сырой нефти, причем таким образом, чтобы они не погибали долгое время независимо от выбранной системы. Микроорганизмы вводят в водный раствор несколькими способами (микрораспылением, техникой внутреннего распыления), и вода полностью солюбилизируется сырой нефтью.
Ситуация в случае солюбилизации протеинов может быть графически представлена, как показано на фиг.2.
Интересно отметить, что клетки остаются в растворе, хотя можно было бы предложить, что они из-за своих размеров должны быть склонны к седиментации из раствора уже через небольшой промежуток времени из-за сил гравитации, а также к агрегации. Не привлекая никакую специальную теорию, предложили, что стабилизация микроорганизмов в растворе является следствием образования микроэмульсии: микроорганизмы, в особенности бактерии, присутствующие в водных каплях, являются компонентом микроэмульсионной системы вода в масле и, естественно, в качестве вещества другой природы остаются слипшимися в стабильные агрегаты, которые геометрически закрыты молекулами капиллярно-активного агента. Вероятно, бактерия защищена несколькими водными слоями и слоем молекул капиллярно-активного агента, что и делает возможной ее растворимость в органической среде.
Фиг.З предлагает графическое представление, которое однако дано чисто схематически, поскольку точные экспериментальные данные о структуре мицелляр- ных агрегатов бактерии не получены. Значимая разница в плотности между микроорганизмами и растворителями и удачное значение инкремента коэффициента преломления fn/dc ответственны за оптическую чистоту и уменьшение дисперсии света. Указанное выше - факторы, ответственные за образование чистых растворов микрорганизмов (бактерий и эукариотиче- 5 ских клеток), которые должны быть тщательно изучены.
Растворы, полученные в соответствии с данным изобретением, - устойчивые, прозрачные и гомогенные однофазные систе0 мы.
Необходимо отметить, что в растворах, приготовленных в соответствии с изобретением, в отличие от системы 6 не образуется двухфазных систем. В соответствии с 6
5 бактерии не растворяются в мицеллярной фазе, но присутствуют в водной фазе (см. фиг.З.а). Графическое изображение разницы между двумя системами представлено на фиг.З.
0 Необходимо добавить, что в условиях 6 бактерии не могут передаваться в суперна- тантную фазу, значит, в системе а) невозможно создать такую ситуацию, которая реализуется в системе б). По этим причинам
5 два способа существенно и радикально отличны один от другого.
В соответствии с данным изобретением различные типы бактерий солюбилизируют в продуктах сырой нефти посредством раз0 личных капиллярно-активных агентов и/или воды солюбилизациии не происходит. Получают суспензии клеток, которые сравнительно быстро распадаются.
Было установлено, что в случае опреде5 ленных типов сырой нефти, которые, как правило, существуют в форме черной суспензии и обычно содержат много веществ, капиллярно-активные агенты вообще не нужно вводить. Другими словами, можно
0 прямо вводить в нефть без всякой предварительной обработки водные растворы, содержащие микроорганизмы.
В основном это явление должно быть отнесено к факту, что сырая нефть уже со5 держит молекулы, которые похожи на молекулы капиллярно-активных агентов.
Это очень важно с точки зрения биотехнологии, так как процесс микробиологиче0 ского разложения сырой нефти должен стать много дешевле и проще.
Вода должна добавляться также а каждом случае. .Для того чтобы получить единственную фазу, необходимо, чтобы до5 бавленный обьем водного раствора не нарушил границы термодинамической устойчивости микроэмульсионной системы, в противном случае, как установлено, при добавлении слишком большого количества воды получают двухфазную систему.
Было установлено, что многие микроорганизмы, содержащиеся в растворах, приго- товленных в соответствии с данным изобретением, оказались в состоянии выполнять микробиологические реакции даже в среде, неблагоприятной для жизни, которой является сырая нефть.
Следовательно, основные принципы предусмотрены для проведения микробиологического процесса в сырой нефти и продуктах ее очистки.
На первой стадии программы проводились эксперименты, целью которых являлось определение возможности прямой солюбилизации бактериальных клеток в минеральном масле или в лигроине и установление стабильности таких однофазных систем, т.е. установление того, что они не приносят фазового расслоения, даже при отсутствии перемешивания. На второй стадии изучали жизнеспособность микроорганизмов в таких системах. Обе стадии программы описаны ниже.
Первая стадия. Приготовление однофазной системы.
Обычно 500 мг твина 86 или 250 мг азо- лек-тина растворяли в 5 мл сырой нефти при комнатной температуре и сильном перемешивании 10% или 5% веса на объем соответственно в водную суспензию клеток добавляли соответствующую среду, подходящую для данного микроорганизма, до концентрации (обычно) 10 клеток/л.; С помощью микроспрея небольшой объем этого раствора (около 2об.% органического капиллярно-активного агента) добавляли и сильно встряхивали около 1600 об/ин. После нескольких минут встряхивание прекращали. Для более крупных клеток короткая ультразвуковая обработка может сократить период встряхивания. Солюбилизация клеток в сырой нефти без добавления капиллярно-активного агента протекает приведенным способом. Изменяя концентрацию воды, можно определить пределы существования гомогенной фазы/Установлено, что в моторном масле (Теллус 33, Шелл) можно растворить до 1 об.% воды; в случае сырой нефти можно добавить двойной объем воды, но непрозрачность продукта вряд ли позволит выявить явную взаимосвязь.
Таким образом мицеллярные растворы моторного масла и минерального масла содержат приблизительно от 106 дор 107 клеток/мл (рассчитанных относительно общего объема). Возможно выйти за эти пределы, одновременно сохраняя однофазную систему, если использовать большую концентрацию капиллярно-активного агента, например в случае азолектина можно солюбилизировать вдвое больше воды, удвоив концентрацию капиллярно-активного агента и следовательно добавить больше клеток соответственно.
В этой связи необходимо обратить внимание на тот факт, что при превышении некоторой концентрации клеток раствор становится насыщенным, т.е. избыточные клетки будут осаждаться. Очевидно можно
0 работать микробиологически и в этих условиях, но это будет уже не раствор, а суспензия, Такую систему можно применять с точки зрения технологии, но необходимо сильное встряхивание для того, чтобы все
5 клетки находились в контакте с растворителем, следовательно здесь снова имеем двухфазную систему.
В процессе, описанном выше, применялись следующие микроорганизмы: дрожжи
0 Бейкера,
Pseudomonas sp.sulfolobulus, Thlob- acter sulfoxidans, Bas. sublitis, Arthrobacter cpp. HAL.
Подробности приведены в примерах.
5 Все эти растворы оставались стабильными, т.е. не было признаков расслоения фаз, тем более существенного осаждения клеток на протяжении нескольких недель. Вторая стадия, Определение жизнеспо0 собности микроорганизмов в продуктах сырой нефти.
Цель этой работы состоит в определении жизнеспособности микроорганизов в системах, полученных указанным путем. Для
5 этого активность микроорганизмов проверяется на агаровых пластинах: концентрация жизнеспособных клеток определяется путем смешивания с микроэмульсией сырой нефти, предварительно разбавленной 0,9%0 ным водным раствором хлористого натрия, измеряется количество клеток (около 100 на каждую чашку Петри), 100% жизнеспособности соответствует концентрация клеток в начале ().
5 Типичные результаты приведены на фиг.4. Можно видеть, что различные бактерии и клетки отличаются друг от друга по стабильности, но жизнеспособность во многих случаях у них очень хорошая.
0 Таким образом, предметом изобрете. ния являются однофазные, стабильные водно-нефтяные микроэмульсии, которые
содержат микроорганизмы или их части и
состоят из воды, нефти, капиллярно-актив5 ного вещества и, возможно, капиллярно-активного вещества. В частности:
водная фаза представляет собой концентрированные водные микроорганизмы или их части;
нефтяная фаза представляет собой сырую нефть или по крайней мере выделенное производное таких нефтей;
капиллярно-активное вещество является анионным, или ионным, или нейтральным веществом, или амфотерным капиллярно- активным веществом.
Однофазные, стабильные микрозмуль- сии применительно к буровой технике готовят добавлением к сырой нефти или к выделенному продукту таковой 0,1-30 мас.% капиллярно-активного вещества, концентрированного водного раствора микроорганизмов или частей таковых, взятых в таком количестве, чтобы не нарушались пределы термодинамической устойчивости микроэмульсии.
На практике эти пределы находятся в области от 0,001 до 100 об.ч, на каждые 100 об.ч. нефти.
Концентрированная водная среда из микроорганизмов содержит минеральные и питательные вещества, необходимые для поддержания жизни указанных микроорганизмов.
Следовательно, предложен процесс, который делает возможным растворение микроорганизмов, преимущественно бактерий, в водной фазе в минеральном масле с получением жидкой фазы, в которой микроорганизмы не осаждаются в течение длительного времени, В основном используют капиллярно-активные агенты (например твин или липиды), которые солюбилизиру- ются в сырой нефти или в продуктах, полученных в результате ее очистки, причем в случае сырой нефти можно работать без всяких добавок капиллярно-активных агентов. В противоположность другим процессам, описанным в литературе, описанный процесс характеризуется тем, что микроорганизмы присутствуют в сырой нефти в виде микроэмульсий, которые обеспечивают эффективный контакт с растворителем. Поскольку существует только одна жидкая фаза, не требуется перемешивания, чтобы обеспечить реакцию микроорганизмов с веществами, которые присутствуют в сырой нефти.
Изобретение делает возможным микробиологическую обработку сырой нефти в стационарных условиях.
Солюбилизируют в сырой нефти среди прочих тел микроорганизмы, которые способны разрушать продукты, содержащие серу. Предлагаемый процесс химического разрушения и соответствующие реакции являются предметом дальнейших исследований. Также показано, что жизнеспособность микроорганизмов может не снижаться неделями и за это время не наблюдается существенного саждения клеток.
П р и мер,и 1. 100 мг дрожжей суспен- дируют в 1 мл питательной среды (ИПД, 5 состоящей из 1% экстракта дрожжей, 2% бактеропептона, 2% глюкозы в воде). 100 мкл суспензии распыляют в 5 мл сырой нефти и перемешивают при 1600 об/мин около получаса до получения гомогенной фазы.
0 Пример2. Дрожжи приготовляют, как описано выше, и такой же объем переносят в 5 л раствора сырой нефти с 10% твина 85, перемешивают до гомогенности аналогично примеру 1.
5 Пример 3. Такая же процедура, как в примере 1, дрожжи в растворе 250 мг азо- лектина в 5 мл сырой нефти.
П р и м е р 4.Такая жй процедура, как в примере 1, дрожжи в растворе 250 мл азо0 лектина в 5 мл моторного масла Теллус 33 (Шелл).- - ::
П р и м е р 5. Такая же процедура, как в примере 1, дрожжи & растворе 250 мг твина 85 в 2,5 мл изопролилпальмитата, смешан5 ного с 2,5 мл моторного масла Теллус 33 (Шелл).
П р и м е р 6. Из раствора 30 мг/мл Pseudomonas sp. в питательной среде, добавляют 100 мкл к раствору азолектин/сы0 рая нефть (процедура, как в примере 3), См. фиг.4..
Пример. Такой же объем раствора спор Bacillus subtilis солюбилизируют, как в примере 6 или 1. в азолектине/сырой неф5 ти.
Примеры 8-10. Как описано в примере 6, Arthrobacter срр,, выращенные в течение двух дней в бутаноле Sulfolobus Acidocalbarius. Thlobacillus sulfoxlbans, мо0 гут быть введены подобным же путем, см. фиг.4....
(56) Malik I.A. Process Biochemistry, Sept., 1978. s. 10...
5Kargi F.. Euz.Microbiol. Techn,, 1982, N; 4, s.13,
Kargi F. and Robinson I.M. Blotech. Bioengen. 1984, Nfc 26, S.687V
Kargi F. and Robinson I.Mi Appl.Environ. 0 Microb. 1982, №44, s.878.
Van Afferden M. et all Bioprocesslrig of coal, K.S. Vorres edlto, 196 th. ACS National Meeting, Am. Chejn.Soc.Div.Fuel Chemistry, vol. 1988, v.33,p.561.
5 Kwang - II Lee and Teh Fu Yen. Prepr.Pap.-Am.Chem, Soc., . Di.Fuel Chemistry, Vol. 1988, v.33. p.572.
Hoffmann M.K.. Faust B.C., Panda F.A., Honf H.Koo and Tsuchiya. Appl. Envivin Microbiol, 1982. v.42, p.259.
Andrews G.W., Maczuga I. Bacterial Coat Desutfurization. 4-th Symposium Blotechn. Energy Prod, and Conversion, Qaltinburg, Tenn, 1982.
Lulsl P.L., Laane C.. Trends In Biotechn 1986,, p. 153.
Lulsl P.Z., Magld L. Critical Rev. Blochem. 1986. v.20, p.409.
Harlng G. and ath., Bioph. Res.Comm. 1985. .127. p.911.
Harlng G. and ath. Ann of the New. Jork. Acad. of Sci. 1987, 506. p.337.
Darrson A. ond ath. Blochem. Bioph. Res. Comm. 1988. 151, p. 1074.
Формула изобретения
5
0
5
0
5
0
5
0
5
об.ч. сырой нефти и/или продукта ее переработки,
Но О
m
а.(двефази) Обратимые мицелл trx
Ч
Бактерии
Неполярный растворитель
Фиг. /
Фе/.2
О (одна фаза)
OL (масло);
01 (масло
Фиг.З
Жизнеспособность
100
О
4 Время, дш .
