НАБОР ШТАММОВ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ОБУЧЕНИЯ ВОПРОСАМ МИКРОБИОЛОГИИ И МЕТОДАМ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУЛЯРЕМИИ Российский патент 2024 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для подготовки специалистов в области обучения специалистов лабораторной диагностике особо опасных инфекций, в частности сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза и повышения уровня биологической безопасности при проведении практических занятий за счет минимизации риска лабораторного инфицирования обучающихся.

Сибирская язва, туляремия, бруцеллез - особо опасные зоонозные инфекционные болезни - остаются серьезной проблемой общественного здравоохранения и сельского хозяйства. В XXI веке ежегодно отмечаются эпизоотические и эпидемические вспышки данных инфекций как на территории Российской Федерации, так и всего мира [1-4].

Бруцеллез на современном этапе рассматривается Всемирной организацией здравоохранения как один из наиболее опасных и распространенных зоонозов в мире. Ежегодно более чем в 170 странах официально регистрируют свыше 500 тыс. случаев заболевания людей [2]. В современных условиях при глобальном распространении бруцеллеза среди животных не исключается возможность заболевания людей ни для одной из стран ввиду риска наличия источника инфекции на данной или граничащей с ней территории [5-7].

Заболеваемость сибирской язвой людей и животных в России на данный момент ограничена выявлением спорадических случаев заражения в отдельных регионах, что обусловлено строгим соблюдением мер профилактики, проведением комплексного эпидемиологического надзора. Однако не исключен завоз сырья и продукции животноводства из стран с неблагополучной эпизоотической ситуацией по сибирской язве, что может создать риск осложнения эпидемиологической обстановки в Российской Федерации [3]. В Российской Федерации сибирская язва и бруцеллез включены в Перечень инфекционных болезней, требующих проведения мероприятий по санитарной охране территории страны [8], а сибирская язва также отнесена к заболеваниям, представляющим опасность для окружающих [9].

Массовая иммунизация населения в середине XX в. позволила снизить заболеваемость туляремией до спорадических случаев [1, 2]. Вместе с тем природные очаги болезни характеризуются цикличной активизацией и, как следствие, формированием эпидемических рисков возникновения заболеваний среди восприимчивого населения [4].

Регламентированным мероприятием по предупреждению и предотвращению сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза у человека является санитарно-эпидемиологический надзор - постоянное наблюдение за эпидемическим процессом, мониторинг заболеваемости людей, животных и циркуляции возбудителей, контроль эффективности профилактических мер. Данные мероприятия базируются, в том числе, на лабораторной диагностике, которую проводят специалисты учреждений Роспотребнадзора, медицинских и ветеринарных организаций, прошедшие специальное обучение на базе противочумных учреждений Роспотребнадзора [8]. Актуальность подготовки специалистов обусловлена также и тем, что возбудители сибирской язвы и туляремии отнесены к категории А вероятных агентов биотерроризма, а возбудители бруцеллеза - к категории В [10].

Одними из основных разделов программ, реализуемых противочумными учреждениями в рамках дополнительного профессионального образования специалистов, работающих с возбудителями особо опасных инфекций (ООИ), являются учебные модули «Микробиология и лабораторная диагностика сибирской язвы», «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» и «Микробиология и лабораторная диагностика бруцеллеза», включающие теоретические и практические занятия [11-15].

Основу лабораторной диагностики данных инфекций составляют регламентированные схемы микробиологического анализа, предусматривающие выделение возбудителей в чистой культуре и последующую идентификацию по морфологическим, культуральным, биохимическим и другим свойствам [16-22].

Проведение практических занятий при подготовке специалистов связано с использованием штаммов возбудителей сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза для решения следующих задач:

- изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств возбудителей, а также отличий биологических особенностей подвидов туляремийного микроба, видов бруцелл;

- освоение бактериологического, иммунологических и молекулярно-генетических методов лабораторной диагностики сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза, применяемых для индикации и идентификации;

- освоение биологического метода лабораторной диагностики сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза;

- дифференциация Bacillus anthracis от других патогенных микроорганизмов рода Bacillus, вызывающих спорадические заболевания людей.

Реализуемые учебные программы профессиональной переподготовки и повышения квалификации, разработанные в соответствии с Федеральным государственным образовательным стандартом по специальности 32.08.14 «Бактериология», включают профессиональные навыки, приобретаемые в процессе обучения слушателями, но не содержат перечня штаммов бактерий для обеспечения выполнения учебного плана [11-15]. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, не обнаружил сведений о штаммах, рекомендуемых для использования в целях обучения вопросам микробиологии и лабораторной диагностике сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза.

В настоящее время в учебном процессе используют как вакцинные штаммы бактерий В. anthracis СТИ-1, Francisella tularensis 15 НИИЭГ, Brucella abortus 19 В А, имеющих остаточную вирулентность, так и вирулентные штаммы.

Использование вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, F. tularensis 15 НИИЭГ, В. abortus 19 ВА для подготовки проб при проведении учений по обнаружению ПБА в объектах окружающей среды и материале от больных людей и животных обеспечивает биологическую безопасность при проведении практических занятий, однако позволяет изучить только часть биологических свойств возбудителей ООИ. А именно:

Использование вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 позволяет изучить типичные видовые культурально-морфологические свойства; биохимические, антигенные, генетические особенности и чувствительность к сибиреязвенному бактериофагу [16-18]. Вместе с тем, вызывать инфекционную болезнь у человека и животных могут также штаммы, отличающиеся по ряду биологических свойств (капсулообразование, морфология колоний, биохимические свойства) и генетических характеристик (набор генов, плазмидный профиль). Также при освоении на практических занятиях биологического метода лабораторной диагностики заражение лабораторных животных (белых мышей) вакцинным штаммом в дозе 10⁹ спор не вызывает их гибели, не обеспечивает типичной клинической и патоморфологической картины сибиреязвенной инфекции и стабильного выделения В. anthracis СТИ-1 из внутренних органов биопробных животных при посеве их на питательные среды.

Использование вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ позволяет изучить только часть биологических свойств возбудителя туляремии, характерных для одного из четырех подвидов - F. tularensis подвид holarctica; биохимические, антигенные, генетические особенности, характерные для вакцинного штамма, а также освоить на практических занятиях биологический метод лабораторной диагностики туляремии [16, 19, 20]. Вместе с тем, вызывать туляремию у человека могут также штаммы, относящиеся к трем другим подвидам - ssp. tularensis, mediasiatica и novicida. Изучение их фенотипических и генотипических особенностей необходимо с целью своевременной, точной индикации возбудителя туляремии и оперативного проведения профилактических мероприятий.

Использование вакцинного штамма В. abortus 19 В А позволяет изучить только часть биологических свойств возбудителя бруцеллеза, характерных для вида abortus - одного из четырех патогенных для человека видов бруцелл: биохимические, антигенные, генетические особенности и чувствительность к бруцеллезным бактериофагам [16, 21, 22]. Вместе с тем, вызывать инфекционный процесс у человека могут также штаммы, относящиеся к видам melitensis, suis, canis. Изучение их фенотипических и генотипических особенностей необходимо с целью освоения особенностей культивирования и биохимической активности видов и отдельных штаммов, оперативной индикации возбудителя болезни для своевременного проведения профилактических мероприятий. Кроме того, моделирование бруцеллеза с помощью вакцинного штамма не обеспечивает стабильное выделение патогена из всех внутренних органов и крови биопробных животных при посеве их на питательные среды.

В настоящее время с целью реализации учебного плана в полном объеме для освоения фенотипических и генотипических свойств штаммов В. anthracis, F. tularensis, Brucella spp., отличающихся от вакцинного, а также биологического метода диагностики инфекций используют вирулентные штаммы. Вместе с тем слушатели курсов зачастую не владеют навыками выполнения микробиологических манипуляций в соответствии с правилами биологической безопасности, что обусловливает повышенный риск лабораторных заражений. В частности, по статистическим данным бруцеллез признан одной из самых распространенных в мире «лабораторно-приобретенных» инфекцией [2]. Для снижения вероятности биологических рисков согласно концепции «Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности РФ на период до 2025 года и дальнейшую перспективу» необходимо исключить или минимизировать использование в технологических процессах патогенных микроорганизмов [23]. Данный государственный подход необходимо реализовывать при обучении специалистов правилам работы с возбудителями ООИ и снижать биологические риски обучающих технологий, заменяя вирулентные штаммы микроорганизмов на учебные штаммы, показатель вирулентности которых не превышает установленный для вакцинных: В. anthracis СТИ-1 - LD₅₀ для белых мышей - более 10⁷ спор [24], F. tularensis 15 НИИЭГ - от 10² до 2×10⁶ КОЕ [25], В. abortus 19 ВА - ID₅₀ для белых мышей - от 5,0×10² до 5,0⋅10⁵ КОЕ, для морских свинок - более 5,0×10⁴ КОЕ [26].

Известны наборы штаммов для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики холеры и чумы, включающие как авирулентные, так и вирулентные штаммы [28, 29]. Применение авирулентных штаммов возбудителей чумы и холеры снижает риск инфицирования обучающихся, которые только осваивают выполнение манипуляций с возбудителями особо опасных инфекций в соответствии с правилами биологической безопасности. Анализ алгоритмов использования данных учебных наборов позволил выбрать в качестве прототипа «Набор штаммов бактерий, используемый для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики чумы» как наиболее близкий по принципам подбора штаммов и осваиваемым регламентированным методам лабораторной диагностики [29].

Кроме того, процесс обучения лабораторной диагностике сибирской язвы сопряжен с необходимостью дифференциации возбудителя от других патогенных для человека бацилл {В. cereus), вызывающих пищевые токсикоинфекции. Следовательно, для реализации учебного плана практических занятий в полном объеме необходимы также штаммы вида В. cereus.

Таким образом, в данной области существует необходимость освоить в полном объеме вопросы микробиологии и лабораторной диагностики сибирской в разработке комплекта штаммов бактерий для использования в учебном процессе, позволяющих язвы, туляремии, бруцеллеза и снизить риск лабораторного инфицирования.

Для обеспечения учебного процесса необходимы штаммы бактерий, позволяющие продемонстрировать отдельные базовые свойства, регламентированные при лабораторной диагностике изучаемой ООИ:

1) для учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика сибирской язвы»:

- штаммы В. anthracis, в геноме которых отсутствуют одна или обе основные детерминанты вирулентности (плазмида рОХ1 и рОХ2); показатель вирулентности которых не превышает установленный для вакцинных штаммов (LD₅₀ для белых мышей более 10⁷ спор); обладающие типичными видовыми культурально-морфологическими свойствами, биохимическими свойствами; отличающиеся по способности образовывать капсулу в организме теплокровного хозяина и при культивировании на сывороточном агаре; имеющие различные сочетания генов вирулентности pagA (плазмида рОХ1) и cap А (плазмида рОХ2), для демонстрации вариантов детекции с помощью наборов реагентов для полимеразной цепной реакции (ПЦР); выявляемые с помощью регламентированных иммунологических методов - метода флуоресцирующих антител (МФА), иммунохроматографического теста (ИХА-тест); при заражении лабораторных животных, формирующие типичные патоморфологические изменения во внутренних органах; накапливающиеся и обеспечивающие стабильное выделение бактериальной культуры при посеве на питательные среды проб всех внутренних органов и крови; чувствительные к антибактериальным препаратам, применяемым для экстренной профилактики сибирской язвы;

- штаммы В. cereus, обладающие типичными видовыми биологическими свойствами, актуальными при дифференциации с возбудителем сибирской язвы.

2) для учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии»:

- штаммы F. tularensis, показатель вирулентности которых не превышает установленный для вакцинных штаммов (LD₅₀ более 10 КОЕ для белых мышей); отличающиеся по культурально-морфологическими признакам, способности ферментировать глюкозу, мальтозу, маннозу, глицерин, цитруллинуреидазной, фосфатазной и β-лактамазной активности, результатам индикации с помощью регламентировнных иммунологических методов - МФА, реакции агглютинации (РА) на стекле для изучения алгоритма дифференциации F. tularensis подвидов holarctica, tularensis, mediasiatica, novicida; обладающие типичными генетическими маркерами вида F. tularensis (iglBC) и подвидов (ISFtu2, FTT 1670 с), детекция которых осуществляется с помощью наборов реагентов для ПЦР, имеющих государственную регистрацию; при заражении лабораторных животных, формирующие типичные патоморфологические изменения во внутренних органах; накапливающиеся и обеспечивающие стабильное выделение бактериальной культуры при посеве на питательные среды проб всех внутренних органов и крови; чувствительные к антибактериальным препаратам, применяемым для экстренной профилактики туляремии;

3) для учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика бруцеллеза»:

- штаммы Brucella spp., показатель вирулентности которых не превышает установленный для вакцинных штаммов (ID₅₀ для белых мышей - от 5,0×10² до 5,0×10⁵ КОЕ, для морских свинок - более 5,0×10⁴ КОЕ); обладающие типичными родовыми культурально-морфологическими свойствами; отличающиеся по потребности в присутствии 10% СО₂ при культивировании первой генерации бруцелл, интенсивности образования сероводорода, уреазной активности, редуцирующей активности в отношении анилиновых красителей (тионина, фуксина); обладающие родоспецифическими антигенами, выявляемыми с помощью регламентированных иммунологических методов - МФА, РА с диагностической бруцеллезной поливалентной сывороткой; обладающие геном bcsp31 и отличающиеся по наличию генов BRA0420, BRA0907, BMEI1426, BMEII0711, BMEI099, детекция которых осуществляется с помощью наборов реагентов для ПЦР; при заражении лабораторных животных размножающиеся, накапливающиеся во внутренних органах и обеспечивающие стабильное выделение бактериальной культуры при посеве на питательные среды проб всех внутренних органов и крови; чувствительные к антибактериальным препаратам, применяемым для экстренной профилактики бруцеллеза.

Задача заявляемого изобретения - создание комплекта штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики возбудителей сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза, содержащего преимущественно авирулентные штаммы (вакцинные и/или близкие к ним по показателю вирулентности), позволяющие снизить риск инфицирования слушателей курсов при самостоятельной работе на практических занятиях, продемонстрировать биологические свойства на уровне рода и вида (фенотипические, биохимические, антигенные свойства, генетические особенности) - базовые для лабораторной диагностики данных инфекций регламентированными методами индикации и идентификации, межвидовой {Brucella spp., В. anthracis) и внутривидовой (F. tularensis) дифференциации, а также штаммов В. cereus, стабильно сохраняющих фенотипические, биохимические, антигенные свойства, для дифференциации возбудителя сибирской язвы от близкородственных патогенных для человека бацилл - возбудителей пищевой токсикоинфекции.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в увеличении эффективности обучения специалистов при освоении многообразия биологических свойств возбудителей сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза, методов индикации, идентификации и дифференциации В. anthracis, F. tularensis, Brucella spp., а также в повышении биологической безопасности процесса обучения, в снижении рисков инфицирования обучающихся при освоении методов лабораторной диагностики ООИ на практических занятиях.

Технический результат обеспечивается за счет использования комплекта штаммов бактерий в процессе обучения лабораторной диагностике сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза на практических занятиях в рамках трех учебных модулей. Для учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика сибирской язвы» подобран набор из штамма В.anthracis 71/12, авирулентных штаммов В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis Sterne 34 F2, а также штамма В. cereus АТСС 14579, позволяющего дифференцировать сибиреязвенный микроб от близкородственных патогенных для человека бацилл. Для учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» подобран набор из штамма F. tularensis А-61 подвида mediasiatica и авирулентных штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis Schu 7, F. tularensis Utah 112 (ATCC 15482). Для модуля «Микробиология и лабораторная диагностика бруцеллеза» подобран набор из штаммов В. melitensis 16 М, В. ovis 25-90, В. canis 1066 и авирулентных штаммов В. abortus 19 ВА, В. abortus С-68, В. suis 1330, В. suis 40, В. neotomae 5k33.

Для практических занятий учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика сибирской язвы» отобраны штаммы, поддерживаемые в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб», ранее не использовавшиеся в наборе в целях обучения:

1. В. anthracis СТИ-1 - вакцинный штамм, М-21^{1 (1} М - тут и далее - номер регистрации в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб»), III группа патогенности. Получен из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Обладает типичными для вида В. anthracis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками [16]: крупные (1-1,5 мкм × 6-10 мкм) грамположительные палочки, неподвижные, расположенные единично, попарно или цепочками, с обрубленными концами; рост на питательных средах в R-форме - на агаре Хоттингера формирует через 18-24 ч крупные шероховатые сухие матовые колонии серо-белого цвета, с «шагреневой» поверхностью и неровными краями, которые при просмотре под малым увеличением светового микроскопа похожи на «львиную гриву»; споры овальной (0,8-1,0×1,2-1,5 мкм) формы, в палочках располагаются центрально, не превышая диаметр тела микробной клетки, в бульоне - придонный рост в виде «комочка ваты», трудно разбивающегося при встряхивании, бульон над осадком прозрачный.

Особые свойства штамма: при исследовании МФА - специфическое свечение вегетативных клеток - 3-4+; не образует капсул в организме хозяина и при культивировании на сывороточном агаре; не обладает гемолитической активностью (на среде с эритроцитами барана); обладает протеолитической активностью (разжижение желатины на 3-4 сутки); не продуцирует щелочную фосфатазу, лецитиназу, гемолизин, лизирующий эритроциты барана. Лизируется сибиреязвенным диагностическим бактериофагом «Гамма А-26».

Вирулентность для лабораторных животных: авирулентный, не вызывает гибели зараженных белых мышей; генетические характеристики: pXO1⁺, pXO2^-.

2. В. anthracis Steme 34 F2 - вакцинный для животных, эталонный международный штамм, М-162, II группа патогенности. Получен из ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Обладает типичными для вида В. anthracis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками [16].

Особые свойства штамма: при исследовании МФА: специфическое свечение вегетативных клеток - 3+. Не образует капсул в организме хозяина и при культивировании на сывороточном агаре.

Вирулентность для лабораторных животных: авирулентный, не вызывает гибели зараженных белых мышей; генетические характеристики: pXO1⁺, pXO2^-. На 3-4 сутки после заражения у животных в области введения культуры отмечается развитие местных изменений подкожной клетчатки. Лизируется сибиреязвенным диагностическим бактериофагом «Гамма А-26».

3. В. anthracis 71/12 - вакцинный для животных (2-я вакцина Ценковского), М-22, II группа патогенности. Получен из ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Обладает типичными для вида В. anthracis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками [16].

Особые свойства штамма: на агаре Хоттингера формирует через 18-24 ч небольшие белые, блестящие, круглые колонии, при дальнейшем культивировании (до 48 ч) колонии становятся матовыми, с неровным краем, средней величины (R-форма). Формирует капсулу в организме хозяина и при культивировании на бикарбонатно-сывороточном агаре.

Вирулентность для лабораторных животных: LD₅o для белых мышей - 6,76×10² спор; генетические характеристики: pXO1⁺, pXO2⁺. Вызывает формирование у лабораторных животных типичных для сибирской язвы патоморфологических изменений подкожной клетчатки и внутренних органов; стабильное выделение В. anthracis из всех паренхиматозных органов и крови при посеве на питательные среды. Лизируется сибиреязвенным диагностическим бактериофагом «Гамма А-26».

Все штаммы В. anthracis чувствительны к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики сибирской язвы: доксициклину, рифампицину ампициллину, феноксиметилпенициллину, ципрофлоксацин.

4. В. cereus АТСС 14579, М-734, IV группа патогенности. Получен из Иркутского НИПЧИ.

Обладает типичными для вида В. cereus культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими свойствами: крупные (1,0-1,2 × 3-5 мкм) грамположительные палочки, не образующие капсулы, расположенные цепочками, с обрубленными концами; споры овальной формы, в палочках располагаются центрально, не превышая диаметр тела микробной клетки; рост на питательных средах - на плотной питательной среде формирует крупные шероховатые колонии белого цвета, с неровным краем, в жидкой питательной среде - равномерное легкое помутнение и образование на дне пробирки белого осадка, разбивающегося при встряхивании на мелкие хлопья; наличие подвижности; наличие гемолитической активности (на среде с эритроцитами барана); наличие продукции щелочной фосфатазы, лецитиназы.

Особые свойства штамма: наличие протеолитической активности (разжижение желатины на 1-2 сутки); при исследовании МФА с сибиреязвенными иммуноглобулинами специфическое свечение вегетативных клеток отсутствует; не лизируется сибиреязвенным диагностическим бактериофагом Гамма А-26.

Штамм чувствителен к антибактериальным препаратам, регламентированным для экстренной профилактики сибирской язвы: доксициклину, ципрофлоксацину, амикацину. Устойчив к ампициллину.

Подобранные штаммы бактерий позволяют продемонстрировать в процессе обучения базовые для лабораторной диагностики сибирской язвы биологические особенности вида В. anthracis, отдельных штаммов, их отличия от близкородственных патогенных для человека бацилл и снизить риск инфицирования обучающихся.

Использование набора штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики сибирской язвы, иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Использование штаммов при изучении морфологических и культуральных особенностей сибиреязвенного микроба

Лабораторная диагностика сибирской язвы начинается с индикации возбудителя в исследуемом материале, одним из первых методов является оценка морфологии микробных клеток при окраске мазков по методам Грама, Ребигера, Циля-Нильсена.

Для изучения морфологии клеток возбудителя сибирской язвы на практических занятиях используют авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 71/12.

Использование штамма В. anthracis СТИ-1 позволяет обучающимся ознакомиться с морфологическими характеристиками клетки, типичными для вида В. anthracis, не формирующей капсулу.

В мазках, окрашенных по Граму, сибиреязвенный микроб имеет вид крупных грамположительных палочек, расположенных единично, попарно или цепочками, с обрубленными концами. В мазках, окрашенных по Ребигеру, тело микробной клетки окрашивается в темно-фиолетовый цвет, капсула отсутствует.

При нахождении В. anthracis СТИ-1 в стадии спорообразования в мазках, окрашенных по методу Циля-Нильсена, видны овальные или круглые образования, розового цвета с красным ободком по периферии, не выходящие за пределы клеточной стенки.

Использование штамма В. anthracis 71/12 позволяет изучить морфологические характеристики штаммов сибиреязвенного микроба, формирующих капсулу в организме хозяина и при культивировании на бикарбонатно-сывороточном агаре.

В мазках-отпечатках паренхиматозных органов лабораторных животных, зараженных В. anthracis 71/12, или в мазках из культуры, выращенной на 1% бикарбонатном агаре в атмосфере, содержащей 10% СО₂ колонии, окрашенных по Ребигеру, тело микробной клетки окрашивается в темно-фиолетовый цвет, а капсула - в красно-фиолетовый.

Кроме того, важной характеристикой бактерий вида В. anthracis является оценка культуральных свойств. Характерными признаком сибиреязвенного микроба является рост в R-форме на плотных и жидких питательных средах.

Для изучения культуральных свойств возбудителя сибирской язвы на практических занятиях используют авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 71/12.

Штаммы В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 71/12 выращивают 24 часа в бульоне и на агаре Хоттингера рН 7,4 при температуре 37°С, а затем визуально оценивают морфологию роста бактерий. Посев В. anthracis 71/12 на агаре Хоттингера рН 7,4 культивируют еще 24 часа.

Использование В. anthracis СТИ-1 позволяет изучить морфологию R-формы роста сибиреязвенного микроба, характеризующуюся формированием на агаре крупных шероховатых сухих матовых колонии серо-белого цвета с неровными краями, которые при просмотре под малым увеличением светового микроскопа похожи на «львиную гриву»; в бульоне наблюдается придонный рост в виде «комочка ваты», трудно разбивающегося при встряхивании, бульон над осадком прозрачный.

Использование штамма В. anthracis 71/12 позволяет изучить особенности морфологии колоний штамма сибиреязвенного микроба, формирующего капсулу. Через 18-24 ч культивирования на 1% бикарбонатном агаре в атмосфере, содержащей 10% СО₂, формируются небольшие белые блестящие колонии, при дальнейшем культивировании (до 48 ч) колонии становятся матовыми, с неровным краем, средней величины.

Пример 2. Использование штаммов при освоении иммунологических методов лабораторной диагностики сибирской язвы

Одно из ведущих мест в комплексе регламентированных методов индикации возбудителя сибирской язвы занимают иммунологические реакции в связи с высокой специфичностью и информативностью.

Исследования проводят с помощью МФА и иммунохроматографического теста (ИХ-тест).

Для постановки МФА используют препарат «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие» или «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные ».

При моделировании проб для изучения с помощью МФА используют авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1.

Для подготовки проб клинического материала, содержащих вегетативные клетки, В. anthracis СТИ-1 культивируют в бульоне и на агаре Хоттингера рН 7,4 в течение 18-24 часов при 37°С.

Результаты МФА с препаратом «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные» оценивают как специфическое свечение с яркостью 4+ креста при обнаружении большого количества специфически светящихся (сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастируемая с темным телом клетки) клеток, расположенных длинными цепочками.

Для подготовки елирования проб объектов окружающей среды (почвы, воды, смывов с различных поверхностей), содержащих споры, В. anthracis СТИ-1 выращивают на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2, содержащим 60% аминного азота, при 37°С от 4 до 7 суток.

Результаты МФА с препарат «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие» оценивают как специфическое свечение с яркостью 4+ креста при обнаружении большого количества спор со специфическим свечением (сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета) по периферии, четко контрастируемым с темным внутренним содержимым сомы, расположенных цепочками и единично.

Для постановки ИХ-теста используют «Набор реагентов для иммунохроматографического экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы» (ИХ-тест В. anthracis), специфической мишенью которого является споровый антиген сибиреязвенного микроба.

При моделировании проб, применяемых на практических занятиях для освоения ИХ-теста, используют авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1, подготовленный в виде суспензии в концентрации 1⋅10⁸ м.к./мл из культуры, выращенной:

- на агаре Хоттингера рН 7,2 в течение 18-24 ч при 37°С. Результат ИХ-теста оценивают как отрицательный - наличие видимой красной линии в зоне "С" и отсутствие в зоне "Т", что свидетельствует об отсутствии в пробе спор сибирской язвы, но не позволяет исключить наличие вегетативных клеток.

- на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2, содержащем 60% аминного азота, в течение 10 суток при 30-31°С. Результат ИХ-теста оценивают как положительный -наличие видимых красных линий в зонах "С" и "Т", что свидетельствует о наличии в пробе спор сибирской язвы.

Пример 3. Использование штаммов при обучении лабораторной диагностике сибирской язвы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

В схеме лабораторной диагностики сибирской язвы ПЦР используют как на этапе индикации при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды, так и при идентификации выделенных культур.

Для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в качестве мишеней используют гены вирулентности pag А (плазмида pXOl) и cap А (плазмида pXO2). Однако известны штаммы В. anthracis, отличающиеся по плазмидному составу.

При освоении метода ПЦР в схеме лабораторной диагностики сибирской язвы на практических занятиях используют штаммы с разным набором видоспецифичных генов: авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 71/12 (2-я вакцина Ценковского).

Применение штамма В. anthracis СТИ-1 позволяет провести диагностику возбудителя сибирской язвы, содержащего ген pag А (pXO1⁺) и не имеющего гена cap А (pXO2⁺).

Применение штамма В. anthracis 71/12 позволяет провести диагностику возбудителя сибирской язвы, содержащего ген pag А (pXO1⁺) и ген cap А (pXO2⁺).

Пример 4. Использование штаммов при лабораторной диагностике сибирской язвы биологическим методом

В схеме лабораторной диагностики сибирской язвы биологический метод является обязательным на этапе индикации, выделения и накопления бактериальной культуры. При заражении вирулентными штаммами В. anthracis лабораторные животные заболевают и погибают на 2-5-ые сутки наблюдения; при вскрытии отмечаются характерные для сибирской язвы патоморфологические изменения. Из участков пораженных паренхиматозных органов (лимфоузлов, селезенки, печени, легких) и крови выделяют культуру возбудителя сибирской язвы.

Для освоения биологического метода исследования в схеме лабораторной диагностики сибирской язвы на практических занятиях используют штаммы В. anthracis Sterne 34 F2 (не вызывает гибели зараженных белых мышей) и В. anthracis 71/12 (LD₅₀=6,76⋅10² спор).

Методику заражения и вскрытия на практических занятиях преподаватели демонстрируют обучающимся на штамме В. anthracis 71/12, вирулентном для белых мышей. При подкожном заражении данным штаммом у погибших лабораторных животных обнаруживают типичные для сибирской язвы патоморфологические изменения подкожной клетчатки и внутренних органов: в месте введения материала - полнокровие сосудов, кровоизлияния; увеличение и гиперемию лимфатических узлов; желеобразный отек подкожной клетчатки передней брюшной стенки, пропитывание тканей, окружающих лимфоузлы, студневидной серозно-геморрагической жидкостью; в легких - очаги кровоизлияния темно-красного цвета; селезенка и печень увеличены, дряблой консистенции, полнокровны. При посевах на плотные питательные среды из всех внутренних органов и крови животных выделяют культуру возбудителя сибирской язвы.

Однако манипуляции при заражении и вскрытии лабораторных животных относятся к процедурам с высоким риском инфицирования, что определяет необходимость использования обучающимися для самостоятельной работы авирулентного штамма В. anthracis Sterne 34 F2, который не вызывает гибели зараженных белых мышей, обеспечивает биологическую безопасность при наличии на 3-4 сутки после заражения у белых мышей типичных для сибирской язвы патоморфологических изменений подкожной клетчатки в месте введения материала: гиперемия, отечность, инъекция сосудов и выделение единичных колоний бактериальной культуры из тканей лимфатического узла и селезенки.

Пример 5. Использование штаммов для освоения методов идентификации сибиреязвенного микроба при лабораторной диагностике сибирской язвы

Все выделенные культуры, подозрительные на принадлежность к виду В. anthracis, должны быть изучены на наличие биологических свойств вида. При идентификации штаммов данные о типичных морфологических и культуральных свойствах дополняют результатами изучения ряда признаков: подвижность, способность к капсулообразованию in vitro и in vivo, спорообразование, чувствительность к сибиреязвенным бактериофагам, лецитиназная активность, гемолитическая активность в отношении эритроцитов барана, фосфатазная активность, чувствительность к пенициллину [11, 13].

При изучении алгоритма видовой идентификации возбудителя сибирской язвы на практических занятиях используют авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 71/12.

Для изучения таксономических признаков бескапсульных штаммов вида В. anthracis на практических занятиях используют штамм В. anthracis СТИ-1, обладающий типичными культурально-морфологическими свойствами (Примеры 1, 2) и признаками: подвижность (-), способность к капсулообразованию in vitro (-) и in vivo (-), спорообразование (+), чувствительность к сибиреязвенному диагностическому бактериофагу «Гамма А-26» (+), лецитиназная активность (-), гемолитическая активность в отношении эритроцитов барана (-), фосфатазная активность (-), чувствительность к пенициллину (+).

Для изучения таксономических признаков капсульных штаммов вида В. anthracis на практических занятиях используют штамм В. anthracis 71/12, обладающий типичными культурально-морфологическими свойствами (Примеры 1, 2) и признаками: подвижность (-), способность к капсулообразованию in vitro (+) и in vivo (+), спорообразование (+), чувствительность к сибиреязвенному диагностическому бактериофагу «Гамма А-26» (+), лецитиназная активность (-), гемолитическая активность в отношении эритроцитов барана (-), фосфатазная активность (-), чувствительность к пенициллину (+).

Пример 6. Использование штаммов при дифференциации В. anthracis от близкородственных микроорганизмов, выделяемых из проб клинического материала и объектов окружающей среды

Патогенные для человека представители вида В. cereus, имеющие морфологические признаки, сходные с В. anthracis, могут вызывать острые инфекционные болезни (пищевые токсикоинфекции, поражения глазного яблока, сепсис) с тяжелым течением и интоксикацией. Кроме того, они распространены повсеместно, в том числе на неблагополучных по сибирской язве территориях, и могут вызывать заболевания диких и домашних животных. Все это определяет необходимость проведения дифференциации возбудителя сибирской язвы от В. cereus на основании морфологических, культуральных, биохимических, иммунологических, молекулярно-генетических признаков.

Для проведения дифференциации используют авирулентный вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1, обладающий типичными видовыми признаками вида В. anthracis, и штамм В. cereus АТСС 14579, позволяющий продемонстрировать типичные признаки вида В. cereus.

Применение штамма В. cereus АТСС 14579 позволяет обучающимся по ряду типичных видовых признаков отнести выделенную бактериальную культуру к виду В. cereus и отдифференцировать ее от В. anthracis на основании ряда физиолого-биохимических признаков: а) рост бактериальной культуры на питательных средах: на плотных питательных средах в течение 24 часов формируются видимые невооруженным глазом плотные, белые (иногда желтоватые), с извитыми нитями по краю (под малым увеличением микроскопа) колонии; в жидких питательных средах - бульон гомогенно мутный, прочная поверхностная пленка, пристеночное кольцо, на дне белый трудноразбиваемый крошковатый осадок б); наличие подвижности при 37°С; в) наличие лецитиназной активности; г) наличие гемолитической активности в отношении эритроцитов барана; д) наличие фосфатазной активности; е) отсутствие чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу «Гамма А-26»; ж) отсутствие чувствительности к пенициллину; з) отрицательные результаты иммунологических реакций (МФА, ИХ-тест) и ПЦР с использованием имеющих государственную регистрацию наборов реагентов для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы [11, 13].

Использование описанных выше штаммов бактерий позволяет обеспечить в полном объеме реализацию планов практических занятий, обучающимся самостоятельно на авирулентном вакцинном штамме В. anthracis СТИ-1 приобрести навыки работы с возбудителем сибирской язвы и освоить в полном объеме регламентированные методы индикации, идентификации и дифференциации В. anthracis. Кроме того использование авирулентного вакцинного штамма и штаммов В. anthracis, степень патогенности которых находится в пределах показателей вакцинного штамма, позволяет минимизировать вероятность лабораторного инфицирования обучающихся, тем самым обеспечивая биологическую безопасность практических занятий.

Для практических занятий учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика туляремии» отобраны штаммы, поддерживаемые в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб», ранее не использовавшиеся в наборе в целях обучения:

1. Штамм F. tularensis 15 НИИЭГ - вакцинный, М-3, относится к подвиду holarctica. Получен из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Обладает типичными для вида F. tularensis подвида holarctica культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками [16]. Грамотрицательные неподвижные мелкие коккобактерии, не образующие спор; при культивировании при 37°С на FT-arape на 2-3 сутки отмечают рост колоний диаметром 1-1,5 мм в S-форме (беловато-серые, блестящие колонии, однородные, полупрозрачные с ровным краем). Имеет β-лактамазную активность. Не обладает цитруллинуреидазной, фосфатазной активностью.

Особые свойства штамма. Вирулентность для лабораторных животных: LD₅₀ для белых мышей 928 КОЕ. Реакция агглютинации на стекле с иммуноглобулинами туляремийными диагностическими адсорбированными сухими: 4+. При постановке МФА специфическое свечение: 4+.

На 3-4 сутки после заражения у животных в области введения культуры отмечается развитие патоморфологических изменений подкожной клетчатки и отдельных паренхиматозных органов: гиперемия сосудов подкожной клетчатки, увеличение паховых лимфоузлов, умеренное увеличение размеров и дряблость печени и селезенки; при посеве паренхиматозных органов отпечатками на плотные питательные среды выделяют колонии из селезенки и печени.

Генетические характеристики: наличие генов iglBC, ISFtu2, ISFtu5, FTT_1272 (A), RD-1 область имеет делецию размером 389 п.н.

2. Штамм F. tularensis Schu 7 - кандидат в вакцинные, М-77, относится к подвиду tularensis. Получен из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР.

Обладает типичными биологическими свойствами для видаК tularensis [16].

Обладает типичными для подвида tularensis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: цитруллинуреидазной активностью, фосфатазной активностью, β-лактамазной активностью [16].

Особые свойства штамма. Вирулентность для лабораторных животных: LD₅₀ для белых мышей - 1,36⋅10² КОЕ.

Реакция агглютинации на стекле с иммуноглобулинами туляремийными диагностическими адсорбированными сухими: 4+. При постановке МФА специфическое свечение: 4+. Сбраживает маннозу; не сбраживает мальтозу.

Генетические характеристики: наличие генов iglBC, FTT 1670 с, FTT 1272 (G), RD-1 область не имеет делеций.

3. Штамм F. tularensis А-61 - природный, М-93, относится к подвиду mediasiatica. Получен в 1960 г. из Среднеазиатского ПЧИ (г. Алма-Аты).

Обладает типичными для видаК tularensis биологическими признаками [16].

Обладает типичными для подвида mediasiatica культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: цитруллинуреидазной, фосфатазной активностью; не обладает β-лактамазной активностью.

Особые свойства штамма. Вирулентность для лабораторных животных: LD₅₀ для белых мышей 5 КОЕ. Вызывает формирование у лабораторных животных типичных для туляремии патоморфологических изменений подкожной клетчатки и внутренних органов; стабильное выделение F. tularensis из всех паренхиматозных органов и крови животных при посеве на питательные среды. При культивировании на FT-arape при 37°С на 3-й сутки отмечают рост колоний диаметром 1 мм в S-форме (беловато-серые, блестящие колонии, однородные, полупрозрачные с ровным краем). Реакция агглютинации на стекле с иммуноглобулинами туляремийными диагностическими адсорбированными сухими: 4+. При постановке МФА специфическое свечение: 4+.

Генетические характеристики: наличие генов iglBC, FTT 1670 с, FTT_1272 (А) и ISFtu5, RD-1 область имеет делецию размером 68 п. н.

4. Штамм F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482) получен в 1990 г. из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, М-130, относится к подвиду novicida.

Обладает типичными для видаК tularensis биологическими признаками [16].

Обладает типичными для подвида novicida культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: сбраживает сахарозу, глицерин; не сбраживает лактозу; обладает цитруллинуреидазной, фосфотазной, β-лактамазной активностью.

Особые свойства штамма. Вирулентность для лабораторных животных: LD₅₀ для белых мышей более 10⁶ КОЕ. Реакция агглютинации на стекле с иммуноглобулинами туляремийными диагностическими адсорбированными сухими: (-). При постановке МФА специфическое свечение: (-). Не сбраживает глюкозу, мальтозу; обладает способностью к сбраживанию маннозы.

Генетические характеристики: наличие генов iglBC, FTT 1272 (A), FTT1670c.

Все штаммы F. tularensis чувствительны к антибактериальным препаратам - доксициклин, рифампицин, ципрофлоксацин, гентамицин, регламентированным для экстренной профилактики туляремии.

Использование набора штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики туляремии иллюстрируется следующими примерами:

Пример 7. Использование штаммов при изучении морфологических и культуральных свойств возбудителей туляремии

При индикации возбудителя туляремии в исследуемом материале регламентировано получение информации о морфологических свойствах возбудителя инфекционной болезни. Морфологию клеток туляремийного микроба оценивают с помощью световой микроскопии мазков исследуемого материала, окрашенных стандартными методами - по Граму и Романовскому-Гимзе; морфологию колоний - по результатам культивирования на FT-arape в течение 48 часов при 37°С.

Для изучения морфологии клеток возбудителя туляремии на практических занятиях используют вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ. Использование штамма позволяет обучающимся ознакомиться с морфологическими характеристиками клетки, типичными для вида F. tularensis.

В мазках, окрашенных по Граму, клетки F. tularensis имеют вид кокковидных или элипсоидных полиморфных грамотрицательных палочек (коккобациллы 0,5 мкм × 1-2 мкм), расположенных на светло-розовом фоне; в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе - темно-фиолетовых кокковидных или элипсоидных полиморфных палочек, расположенных на светло-сиреневом фоне.

Для изучения особенностей морфологии колоний возбудителя туляремии на плотных питательных средах используют вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, а также штаммы F. tularensis А-61, F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482).

Штамм F. tularensis 15 НИИЭГ подвида holarctica на FT-arape формирует колонии в S-форме: гладкие, круглые, диаметром около 1,5-2 мм, выпуклые, голубовато-сероватые в проходящем свете, слизистые, полупрозрачные, с ровным краем, блестящие, хорошо снимаются петлей с поверхности агаровой пластины.

Штамм F. tularensis А-61 подвида mediasiatica отличается ростом на FT-arape в виде более мелких (диаметр не более 1 мм), прозрачных, голубоватых в проходящем свете колоний в S-форме на 3-й сутки культивирования.

Штамм F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482) подвида novicida на FT-arape формирует крупные колонии диаметром 2-2,5 мм в S-форме.

Пример 8. Использование штаммов при освоении биологических свойств подвидов F. tularensis

В соответствии с международной классификацией вид F. tularensis делят на четыре подвида - F. tularensis subsp.tularensis (тип A), F. tularensis subsp.holarctica (тип В), F. tularensis subsp.mediasiatica и F. tularensis subsp.novicida.

Одним из этапов дифференциации штаммов F. tularensis на подвиды проводят с учетом особенности экспрессии ряда биохимических признаков: ферментация глицерина, наличие цитруллинуреидазной, Р-лактамазной, фосфатазной активностей [16].

Для изучения особенностей данных признаков у подвидов туляремийного микроба на практических занятиях используют штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ, F. tularensis Schu 7, F. tularensis A-61, F. tularensis Utah 112 (ATCC 15482).

Для изучения таксономических признаков штаммов подвида holarctica на практических занятиях используют штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, обладающий типичными признаками: ферментация глицерина (-), цитруллинуреидазная активность (-), β-лактамазная активность (+), фосфатазная активность (-).

Для изучения таксономических признаков штаммов подвида tularensis на практических занятиях используют штамм F. tularensis Schu 7, обладающий типичными признаками: ферментация глицерина (+), цитруллинуреидазная активность (+), β-лактамазная активность (+), фосфатазная активность (+).

Для изучения таксономических признаков штаммов подвида mediasiatica на практических занятиях используют штамм F. tularensis А-61, обладающий типичными признаками: ферментация глицерина (+), цитруллинуреидазная активность (+), β-лактамазная активность (-), фосфатазная активность (+).

Для изучения таксономических признаков штаммов подвида novicida на практических занятиях используют штамм F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482), обладающий типичными признаками: ферментация глицерина (+), цитруллинуреидазная активность (+), β-лактамазная активность (+), фосфатазная активность (+).

Применение штаммов бактерий позволяет обучающимся на практических занятиях, провести внутривидовую дифференциацию возбудителя туляремии.

Пример 9. Использование штаммов при освоении лабораторной диагностики туляремии иммунологическими методами

При диагностическом исследовании проб клинического материала или объектов окружающей среды, подозрительных на содержание возбудителей туляремии большую роль отводят иммунологическим методам исследования, что связано со сложностями при выделении и накоплении чистой культуры туляремийного микроба (внутриклеточное расположение, плохой рост на простых питательных средах, небольшая концентрация во внутренних органах человека и теплокровных животных). При лабораторной диагностике туляремии у человека и животных регламентированными методами индикации и идентификации являются МФА и ИХ-тест. Для постановки МФА и ИХ-теста используют набор реагентов «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие туляремийные сухие» и «Набор реагентов для иммунохроматографического экспресс-выявления и идентификации возбудителя туляремии (ИХ-тест F. tularensis)», для которых специфической мишенью является липополисахарид (ЛПС) F. tularensis. Структура ЛПС у штаммов подвида tularensis, подвида mediasiatica и подвида holarctica идентична и высокоспецифична антителам, используемым в наборах реагентов, что позволяет получать положительный результат при проведении исследования о наличии в материале бактерий вида F. tularensis. Вместе с тем ЛПС штаммов подвида novicida отличается по структуре от ЛПС других подвидов и не могут образовывать комплексы с антителами, используемыми в указанных наборах реагентов, что обусловливает отрицательные результаты при исследовании с их помощью.

При обучении регламентированным иммунологическим методам лабораторной диагностики туляремии на практических занятиях используют вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ и F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482).

Результаты МФА со штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ оценивают как специфическое свечение с яркостью 4+- 3+ у 3-5 клеток в каждом поле зрения, что свидетельствует о принадлежности штаммов к виду F. tularensis; со штаммом F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482) - специфическое свечение отсутствует (отрицательный результат), что не дает основания для отрицания принадлежности штамма к виду F. tularensis.

Результаты ИХ-теста со штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ оценивают как положительный - наличие видимых красных линий в зонах "С" и "Т", что свидетельствует о наличии в исследуемом материале бактерий вида F. tularensis. Результат ИХ-теста со штаммом F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482) оценивают как отрицательный - наличие видимой красной линии в зоне "С" и отсутствие в зоне "Т", что свидетельствует об отсутствии специфических маркеров бактерий вида F. tularensis, но не позволяет полностью исключить наличие туляремийного микроба.

Пример 10. Использование штаммов при освоении лабораторной диагностики туляремии методом ПЦР

В схеме лабораторной диагностики туляремии ПЦР используют как на этапе индикации при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды, идентификации выделенных культур до вида, так и внутривидовой дифференциации штаммов F. tularensis.

Для постановки ПЦР используют зарегистрированные в установленном порядке наборы реагентов:

- «Набор реагентов для выявления ДНК Francisella tularensis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Francisella tularensis - РГФ)»,

- «Набор реагентов для ускоренной идентификации штаммов Francisella tularensis методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Francisella tularensis - подвид - РГФ)»,

- «Набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителя туляремии методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОМ-Скрин-Туляремия-РВ)».

Для отнесения выделенной культуры к виду F. tularensis применяют набор реагентов для выявления ДНК Francisella tularensis методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Ген Francisella tularensis-VTO), набор реагентов «Ген Francisella tularensis -РГФ», где в качестве ДНК-мишени выступают гены iglBC. Для определения подвида holarctica туляремийного микроба используют набор реагентов «Ген Francisella tularensis - подвид - РГФ», что позволяет определить наличие/отсутствие фрагментов ISFtu2 и FTT 1670 с генов, к которым комплементарны праймеры, включенные в состав наборов реагентов.

Применение набора реагентов «ОМ-Скрин-Туляремия-РВ» позволяет определить подвиды tularensis и novicida возбудителя туляремии по наличию/отсутствию фрагментов генов FTTJ272(G), FTTJ272(A), ISFtu5.

При освоении метода ПЦР в схеме лабораторной диагностики туляремии на практических занятиях используют штаммы с разным набором видоспецифичных генов патогенности - штамм F. tularensis 15 НИИЭГ, штаммы, F. tularensis Schu 7, F. tularensis Utah 112 (АТСС 15482), F. tularensis A-61.

Применение штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ, Schu 7, Utah 112 (ATCC 15482), A-61 позволяет провести индикацию бактерии вида F. tularensis по наличию генов iglBC. Идентификацию подвидов holarctica, tularensis, mediasiatica, novicida возбудителя туляремии проводят в соответствии с таблицей «Идентификация подвидов F. tularensis с применением генодиагностических препаратов»

Пример 11. Использование штаммов при освоении лабораторной диагностики туляремии биологическим методом

В схеме лабораторной диагностики туляремии биологический метод является регламентированным, а в ряде случаев единственным эффективным методом выделения и накоплении бактериальной культуры.

При заражении вирулентными штаммами F. tularensis лабораторные животные заболевают и погибают на 3-5-ые сутки наблюдения; при вскрытии отмечают характерные для туляремии патоморфологические изменения. Из участков пораженных паренхиматозных органов (лимфоузлов, селезенки, печени, легких) и крови выделяют культуру туляремийного микроба.

При освоении биологического метода в схеме лабораторной диагностики туляремии на практических занятиях используют вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ (LD₅₀=928 КОЕ) и штамм F. tularensis А-61 (LD₅₀=5 КОЕ).

Методику заражения и вскрытия на практических занятиях преподаватели демонстрируют обучающимся на вирулентным штамме F. tularensis А-61. При подкожном заражении данным штаммом у погибших лабораторных животных обнаруживают интенсивные патоморфологические изменения подкожной клетчатки и внутренних органов: в месте введения материала - выраженное полнокровие сосудов, множественные кровоизлияния; увеличение и гиперемия регионарных (паховых, подмышечных) лимфатических узлов; в легких - кровоизлияния и участки уплотнения темно-красного цвета (очаги пневмонии); значительное увеличение сердца; селезенка и печень увеличены, дряблой консистенции, полнокровны, с участками некроза и фибринозно-гнойными пленками на капсулах. При посевах на плотные питательные среды из всех внутренних органов и крови животных отмечают рост множества зрелых типичных колоний возбудителя туляремии.

Однако манипуляции при заражении и вскрытии лабораторных животных относят к процедурам с высоким риском инфицирования, что определяет необходимость использования обучающимися для самостоятельной работы вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, который обеспечивает биологическую безопасность обучающимся на практических занятиях, но не позволяет получить выраженной демонстративной патоморфологической картины - выраженной гиперемии сосудов подкожной клетчатки, участков некроза в тканях селезенки и печени.

Использование описанных выше штаммов бактерий позволяет обеспечить в полном объеме реализацию планов практических занятий, обучающимся самостоятельно на авирулентном вакцинном штамме F. tularensis 15 НИИЭГ приобрести навыки работы с возбудителем туляремии и освоить в полном объеме регламентированные методы индикации, идентификации и дифференциации F. tularensis. Кроме того использование авирулентного вакцинного штамма и штаммов F. tularensis, степень патогенности которых находится в пределах показателей вакцинного штамма, позволяет минимизировать вероятность лабораторного инфицирования обучающихся, тем самым обеспечивая биологическую безопасность практических занятий.

Для практических занятий учебного модуля «Микробиология и лабораторная диагностика бруцеллеза» отобраны штаммы, поддерживаемые в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб», ранее не использовавшиеся в наборе в целях обучения:

1. В. abortus 19 ВА - вакцинный штамм, биовар 1, М-8, III группа патогенности. Получен в 1951 г. из Всесоюзного института экспериментальной медицины им. А.М. Горького (ВИЭМ) г. Москва.

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Грамотрицательные неподвижные мелкие бактерии шаровидной, овоидной или палочковидной формы, не образующие капсул и спор; в мазках расположены одиночно, парами или небольшими скоплениями; при культивировании на питательных средах характерен медленный рост в S-форме: колонии на агаре мелкие (0,5-2 мм), выпуклые с гладкой поверхностью и ровным краем, бесцветные, гомогенные; в жидкой питательной среде - гомогенное помутнение.

При исследовании МФА специфическое свечение: 4+. Реакция агглютинации с диагностической бруцеллезной поливалентной сывороткой: 3+. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида В. abortus биовар 1 культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: культивирование первой генерации в атмосфере повышенного содержания СО₂; рост на питательных средах в присутствии фуксина, отсутстие роста в присутствии тионина. Генетическая характеристика вида: ген BRA0420 (-), ген BRA0907 (+).Чувствителен к бактериофагу «Тб».

Особые свойства: суммарный показатель образования сероводорода ≈ 6 мм; гидролиз мочевины (уреазная активность) через 1 час после посева. Вирулентность (ID50): для белых мышей - 1,4×10⁴ м.к., для морских свинок - 4,0×10³ м.к. При моделировании бруцеллеза у лабораторных животных наблюдается рост единичных колоний бруцелл при посеве селезенки и печени на питательные среды.

2. В. abortus С-68 - референтный типовой штамм АТСС 23455, биовар 9, М-87, II группа патогенности. Штамм получен в 1998 г. из Ставропольского НИПЧИ.

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида В. abortus культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими, генетическими (ген BRA0420 (-), ген BRA0907 (+)) признаками вида. Чувствителен к бактериофагу «Тб».

Особые свойства: отсутствие потребности в СО₂ при культивировании первой генерации; рост на питательных средах в присутствии фуксина и тионина; образование сероводорода (+, суммарно 5 мм); гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 1 часа после посева. Вирулентность (ID₅₀): для белых мышей - 3,0×10³ м.к., для морских свинок - 4,0×10³ м.к. При исследовании МФА специфическое свечение: 3+. Реакция агглютинации с диагностической бруцеллезной поливалентной сывороткой: 3+. При моделировании бруцеллеза у лабораторных животных наблюдается множественный рост колоний бруцелл при посеве селезенки, печени и крови на питательные среды.

3. В. melitensis 16 М - референтный типовой штамм АТСС 23456, биовар 1, М-16, II группа патогенности. Получен в 1962 г. из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида В. melitensis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: отсутствие потребности в СО₂ при культивировании первой генерации; мелкие (0,1-0,3 мм) точечные колонии, отсутствие образования сероводорода; гидролиз мочевины (уреазная активность) через 1 час после посева; рост на питательных средах в присутствии фуксина и тионина. Генетическая характеристика вида: ген BRA0420 (+), ген BRA0907 (-). Не чувствителен к бактериофагу «Тб».

Особые свойства: вирулентность (ID₅₀) для белых мышей - 9,7 м.к., для морских свинок - 2,7-10⁶ м.к. При постановке МФА специфическое свечение: 3+. Реакция агглютинации с диагностической бруцеллезной поливалентной сывороткой: 3+.

4. В. suis 1330 - референтный типовой штамм АТСС 23444, биовар 1, М-14, II группа патогенности. Получен в 1962 г. из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида В. suis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: отсутствие потребности в СО₂ при культивировании первой генерации; интенсивная продукция сероводорода (суммарный показатель образования ≈ 14 мм), гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 5 мин после посева; рост на питательных средах в присутствии тионина, отсутствие роста в присутствии фуксина. Генетическая характеристика вида: ген BRA0420 (+), ген BRA0907 (+), ген BMEI1426 (+), BMEII0711 (+), BMEI099 (+). Не чувствителен к бактериофагу «Тб».

Особые свойства: вирулентность (ID₅₀): для белых мышей - 9,1×10⁴ м.к., для морских свинок - 5,9×10⁴ м.к. При постановке МФА специфическое свечение: 4+. Реакция агглютинации с диагностической бруцеллезной поливалентной сывороткой: 4+.

5. В. suis 40 - референтный типовой штамм АТСС 23447, биовар 4, М-33, II группа патогенности. Получен в 1984 г. из Ставропольского НИПЧИ.

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида В. suis культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками [16]. Генетическая характеристика вида: ген BRA0420 (+), ген BRA0907 (+), ген BMEI1426 (+), BMEII0711 (+), BMEI099 (+). Не чувствителен к бактериофагу «Тб».

Особые свойства: отсутствует образование сероводорода; рост на питательных средах в присутствии тионина и фуксина. Вирулентность (ID₅₀): для белых мышей -1,1×10³ м.к., для морских свинок - 1,9×10⁴ м.к. При исследовании МФА специфическое свечение: 3+. Реакция агглютинации с диагностической бруцеллезной поливалентной сывороткой: 3+.

6. Штамм В. ovis 25-90 - М-70, II группа патогенности. Получен в 1994 г. из ВНИИ бруцеллеза и туляремии животных (г. Омск).

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида ovis культурально-морфологическими признаками: при культивировании на питательных средах характерен медленный рост в R-форме: колонии средней (0,6-1,5 мм) величины, мутные, с зернистой или слизистой поверхностью, неровным краем; в жидкой питательной среде - хлопья и осадок на фоне прозрачной среды; гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 7 дней после посева; [27]. Генетические характеристики вида: ген BMEI1426 (+), BMEII0711 (+), BMEI0994 (-). Не чувствителен к бактериофагу «Тб».

7. Штамм В. canis 1066 - М-84, II группа патогенности. Получен в 1994 г. из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г. Москва).

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида canis культурально-морфологическими и генетическими (ген BMEI1426 (-), BMEII0711 (+), BMEI0994 (+)) признаками. Не чувствителен к бактериофагу «Тб».

8. Штамм В. neotomae 5k33 - М-19, II группа патогенности. Получен в 1973 г. из ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (г .Москва).

Обладает типичными для рода Brucella культурально-морфологическими признаками [16]. Генетическая характеристика: специфичный для рода ген bcsp31 (+).

Обладает типичными для вида neotomae культурально-морфологическими и генетическими (ген BMEI1426 (+), BMEII0711 (-), BMEI0994 (+)) признаками. Не чувствителен к бактериофагу «Тб».

Использование набора штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики бруцеллеза иллюстрируется следующими примерами:

Пример 12. Использование штаммов при изучении морфологических и культуральных свойств возбудителей бруцеллеза.

На первом этапе лабораторной диагностики бруцеллеза исследование проводят методами индикации, одним из которых является анализ морфологии микробных клеток. Метод включает приготовление мазков из исследуемого материала и окраску их по методу Грама.

Для изучения морфологии клеток возбудителей бруцеллеза на практических занятиях используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 В А. Использование штамма позволяет обучающимся ознакомиться с морфологическими характеристиками клетки, типичными для всех представителей рода Brucella.

В мазках, окрашенных по Граму, Brucella ssp. имеют вид грамотрицательных мелких шаровидных, овоидных или палочковидных клеток, расположенных одиночно, парами или небольшими скоплениями, не образующих капсул и спор.

Кроме того, важной характеристикой вида бруцелл является оценка культуральных свойств. Характерными признаками роста возбудителей бруцеллеза на питательной среде являются медленный рост в S- или R-формах. Для изучения особенностей роста возбудителей бруцеллеза на практических занятиях используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 ВА, а также штаммы В. melitensis и 16 М В. ovis 25-90.

Для этих целей штаммы В. abortus 19 В А, В. ovis 25-90 и В. melitensis 16 М выращивают 24-48 часов в бруцеллбульоне и на бруцеллагаре рН 6,9 при температуре 37°С, а затем визуально оценивают морфологию роста бактерий.

Использование штамма В. abortus 19 В А позволяет изучить морфологию S-формы роста бруцелл, характеризующуюся формированием на агаре бесцветных, диаметром 0,5-2 мм, гомогенных, выпуклых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем, а в бульоне - гомогенным помутнением.

Использование штамма В. melitensis 16 М позволяет изучить особенности роста наиболее вирулентного для человека вида бруцелл. Колонии В. melitensis 16 М растут в S-форме, но отличаются формированием на агаре очень мелких (диаметром 0,1-0,3 мм) колоний, в 5 и более раз меньше в диаметре колоний В. abortus 19 ВА.

Использование штамма В. ovis 25-90 позволяет изучить морфологию R-формы роста бруцелл, характеризующуюся формированием на агаре мутных колоний с зернистой или слизистой поверхностью, неровным краем, а в бульоне - появление хлопьев и осадка на фоне прозрачной среды.

Пример 13. Использование штаммов при обучении иммунологическим методам индикации бруцелл

Вследствие трудностей, связанных с выделением культуры бруцелл и длительностью культивирования возбудителей, иммунологические методы в диагностике бруцеллеза занимают одно из ведущих мест в комплексе основных методов индикации.

Исследования проводят с помощью таких иммунологических методов как МФА и реакция агглютинации (РА).

Для постановки МФА используют препарат «Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие бруцеллезные сухие».

При подготовке проб для изучения с помощью МФА используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 ВА.

Результаты МФА со штаммом В. abortus 19 ВА оценивают как специфическое свечение с яркостью 4+ креста - сверкающая флуоресценция желтовато-зеленого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастируемая с темным телом клетки. Положителен результат при обнаружении хотя бы единичных клеток, флуоресценция которых оценивается на 4 или 3 креста при просмотре 30 полей.

Для постановки РА используют препарат «Сыворотка диагностическая поливалентная бруцеллезная сухая для реакции агглютинации».

При подготовке проб, применяемых на практических занятиях для освоения РА, используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 ВА и штамм В. suis 1330.

При исследовании с помощью РА на стекле штамма В. suis 1330 получают результат, оцениваемый как 4+- через 2-3 минуты формируются ясно видимые невооруженным глазом крупные хлопья на фоне прозрачной среды. При исследовании штамма В. abortus 19 ВА получают результат, оцениваемый как 3+- через 2-3 минуты формируются ясно видимые невооруженным глазом крупные хлопья на фоне неполностью просветлевшей среды. Оба результата являются положительными и свидетельствуют о принадлежности штаммов к роду Brucella.

Пример 14. Использование штаммов при обучении биологическому методу диагностики бруцеллеза

В схеме лабораторной диагностики бруцеллеза биологический метод является обязательным на этапе индикации с целью накопления бактериальной культуры в органах лабораторных животных и повышения вероятности выделения при посеве на питательные среды. Часто возбудители бруцеллеза можно выделить только с использованием биологического метода.

При заражении вирулентными штаммами бруцелл лабораторные животные заболевают, но не погибают. При вскрытии после эвтаназии отмечают отсутствие каких-либо характерных для бруцеллеза патоморфологических изменений внутренних органов. При посеве фрагментов паренхиматозных органов (печень, селезенка, лимфоузел) и крови на питательные среды выделяют культуру возбудителей бруцеллеза.

При изучении биологического метода в схеме лабораторной диагностики бруцеллеза на практических занятиях используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 ВА (ID₅₀=1,4×10⁴ м.к.) и штамм В. abortus С-68 (ID₅₀=3,0×10³ м.к.).

Методику заражения и вскрытия на практических занятиях преподаватели демонстрируют обучающимся на штамме В. abortus С-68. При подкожном заражении данным штаммом лабораторных белых мышей при посевах на плотные питательные среды крови, фрагментов селезенки и печени наблюдают множественный рост колоний бруцелл.

Однако манипуляции при заражении и вскрытии лабораторных животных относятся к процедурам с высоким риском инфицирования, что определяет необходимость использования обучающимимся для самостоятельной работы авирулентного вакцинного штамма В. abortus 19 ВА, который обладает более низкой вирулентностью, минимизирует риск лабораторного инфицирования, но позволяет получить рост единичных колоний бруцелл только при посеве селезенки и печени на питательные среды.

Пример 15. Использование штаммов при изучении диссоциации бруцелл

Для проведения идентификации и межвидовой дифференциации бруцелл регламентировано использовать культуру, находящуюся в S-форме. Поэтому первым этапом идентификации является оценка диссоциации выделенной культуры - степени перехода из S- в R-форму роста.

Определение степени диссоциации культур проводят с помощью проб с трипафлавином, Уайт-Вильсона и реакции термопреципитации. У диссоциированных культур (вся культура или какая-то часть ее находится в R-форме) отмечают следующие признаки: при постановке пробы с трипафлавином в течение 1-2 минут регистрируют агглютинацию с образованием хорошо выраженных хлопьев; при постановке пробы Уайт-Вильсона диссоциированные колонии окрашиваются кристаллическим фиолетовым от темно-фиолетового до светло-синего цвета; при постановке реакции термопреципитации отмечают агглютинацию клеток бруцелл во взвеси (10⁹ м.к./мл) при нагревании в течение 30 минут при 90°С. Для недиссоциированных культур бруцелл, находящихся в S-форме, при постановке пробы с трипафлавином суспензия клеток представляет гомогенную взвесь; при постановке пробы Уайт-Вильсона колонии остаются неокрашенными; при постановке реакции термопреципитации взвесь клеток бруцелл остается гомогенной.

При изучении диссоциации культур бруцелл используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 ВА и В. ovis 25-90.

Для изучения признаков роста культуры преимущественно в S-форме используют штамм В. abortus 19 ВА, обладающий типичными признаками: проба с трипафлавином (-), Уайт-Вильсона (-) и реакция термоприципитации (-).

Для изучения признаков роста культуры преимущественно в R-форме используют штамм В. ovis 25-90, обладающий типичными признаками: проба с трипафлавином (+), Уайт-Вильсона (+) и реакция термоприципитации (+).

Пример 16. Использование группы штаммов набора при освоении межвидовой дифференциации бруцелл

Межвидовая дифференциация бруцелл регламентирована по следующим признакам:

- потребность в повышенном содержании СО₂ при культивировании первой генерации штамма;

- интенсивность образования сероводорода;

- редуцирующая активность в отношении анилиновых красителей;

- интенсивность уреазной активности штаммов;

- лизис бактериофагом Тб.

При изучении межвидовой дифференциации бруцелл, наиболее патогенных для человека, используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 ВА, В. abortus С-68, В. suis 1330, В. melitensis 16 М.

Для изучения признаков вида В. abortus используют авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 В А биовар 1, обладающий типичными характеристиками: культивирование первой генерации в атмосфере повышенного содержания СО₂ (+), образования сероводорода (+, суммарно 6 мм), рост на среде с тионином (-), с фуксином (+), гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 1 часа после посева, лизис бактериофагом Тб до ДРТ (+).

Для изучения варианта признаков вида В. abortus используют штамм В. abortus С-68, обладающий характеристиками: культивирование первой генерации в атмосфере повышенного содержания СО₂ (-), образования сероводорода (+, суммарно 5 мм), рост на среде с тионином (+), с фуксином (+), гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 1 часа после посева, лизис бактериофагом Тб до ДРТ (+).

Для изучения признаков вида В. suis используют штамм В. suis 1330 биовар 1, обладающий типичными характеристиками: культивирование первой генерации в атмосфере повышенного содержания СО₂ (-), образования сероводорода (+, суммарно 14 мм), рост на среде с тионином (+), с фуксином (-), гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 5 минут после посева, лизис бактериофагом Тб до ДРТ (-).

Для изучения признаков вида В. melitensis используют штамм В. melitensis 16 М, обладающий типичными характеристиками: культивирование первой генерации в атмосфере повышенного содержания СО₂ (-), образования сероводорода (-), рост на среде с тионином (+), с фуксином (+), гидролиз мочевины (уреазная активность) в течение 1 часа после посева, лизис бактериофагом Тб до ДРТ (-).

Пример 16. Использование штаммов при индикации и идентификации возбудителей бруцеллеза методом ПЦР

В схеме лабораторной диагностики бруцеллеза ПЦР используют как на этапе индикации при исследовании биологического материала и объектов окружающей среды, так и при идентификации выделенных культур и межвидовой дифференциации штаммов Brucella ssp.

Для постановки ПЦР используют «Набор реагентов для выявления и дифференциации штаммов возбудителя бруцеллеза методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени (БРУ-ДИФ-РГФ)» с одновременным определением его принадлежности к видам В. abortus, В. melitensis, В. suis, В. canis, В. ovis, В. neotomae методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

Для отнесения выделенной культуры к роду Brucella используют ДНК-мишень - ген bcsp31, а для определения вида бруцелл - гены хромосомной локализации: BRA0420, BRA0907, BMEI1426, BMEII0711, BMEI099.

При освоении метода ПЦР в схеме лабораторной диагностики бруцеллеза на практических занятиях используют штаммы с разным набором видоспецифичных генов патогенности - авирулентный вакцинный штамм В. abortus 19 В А, штаммы, В. melitensis 16 М, В. suis 1330, В. ovis 25-90, В. canis 1066, В. neotomae 5К33с.

Применение штамма В. abortus 19 В А биовар 1 позволяет провести диагностику и по наличию генов bcsp31 (+), BRA0420 (-), BRA0907(+) и отнести возбудитель инфекции к роду Brucella виду abortus.

Применение штамма В. melitensis 16 MA позволяет провести диагностику и по наличию генов bcsp31 (+), BRA0420 (+), BRA0907(-) и отнести возбудитель инфекции к роду Brucella виду melitensis.

Применение штамма В. suis 1330 биовар 1 позволяет провести диагностику и по наличию генов bcsp31 (+), BRA0420 (+), BRA0907(+), BMEI1426(+), BMEII0717(+), BMEI0994 (+) и отнести возбудитель инфекции к роду Brucella виду suis.

Применение штамма В. ovis 25-90 позволяет провести диагностику и по наличию генов bcsp31 (+), BMEI1426(+), BMEII071BMEI0994 (-) и отнести возбудитель инфекции к роду Brucella виду ovis.

Применение штамма В. canis 1066 позволяет провести диагностику и по наличию генов bcsp31 (+), BRA0420 (-), BRA0907(+), BMEI1426(+), BMEII071BMEI099 (+) и отнести возбудитель инфекции к роду Brucella виду abortus.

Применение штамма В. neotomae 5К33с позволяет провести диагностику и по наличию генов bcsp31 (+), ВМЕП426(-), ВМЕП07П(+), BMEI0994 (+) и отнести возбудитель инфекции к роду Brucella виду neotomae.

Использование описанных выше штаммов бактерий позволяет обеспечить в полном объеме реализацию планов практических занятий, обучающимся самостоятельно на авирулентном вакцинном штамме В. abortus 19 ВА приобрести навыки работы с возбудителями бруцеллеза и освоить методы индикации, идентификации и дифференциации Brucella spp. Использование слушателями курсов для самостоятельной работы вакцинного штамма В. abortus 19 ВА, а также авирулентных штаммов В. abortus С-68, В. suis 1330 и В. ovis 25-90, показатель вирулентности которых находится в пределах вакцинного штамма, позволит минимизировать вероятность лабораторного инфицирования, тем самым обеспечивая биологическую безопасность практических занятий.

Таким образом, заявляемый комплект содержат штаммы бактерий, необходимые для всестороннего обучения вопросам микробиологии и лабораторной диагностики сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза.

Использование комплекта штаммов бактерий позволяет обеспечить в полном объеме реализацию планов практических занятий, обучающимся самостоятельно на штаммах авирулентных бактерий приобрести навыки безопасной работы с возбудителями ООИ и освоить регламентированные методы индикации, идентификации и дифференциации В. anthracis, F. tularensis, Brucella spp., а также позволяет снизить риск лабораторного инфицирования слушателей курсов, то есть обеспечить биологическую безопасность процесса обучения.

Список литературы:

1. Иванова А.В., Удовиченко С.К., Шиянова А.Е., Дмитриева Л.Н., Поспелов М.В., Касьян Ж.А., Зимирова А.А. Распространение инфекционных болезней, значимых для санитарной охраны территории Российской Федерации, в Европейском регионе ВОЗ. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 4:16-26. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-4-16-26

2. Пономаренко Д.Г., Русанова Д.В., Хачатурова А.А., Скударева О.Н., Логвиненко О.В., Ракитина Е.Л., Костюченко М.В., Семенко О.В., Малецкая О.В., Куличенко А.Н. Анализ эпидемической и эпизоотической ситуации по бруцеллезу в мире в 2019 г. и прогноз на 2020 г. в Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2020; (2): 48-56. https://doi.org/l0.21055/0370-1069-2020-2-48-56

3. Рязанова А.Г., Скударева О.Н., Герасименко Д.К., Чмеренко Д.К., Семенова О.В., Аксенова Л.Ю., Еременко Е.И., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Печковский Г.А., Куличенко А.Н. Обзор эпизоотолого-эпидемиологической ситуации по сибирской язве в 2020 г. в мире и прогноз на 2021 г. в Российской Федерации. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 1:81-86. DOI: 10.21055/0370-1069-2021 -1-81-86

4. Кудрявцева Т.Ю., Попов В.П., Мокриевич А.Н., Пакскина Н.Д., Холин А.В., Мазепа А.В., Куликалова Е.С., Косилко С.А., Бирковская Ю.А., Транквилевский Д.В., Храмов М.В., Дятлов И.А. Эпидемическая активность природных очагов туляремии на территории Российской Федерации в 2018 г. и прогноз ситуации на 2019 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; 1:32-41. DOI: 10.21055/0370-1069-2019-1-32-41

5. Hull N.C., Schumaker В.А. Comparisons of brucellosis between human and veterinary medicine. Infect. Ecol. Epidemiol. 2018; 8(1):1500846. DOI: 10.1080/20008686.2018.1500846

6. Cross A.R., Baldwin V.M., Roy S., Essex-Lopresti A.E., Prior J.L., Harmer N.J. Zoonoses under our noses. Microbes Infect. 2019; 21(1): 10-9. DOI:10.1016/j.micinf.2018.06.001

7. Эпизоотическая ситуация в РФ. Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору. [Электронный ресурс]. URL: https://www.fsvps.ru/fsvps/iac/rf/reports.html (дата обращения 12.06.2022)

8. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней». Приложение 11. Утв. Главным государственным санитарным врачом РФ, 2021

9. Об утверждении перечня социально значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих: постановление Правительства РФ от 01.12.2004 №715 (изм. 31.01.2021) https://base.garant.ru/12137881/ (дата обращения 27.06.2022)

Ю.Воробьев А.А., Боев Б.В., Бондаренко В.М., Гинцбург А.Л. Проблема биотерроризма в современных условиях [Текст] // ЖМЭИ.- 2002.-№3.- С.3-12.

11. Бактериология. Основы безопасной работы с патогенными биологическими агентами I-II групп: программа профессиональной переподготовки. - Саратов, 2021

12. Бактериология, инфекционные болезни, требующие проведения мероприятий по санитарной охране территории Российской Федерации: программа повышения квалификации - Саратов, 2021

13. Эпидемиологический надзор за сибирской язвой: программа повышения квалификации - Саратов, 2018

14. Эпидемиологический надзор за туляремией: программа повышения квалификации - Саратов, 2018

15. Эпидемиологический надзор за бруцеллезом: программа повышения квалификации - Саратов, 2018

16. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: практическое руководство / Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад. РАМН В.В. Кутырева. - Изд. 2-е, переработан, и дополн. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с.

17. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. МУК 4.2.2413-08

18. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. МУК 4.2.2941-11

19. Эпидемиологический надзор за туляремией. МУ 3.1.2007-05

20. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. МУК 4.2.2939-11

21. Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза: методические указания. МУК 3.1.7.3402-16

22. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней: методические указания. МУК 4.2.3010-12

23. Основы государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу: указ Президента РФ от 11.03.2019 N 97 http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_319787/8fc0c0dcbb 1740fb 12b73d2 b6c91f06f7351a5d6/ (дата обращения 26.06.2022)

24. Фармакопейная статья ФС 42 "Вакцина сибиреязвенная комбинированная" / ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства" 24.09.2013 https://base.garant.ru/70457452/236230d7c8d87d8ae97576229da0a012/ (дата обращения 26.06.2022)

25. Фармакопейная статья ФС 42 "Вакцина туляремийная живая" / ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства" 24.09.2013 https://base.garant.ru/70457452/236230d7c8d87d8ae97576229da0a012/ (дата обращения 27.06.2022)

26. Фармакопейная статья ФС 42 "Вакцина бруцеллезная живая" / ОФС "Иммунобиологические лекарственные средства" 24.09.2013 https://base.garant.ru/70457452/236230d7c8d87d8ae97576229da0a012/ (дата обращения 26.06.2022)

27. Бруцеллез. Современное состояние проблемы / под ред. Г.Г. Онищенко, А.Н. Куличенко. - Ставрополь: ООО «Губерния», 2019. - 336 с.

28. Пат. №2743454 от 18.02.2021 г. Набор штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики холеры / Е.В. Растунцева, Ю.А. Попов, Л.А. Тихомирова, Т.В. Валова, И.В. Грачева, Н.С. Червякова, Н.А. Осина. Заявитель и правообладатель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - 2021. - Бюл. №5.

29. Пат. №2642322 от 24.01.2018 г. Набор штаммов бактерий, используемый для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики чумы / Е.В. Сазанова, Т.А. Малюкова, Ю.А. Попов, В.Е. Куклев, А.Н. Малахаева, В.В. Кутырев. Заявитель и правообладатель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - 2018. - Бюл. №3.

30. Методические указания «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». МУ 1.3.2569-09.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предложен набор штаммов бактерий - возбудителей особо опасных инфекций для обучения вопросам микробиологии и методам лабораторной диагностики туляремии - Francisella tularensis А-61 подвида mediasiatica и авирулентные штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ подвида holarctica, F. tularensis Schu 7 подвида tularensis, F. tularensis Utah 112 (ATCC 15482) подвида novicida, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора. Изобретение позволяет увеличить эффективность обучения специалистов при освоении многообразия биологических свойств возбудителей туляремии и методов индикации, идентификации и дифференциации F. Tularensis, а также повысить биологическую безопасность процесса обучения, снизить риски инфицирования обучающихся при освоении методов лабораторной диагностики ООИ на практических занятиях. 1 табл., 16 пр.

Набор штаммов бактерий для обучения вопросам микробиологии и лабораторной диагностики особо опасных инфекций, включающий штаммы F. tularensis А-61 подвида mediasiatica и авирулентные штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ подвида holarctica, F. tularensis Schu 7 подвида tularensis, F. tularensis Utah 112 (ATCC 15482) подвида novicida для обучения микробиологии и лабораторной диагностике туляремии, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий ФКУН Российский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора.