ПЛТИТИО- 1Л 1« TtXUtiMLCKAa ' БИБЛИОТЕКА Советский патент 1969 года по МПК A61K39/00 

Известен способ изготовления вакцины против транспортной лихорадки крупного рогатого ската из культур возбудителей Pasteurella hemolitica и Р. mHltocida :и культуры миксовируса параинфлюэнцы-3 путем смешения их с дополнителем, инактивации, концентрирования и консервировалия полученной композиции.

Для получения вакцины, создающей более надежный «ммунитет против транспортной лихорадки, предлагается новый способ. Культуры возбудителей Pasteurella hemolitica и Р. multocida после их выращивания на питательных средах смешивают раздельно с культурой миксовируса параинфлюэнцы-3, выращенного в культуре клеток почечной ткани, а затем объединяют полученные вирусно-бактериальные смеси между собой и вводят дополнитель, содержащий иолы алюминия, с последующей или предварительной инактивацией соотВетствующим инактивирующим агентом, преимущественно формальдегидом, и нейтрализацией его .избытка соответствующем абсорбентом, например бисульфитом щелочного металла, и консервируют путем добавления парэнтерально приемлемого антисептика, например симерозола. При смешивании культур бактерий с культурой вируса плотность отдельных вирусно-бактериальных смесей выравнивают до 5-10 ед. но методу Мс Farland

(а), а после смешения между собой этих отдельных смесей устанавливают рП полученной смеси до 6,4-6,8. Полученную смесь культур возбудителей смешивают с дополлителем,

содержащим ионы алюминия, например, в гидроокисном геле, концентрация которых эквнвалентна концентрации ионов алюминия в 10-50 мл водного раствора, содержащего 1,3% AljOs. После выращивания миксовируса

до момента проявления цитопатического эффекта у 50-70% клеток, жидкую тканевую культуру, содержащую вирус, неред смешиванием с бактериальными культурами охлаждают.

Предлагаемый способ позволяет получать удовлетворительно инактивированные вирусно-бактериальные композиции, способные создавать антигены, противодействующие развитию заболевания в организме животных.

Миксовирус нараинфлюэнцы-3 выращиваюг известным методом на культуре монослоя ткани клеток ночки эмбриональной или взрослой особи быка, кролика или обезьяны до момента проявления ЦПЭ у 50-70% клеток. Бактерии выращивают раздельно на агаре или жидкости средней оболочки стенки кровеносного сосуда. При желании вирулентность бактерий можно увеличить путем пассажироваиия их на аллантожной ткани куриного эмбривают отдельные бактериальные культуры, отделенные от среды выращивания, с жидкой тканевой вируссодержащей культурой для получения отдельных бактериально-вирусных смесей. Эти смеси доводят затем до плотности 5-10 ед., предпочтительно 7--9 ед. по методу Мс Farland (а), и, соединяя их между собой, получают комбинированную бактериально-вирусную смесь, рН этой смеси устанавливают 6,4-6,8, а затем смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия в гидроокисном геле, дисперсии окиси алюминия или фосфате алюминия, причем концентрация ионов алюминия в этом дополнителе эквивалентна концентрации ионов алюминия в 10-50 мл водного раствора 1,3%-ного AUOj.

Полученную таким образом композицию инактивируют формальдегидом, р-нропилактоном, гидроксиламином, фенолом или хлороформом, предпочтительно, формальдегидом, излишек которого нейтрализуют подходяшим раствором сульфитной соли. Пробы инактивированной композиции отбирают для проведения вирусно-антигенных исследований, а всю массу продукта консер-вируют парэнтерально приемлемым антисептиком в бактериостатических и фунгистатических количествах. Полученную смесь можно сконцентрировать путем сливания верхлих слоев жидкости или использовать без концентрации.

Культуры миксовируса параинфлюэнцы-3 и пастерелл могут быть инактивированы до их смешивания. Смешивать их между собой можно до или после смешивания с дополнителем. Предпочтительно вначале смешивать вирусосодержащуЮ культуру с дополнителем, а затем - с инактивирО;ванНыми культурами бактерий, что позволяет исследовать отдельные вирусно-бактериальные смеси с целью определения оптимального соотношения культуры вируса и бактерий.

Культуры вируса, используемого для изготовления вакцин, должны вызывать ЦПЭ в почечных тканевых культурах через 2-5 дней, нейтрализоваться антисывороткой параинфлюэнцы-3, вызывать агглютинацию эритроцитов морской свинки и гемадсорбцию их на зараженных культурах. Титр агглютинации эритроцитов должен быть не ниже 1/40, а зараженность клеток тканевых культур порядка 103 и выше в 1 мл. Вирус выращивают па лакальбуминово-гидролизованной среде Эрла с добавлением или без добавления бычьей сыворотки. Кроме того, в среду можно добавить антибиотики (пенициллин или стрептомицин). Расплодочные культуры, лиофил-изированные дистиллированной водой и подходящим стабилизатором, стерильно высевают иа среду выращивания в количестве 4-6% ее объема и выращивают до титра Юз, предпочтительно 10« в 1 мл, при температуре 35-38°С 2-7 дней. Насыщенные вирусом жидкости тканевых культур замораживают для сохранения вируса или сразу (без замораживания) смешивают с бактериосодержащпми средами.

Бактерии выращивают на пригодных для этого средах известными методами. Среды для накопления засевают расплодками в количестве 1-5% от объема среды выращиваПИЯ и культивируют при 35-38°С до бактериального титра 107, предпочтительно Ю жизнеспособных клеток на 1 мл.

Отдельные культуры бактерий можно смешивать с жидкостью, содержащей пликсовирус, и затем - с инактивирующим агентом (формальдегидом), или все три культуры могут быть раздельно инактивированы добавлением к ним необходимого количества раствора формальдегида. Больщое значение имеет

соотношение смещиваемых жидкостей, т. к. получаемая смесь должна обладать выше, упомянутой плотностью по Мс Farland (у). Для регулирования плотности можно также использовать формальдегид. По объему культуры бактерий не должны превышать 25% от полученной смеси.

После приведения отдельных смесей бактерий и вируса к желаемой плотности и получения смеси отдельных .вирусно-бактериальных смесей рН комбинированной смеси регулируют добавлением кислоты, например 0,1 н. ПС1, или щелочи, например ЫаОП, до 6,,8. Затем к ней добавляют компонент, содержащий трехвалентные ионы алюминия, например водный раствор подходящей алюминиевой соли или адсорбирующие твердые или водные гели, содерлсащие ионы алюминия. Папример, можно использовать водную гидроокись алюминия, гель окиси алюминия или их водную

дисперсию, а также соли алюминия и смешанные соли алюминия и различных кислот. Наиболее приемлемы водный гель гидроокиси алюминия, .водная суспензия алюминия и гидрат фосфата алюминия которые для большей

активности следует брать с избытком (с осадком в жидкой фазе). Эти вещества можно получить реакцией обмена солей в водных растворах или суспензиях с последующим фильтрованием и промывкой и предварительной

стерилизацией исходных реактивов.

Компонент, содержащий ионы алюминия, смешивают с вирусно-бактериальной смесью или инактивированной культурой вируса в виде водных растворов или абсорбированных

твердых дисперсий, имеющих концентрацию алюминиевой смеси от 0,5 до 5 вес. % (предпочтительнее 1-2 вес. %). Причем, добавляемое количество должно быть эквивалентно 10-50 мл (предпочтительнее 10-30 мл) водного 1%-ного раствора окиси алюминия (АЬОз) на 100 мл культуры вирусно-бактериальной смеси или инактивированной культуры вируса. Смесь взбалтывают или перемешивают для

получения однородной массы 15 мин. Для инактивации вируса и бактерий добавляют формальдегид в количестве, обеспечивающем ипактивацию, 0,075-0,125 вес. %, но не влияющем на ослабление антигенности получаезовать в любой форме, обеспечивающей активность альдегида при контакте с вирусом или бактер.иями, например, триоксиметилен, твердый полиформальдегид или продукты конденсации формальдегида, которые выделяют формальдегид в водной среде. Формальдегидная композиция не должна содержать вещества, которые могли бы повлиять на состав вакцины.

Инактивация вируса и бактерий должна проходить iB течение б час. Однако желательно выдерживать обработанные формальдегидом культуры около 24 час, но не более четырех суток при комнатной температуре. После этого Смесь концентрируют, если это необходимо, отделяя часть жидкости. Избыток формальдегида нейтрализуют подходящим абсорбентом, например 10-35%-ным стериальным раствором бисульфита натрия. Если все три культуры Инактивируют отдельно, избыток формальдегида можно нейтрализовать бисульфитом натрия до смешивания вирусный композиции с компонентом, содержащим ионы алюминия. Образцы окончательного продукта, отбирают для исследований по соответствующим стандартам, (определение бактериологической стерильности и безопасности). После проверки смесь консервируют подходящим парэнтерально приемлемым антисептиком, например хлороформом, фенолом или симерозолом, предпочтительно последним, в концентрации около 0,4-0,6 мл 10%-ного раствора на 1 л основного продукта. Готовую вакцину сразу расфасовывают или хранят в холодильнике для накопления.

Проверяют инактивацию вируса путем прививки шести пробирок с монослоями культуры бычьей почечной ткани 0,2 мл вакцины разбавленной 1 : 30, взятой из общего объема до консервации антисептиком, с последующим 7-9-д.невным наблюдением. При отсутствии цитопатического эффекта за этот срок вирус должен рассматриваться инактивированным.

Активность вакцины определяют несколькими методами. По одному из них (метод гемагглютинационного замедления активности) отбирают шесть телят трех - шестимесячного возраста, которые имеют титры замедления активности кровяной сыворотки ниже 1 : 20. Трем из них прививают вакцину путем внутримышечной инъекции дозы 10 см с интервалами между инъекциями в 2-3 недели.

Шесть телят содержат вместе. Через 2-3 недели после второй инъекции нроводят сравнение титров замедления активности, которое должно показать повышение титра сыворотки до 1 : 80 и выше у вакцинированных телят при отсутствии значительного повышения в контроле.

Защитные свойства вакцины можно определить также путем сравнения реакции организмов вакцинированных и невакцинированных телят яа воздействие комбинации миксовируса параинфлюэ,нцы-3 и культур бактерий при введении их аэрозольным путем или внутрь

дыхательного тракта, или другим подходящим способом. При этом у вакцинированных телят не исключается проявление симптомов транспортной лихорадки, таких как повышение температуры, кашель, раздражение слизистых носовой полости. Такие симптомы наблюдаются и у контрольной группы.

Антигенные свойства вакцины могут быть установлены путем двухкратного введения ее белым мышам весом 15-20 г в дозах по 0,2 мл подкожно с интервалом в 10-14 дней и последующим введением десятикратно разбавленного вирулентного бульона Р. multocida в течение 7-14 дней после второй инъекции. Антигенность вакцины считается удовлетворительной, если смертность у вакцинированных мышей по крайней мере в два раза ниже, чем у контрольных, при расчете LDjo по методу Reed (а) и mucnch (а).

Вакцину, полученную согласно описанному способу, рекомендуется применять в дозах 2-15 см при внутримышечном или подкожном введении. Рекомендуется вводить также две дозы по 10 см с интервалом между введениями в 1-4 недели.

Вакцину можно объединить с антигенами, вызывающими иммунизацию крупного рогатого скота против других различных заболеваний, .например, вызываемых возбудителями Brucella sp., Clostridium sp., вирус бычьей диареи (BVDV), бычьей инфекционной rinotracheitis (IBR) и им подобных. Пример. Изготовление вакцины. Грипсинизированные клетки культуры ткани эмбриональной бычьей почки (ВКТС), извлеченные из корковых участков почки, выращивают в пригодной для роста ВКТС жидкости и при температуре 35-37°С до слияния ВКТС. Затем отделяют верхний слой питательной жидкости и заражают клеточную культуру вирусом параинфлюэнцы-3 (штам.м SF-4) путем внесения 1 мл вируссодержащей жидкости на 99 мл культуры. Вирус культивируют на ВКТС при температуре 35-37°С до проявления ЦПЭ у 65-100% клеток, который наступает обычно через 48-96 час. Вируссодержащую жидкость из нескольких сосудов объединяют и после взятия проб для определения НА титра, вирусного титрования и определения плотности массу живой ВКТС, содержащую вирус, инактивируют раствором формальдегида (формалином) (1 ч. формальдегида на 1000 ч. вирусной суспензии), который предварительно разбавляют до 10%-ной концентрации средой, содержащей ВКТС. Инактивацию вируса сопровождают энергичным перемешиванием в течение 15 мин.

Питательная среда для ВКТС представляет

собой с.месь 24 г соли фенолсульфанилфталеина натрия, 8,160 кг хлористого натрия, 480 г

хлористого калия, 246 г сульфата магния,

172,8 г одноосновного фосфата натрия, 1,2 кг

сульфата стрептомицина и воды, добавленной до 1200 л. Смесь перемешивают 10 мин и стерилизуют при 121°С (250°F) в. течение 4 час, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 24 л бычьей сыворотки.

Питательная среда для выращивания вируса на ВКТС содержит те же компоненты за исключением феволсульфонилфталеина натрия и бычьей сыворотки. Кроме того, она содержит 2,664 кг бикарбоната натрия вместо 672 г.

Расплодочную культуру Р. hemolitica, выращенную на тринсинозно-теаминиро ванном агаре, выдерживают 18-36 час при температуре 37°С и впоследствии используют для засева трипсинозно-тиаминированного бульона. Возбудитель культивируют 6-18 час при 35°С в барабанах или бутылях, встряхиваемых в период выращивания, а затем сливают лсидкие культуры в стерильные контейнеры. Среду для выращивания засевают 3 об. % расилодочной культуры.

Плотность полученных культур при фотометрическом определении равна 7-8 ед по щкале Мс Farland (а).

Инактивацию культуры Р. hemolitica проводят путем обработки раствором формальдегида в течение 48-72 час при температуре 35°С. Инактивированная культура сохраняется при 5°С до момента использования.

Р. hemolitica выращивают на среде, состоящей из 3,5 кг порошкообразного протеина марки «Nf-case и витаминизированной композиции, полученной путем вываривания казеина, 1,8 кг дрожжевого экстракта, 1,2 кг триптона, 120 г сульфата магния, 324 г одноосновного фосфата калия, 912 г двухосновного фосфата натрия, 960 г глюкозы на 90 л воды, подогретой до температуры 45°С, к которой добавляют дрожжевой автолизат. рН среды устанавливают до 7,2-7,3 добавлением 1 ,н. раствора гидроокиси натрия, а затем обпдий объем доводят до 120 л дистиллированной водой.

Культуры Р. multocida получают так же, как и культуры Р. hemolitica, однако среда для выращивания содержит 480 г сахарозы вместо глюкозы. Перед инактивацией формальдегидом проверяют плотность культур. Перед смешиванием бактериальных и вирусных культур для определения их необходимых количеств также проверяют их плотность.

Вирусную культуру перед смешиванием с бактерийными разбавляют, добавляя 360 мл 1,30%-ной стерилизованной суспензии окиси алюминия на каждый литр культуры с последующим перемешиванием в течение 15 мин. Затем ее оставляют при 30°С на 24 час, после чего верхний слой жидкости сливают, чтобы отделить объем, эквивалентный общему объему разбавленных бактериальных культур плюс 10-30% от общего объема вирусной культуры и суспензии окиси алюминия. Избыток формальдегида, используемого для инактивации смеси культур, нейтрализуют 35%ным раствором бисульфита натрия.

Консервируют смесь путем добавления симерозола (Merthiolate trade mark) в количестве 0,5 мл на 1 л вакцины при помещиваеии.

После отбора проб для определения стерильности, антигенных свойств и степени инактивации вируса вакцина хранится при температуре 5°С.

Суспензию окиси алюминия готовят путем разбавления продажного геля окиси алюминия дистиллированной водой, свободной от пирогенов, а полученную суспензию пропускают через мельницу (Eppenbach (а) для получения геля, который затем стерилизуют. Концентрацию геля окиси рассчитывают таким образом, чтобы содержание окиси алюминия составляло 1,3|вес. %.

Полученную таким образом вакцину испытывают на телятах и морских свинках. Проверка подтверждает безвредность и эффективность вакцины.

Предмет изобретения

1. Способ изготовления вакцины против транспортной лихорадки крупного рогатого скота из культур возбудителей Pasteurella hemolitica и Р. multocida и культуры миксовируса параинфлюэнцы-3 путем смещения их с дополнителем, инактивации, концентрирования и консервирования полученной композиции, отличающийся тем, что, с целью обеспечения свойств вакцины, создающих надежный иммунитет против транспортной лихорадки, культуры возбудителей Pasteurella hemolitica и Р. multocida носле их выращивания на питательных средах смещивают раздельно с культурой М1иксови|руса параинфлюэнцы-3, выращенного в культуре клеток почечной ткани, а затем объединяют полученные вирусно-бактериальные смеси между собой и вводят дополнитель, содержащий ионы алюминия, с последующ,сй или предварительной инактивацией соответствующим 1инактивирующим агентом, преимущественно формальдегидом, и нейтрализацией его избытка соответствующим абсорбентом, например бисульфитом щелочного металла, и консервируют путем добавления парэнтерально приемлемого антисептика, например симерозола.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что при смешивании культур бактерий с культурой 1вируса плотность отдельных вирусно-бактериальных смесей выравнивают до 5-10 ед. по методу Мс Farland (а), а после смешения между собой этих отдельных смесей устанавливают рН нолученной смеси до 6,4-6,8.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что полученную смесь культур возбудителей смешивают с дополнителем, содержащим ионы алюминия, например, в гидроо кисном геле, концентрация которых эквивалентна концентрации ионов алюминия в 10-50 мл водного раствора, содержащего 1,3% . 9 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после выращиваиия миксовируса до момента проявления цитопатического эффекта у 10 50-70% клеток жидкую тканевую культуру, содержащую вирус, охлаждают перед смешиванием ее с бактериальными культурами.